石紅妍，鄭煦暘，張 穎

病毒性出血熱(viral hemorrhagic fevers，VHFs)是一類以發(fā)熱、出血、凝血功能障礙、低血壓休克等為特征的急性傳染病。可引起人類 VHFs 的病毒包括沙粒病毒科病毒(如拉沙病毒)、絲狀病毒科病毒[如埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)和馬爾堡病毒]、布尼亞病毒目病毒[如漢坦病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus，SFTSV)]、黃病毒科病毒[黃熱病毒和登革病毒(Dengue virus，DENV)]，披膜病毒科病毒[如基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)]等。近年來，由于全球氣候變暖、貿易往來增強、人口流動性增加等因素，導致上述病毒流行地域擴大、患病人群增加，嚴重威脅全球公共衛(wèi)生安全。

病毒入侵時，固有免疫系統反應迅速，并在激活適應性免疫系統中發(fā)揮關鍵作用。模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)是執(zhí)行固有免疫功能的重要分子，可分為膜結合型和細胞質結合型，前者包括Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)和C型凝集素受體，后者包括維甲酸誘導基因1樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)、核苷酸寡聚結構域樣受體(nucleotide oligomerization domain-like receptors，NLRs)和環(huán)狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)等。在病毒感染過程中，單核巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)和自然殺傷細胞等固有免疫細胞以及其他組織細胞(如上皮細胞)表達的PRRs均能識別病毒具有的病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)(如病毒核酸、蛋白等)，激活多條免疫信號通路，誘導促炎細胞因子和干擾素(Interferon，IFN)的產生，從而引發(fā)抗病毒免疫反應[1]。因此，模式識別受體作為固有免疫反應的起始環(huán)節(jié)，在抗VHFs免疫反應中必將發(fā)揮重要作用。同時，某些病毒蛋白與宿主固有免疫分子相互作用，影響宿主的免疫功能，并與病毒免疫逃逸有關。以下將以受體類型為序，介紹其在VHFs中的最新研究進展。

1 TLRs

TLRs是一類膜蛋白，其特征是胞外區(qū)含有不同數量的富含亮氨酸重復序列，并由胞內結構域發(fā)揮信號轉導功能。TLRs是重要的PRRs，可識別表達于病原微生物的脂磷壁酸、雙鏈RNA、脂多糖、鞭毛蛋白、非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸基序等，通過髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)等信號分子啟動胞內信號轉導通路，激活相關炎性細胞因子和IFN-I 的基因表達，誘導有效的免疫反應。TLRs可分為幾個亞家族，每個亞家族都識別相關的PAMPs。

1.1 TLRs在登革病毒感染中的作用 George等[2]在小鼠模型研究發(fā)現急性DENV感染可通過TLR2/MyD88途徑誘導CD4+Foxp3+Treg增殖。Lai等[3]研究發(fā)現DENV感染DC后，線粒體DNA釋放到胞漿中，導致TLR9激活及其下游的MAPK p38和NF-κB信號轉導，可能促進DC遷移和IFN的產生，從而限制病毒的復制。Chao[4]、Quirino-Teixeira等[5]已報道DENV非結構蛋白1(nonstructural protein1，NS1)可通過TLR4-MyD88途徑誘導血小板活化，這可能是DENV感染期間血小板減少和出血的原因之一。Martinez-Moreno等[6]發(fā)現健康受試者連續(xù)10 d口服維生素D(4 000 IU/d)后，使用DENV-2刺激單核細胞來源的樹突狀細胞(monocyte-derived DCs，MDDCs)，結果MDDCs上TLR3、TLR7和TLR9的表達減少，白細胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)和白細胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)水平下降，白細胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)表達增加，MDDCs對DENV-2感染的敏感性降低。Parthasarathy等[7]對DENV感染的角膜中TLR表達的分析顯示，感染后TLR4、TLR7、TLR9和TLR10上調，可能導致角膜中促炎反應加劇。在最近一項關于DENV和CHIKV混合感染的研究中，Sengupta等[8]發(fā)現TLR7、TLR8受體基因多態(tài)性與機體對DENV的易感性有關。

1.2 TLRs在漢坦病毒感染中的作用 Zhang等[9]研究發(fā)現，漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)感染人臍靜脈內皮細胞可激活TLR3、RIG-I和MDA5信號通路，并通過下游NF-κB和干擾素調節(jié)因子-7(Interferon regulating factor-7, IRF-7)直接與CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)的啟動子結合，導致CXCL10表達增加，并且CXCL10的升高與腎綜合征出血熱的嚴重程度呈正相關。Jiang等[10]研究發(fā)現，HTNV包膜糖蛋白(Gn和/或Gc)可能是激活TLR4的成分。HTNV 感染EVC304細胞后，TLR4 轉錄水平上調，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、IFN-β 分泌增多。其機制是 TLR4 通過 MyD88 非依賴性信號轉導通路介導轉錄因子NF-κB和干擾素調節(jié)因子-3(Interferon regulating factor-3, IRF-3)的細胞核移位，誘導上述細胞因子的表達。

