王 丹，王肖龍*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接與實驗驗證揭示薯蕷皂苷元治療動脈粥樣硬化的作用機制

王 丹1, 2，王肖龍1, 2*

1. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 國家中醫(yī)心血管病臨床醫(yī)學研究中心分中心，上海 201203 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 心血管病研究所，上海 201203

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學、分子對接結(jié)合體外驗證的方法，探究薯蕷皂苷元抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的潛在靶點及作用機制。通過SwissTargetPrediction、Pharmmapper、CheMBL數(shù)據(jù)庫挖掘薯蕷皂苷元作用靶點，然后通過OMIM、Drugbank、Genecards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫預測與AS相關(guān)的靶點，取兩者共同靶點，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)；通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化，篩選核心靶點并進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；使用AutodockTools、PyMOL和Discovery Studio軟件進行分子對接以驗證薯蕷皂苷元和靶點的相關(guān)性。通過構(gòu)建體外泡沫細胞模型，考察薯蕷皂苷元對泡沫細胞脂質(zhì)代謝、促炎細胞因子水平及關(guān)鍵靶點表達的影響。共獲得588個薯蕷皂苷元靶點和5489個與AS相關(guān)的靶點，獲得275個薯蕷皂苷元與AS的交叉靶點，通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選獲得Src、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等52個關(guān)鍵靶點。GO功