1.3 TLRs在其他出血熱病毒感染中的作用 Ayithan等[11]研究發(fā)現埃博拉病毒樣顆粒(Ebola virus-like particles，eVLP)通過TLR3和TLR4途徑的MyD88和含Toll樣/白細胞介素-1受體(TIR)結構域的β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF)兩條信號通路來觸發(fā)宿主免疫反應，誘導一系列有效的抗病毒干擾素刺激基因(Interferon stimulated gene，ISG)和IFN產生。Lai等[12]研究發(fā)現高純度的重組EBOV囊膜蛋白GP能有效地被巨噬細胞內化，通過TLR4途徑誘導IL-6，白細胞介素-2，白細胞介素-5，白細胞介素-4, 單核細胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)，TNF-α，白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，IFN-γ，IL-12等細胞因子的產生，同時促進免疫細胞向引流淋巴結的遷移，并可能促進體內CD4+T細胞的激活和增殖。Li等[13]發(fā)現SFTSV感染通過TLR8-MyD88軸觸發(fā)NF-κB通路。Song等[14]通過對70例急性SFTSV感染者血清動態(tài)變化綜合分析得出，單核細胞與髓系樹突狀細胞TLR3表達的抑制與疾病嚴重程度密切相關?；仡櫺匝芯堪l(fā)現，TLR7、8、9和10的基因多態(tài)性與土耳其CCHF患者的病情嚴重程度和預后相關[15-18]。

2 RLRs

RLRs是一類重要的模式識別受體，介導IFN-I和其他基因的轉錄，激活抗病毒固有免疫反應。近期研究表明，病毒和宿主來源的RNA都可以激活RLRs，引起有效的抗病毒反應，但如果RLRs活性不受控制，將導致免疫病理損傷。在識別病毒RNA序列后，RLRs類模式識別受體RIG-I和MDA5 N端半胱氨酸天冬氨酸酶激活招募結構域與線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)相互作用，激活IRF3和IRF7，進而與NF-κB一起，誘導IFN-I和促炎細胞因子的產生。

2.1 RLRs在登革病毒感染中的作用 SIRTs是一類脫乙酰酶家族蛋白，通過調節(jié)免疫相關基因轉錄，在控制炎癥中發(fā)揮重要作用。Li等[19]在HEK293T細胞進行SIRT6基因干擾和過表達，結果發(fā)現SIRT6通過RLR和TLR3信號通路負向調節(jié)DENV誘導的炎癥反應，其機制是SIRT6核心區(qū)與NF-κB p65的DNA結合域相互作用，與p65競爭占據IL-6啟動子。Kamaladasa等[20]將既往嚴重登革熱(severe dengue，SD)或既往非嚴重登革熱(non-severe dengue，NSD)的健康人的單核細胞與自體血清孵育后，感染全部4種DENV血清型。36 h后結果顯示，與感染非免疫DENV血清型的NSD患者相比，經歷過SD的個體顯示RIG-I、IFN-β1和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein3，NLRP3)基因顯著上調。

2.2 RLRs在漢坦病毒及其他出血熱病毒感染中的作用 Ma等[21]研究表明HTNV感染通過RIG-I-IRF7途徑激活了長鏈非編碼RNA核旁斑組裝轉錄物1(lncRNA NEAT1)的轉錄，而NEAT1通過解除富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子蛋白的轉錄抑制作用促進了RIG-I和DExD/H盒解螺旋酶60的表達。Kell等[22]研究發(fā)現紫外線滅活病毒在體外未能誘導ISG表達，而單獨的HTNV核酸片段(S、M和L)的體外轉錄 RNA在轉染細胞時可激活抗病毒轉錄反應。因此，病毒基因轉錄或復制過程中未被包被的RNA可能作為RLRs識別的PAMPs，在抗HTNV固有免疫過程中發(fā)揮作用。He等[23]研究發(fā)現EBOV的病毒蛋白24(viral protein24, VP24)能有效地抑制依賴RIG-I和MDA5的I型和III型IFN啟動子的激活。Min等[24]研究表明SFTSV可以通過RLR-MAVS信號途徑(尤其是RIG-I-MAVS)感知病毒感染產生的PAMPs(主要是5’-三磷酸化的RNA)，誘導I型IFN、ISG和炎癥細胞因子的表達，引起免疫和炎癥反應，限制病毒復制。然而，在RIG-I激活階段，RLR介導的抗病毒信號可以被SFTSV的NSs所拮抗。

3 NLRs

NLRs參與炎癥小體蛋白質復合體的組裝，是機體固有免疫反應的重要組成部分。NLRs由保守的NAIP、CIITA、HET-E、NACHT和多達3個其他特征結構域組成(包括LRR、CARD、PYD或BIR結構域)。目前已在人類發(fā)現了23個NLR基因。部分NLRs(包括NLRP1、NLRP3、NLRC4以及AIM2)通常介導含胱天蛋白酶-1前體(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase 1，pro-caspase-1)的激活而協助清除病原體。其中NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白以及pro-caspase-1組成。該炎癥小體激活后進行組裝，促進pro-caspase-1的自我裂解，產生活性亞基p20，引起IL-1β和IL-18的成熟和分泌。

3.1 NLRs在登革病毒感染中的作用 Pan等[25-26]發(fā)現DENV感染促進IL-1β釋放，導致小鼠組織血管內皮通透性增加和血管滲漏，其機制為DENV M蛋白與NLRP3相互作用，促進NLRP3炎癥小體的組裝和激活，從而誘導促炎細胞因子的釋放。Shrivastava等[27]發(fā)現DENV-2感染誘導血管內皮細胞HMEC-1中NLRP3炎癥小體的激活，他們還在HMEC-1中過表達DENV的NS2A、NS2B蛋白，發(fā)現其可促進NLRP3炎癥體復合體的組裝，并通過鈣動員或破壞線粒體電位和誘導活性氧的產生而導致caspase-1激活和IL-1β的分泌。Khan等[28]將純化的DENV-2包膜蛋白結構域III(envelope protein III region，EIII)與分化的THP-1細胞共培養(yǎng)，檢測到上清液和細胞中IL-1β水平增加。其機制為NLRP3炎癥小體的激活和NF-κB的核轉位。Lien等研究發(fā)現：1)DENV和EIII在體外誘導內皮細胞焦亡，NLRP3炎癥小體抑制劑處理后減輕。與野生型小鼠相比，順序注射EIII和DENV的NS1自身抗體的NLRP3炎癥小體級缺陷小鼠的病理生理變化明顯減輕[29]。 2)DENV和EIII作用于小鼠血小板后，可誘導NLRP3依賴的血小板細胞死亡和血小板減少[30]。3)DENV的EIII可在體內外誘導NLRP3依賴的中性粒細胞外誘捕網形成，促進炎癥反應[31]。

3.2 NLRs在漢坦病毒及其他出血熱病毒感染中的作用 Ye等[32]研究表明漢坦病毒可誘導THP-1細胞中NLRP3型炎癥小體的形成，這可能是腎綜合征出血熱患者IL-1β水平升高的原因之一。Halfmann等[33]研究發(fā)現EBOV感染導致NLRP3炎癥小體的激活，隨后分泌IL-1β和IL-18。這一過程依賴于NLRP3炎癥小體復合體的一個組成部分caspase-1，但不依賴于病毒復制。Li等[13]研究發(fā)現SFTSV感染誘導依賴BAK/BAX的線粒體DNA釋放觸發(fā)NLRP3炎癥小體激活，發(fā)熱伴血小板減少綜合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)患者全血樣本BAK表達水平與疾病進展和死亡結局相關。Liu等[34]發(fā)現SFTSV感染人PBMC、巨噬細胞和C57/BL6小鼠均可激活NLRP3分泌IL-1β。Li等[35]發(fā)現SFTS患者血清中IL-1β顯著升高，與病毒載量呈負相關，進一步在體外用SFTSV感染健康人PBMCs，發(fā)現NLRP3型炎癥小體激活導致IL-1β和IL-18分泌增加。

4 結語與展望

從前期研究發(fā)現，目前研究出血熱病毒模式識別受體相關內容的研究模式主要有：分子表達與臨床表現或臨床指標的相關性研究、體外病毒感染(感染動物或培養(yǎng)細胞)與免疫機制研究、病毒蛋白/核酸等成分與PRRs體外相互作用研究、PRRs基因多態(tài)性研究等。在各種出血熱病毒感染中NLRP3的研究最為廣泛，其原因可能是該分子發(fā)現時間較久，抗體引物等各類研究工具較為成熟。其余PRRs在不同出血熱中的研究結果差異可能是由于病毒種類、核酸及蛋白結構的不同，但可能也與研究所用的細胞/動物及進行研究的PRRs種類選擇有關。表1中總結了目前模式識別受體在VHFs中的部分重要研究信息。

表1 模式識別受體在病毒性出血熱中的研究Tab.1 Research of pattern recognition receptors in viral hemorrhagic fever

目前多數有關VHFs中PRRs作用的研究仍有待進一步完善，在未來的研究中，可能采取的改進優(yōu)化思路有：1)構建更加全面反映相關疾病主要病變(如發(fā)熱、血管滲漏、凝血功能紊亂等)的動物模型，在此基礎上進行有關PRRs功能缺失研究(如基因敲除、表達干擾等)，從而明確在感染發(fā)病中起關鍵作用的PRRs。2)在基于臨床樣本的研究中，更多的采用基因芯片、單細胞測序等技術，較為全面的了解各類PRRs及其下游信號分子在臨床病程中的變化，避免因研究對象選擇而產生結果的偏向性。3)更多聚焦病毒與機體PRRs相互作用的具體結構成分(如某種蛋白結構域或核酸片段等)及后續(xù)信號轉導過程，深入探索不同病毒間關鍵成分差異對其與PRRs相互作用的影響。另外值得注意的是，TLR基因為代表的部分PRRs的遺傳變異或基因多態(tài)性可能使機體產生對同一病原體的不同先天免疫反應，從而影響感染個體的疾病易感性和臨床結局，將PRRs基因多態(tài)性對其分子結構和功能的影響與臨床表現差異相聯系，也是一個可能的研究方向。

利益沖突：無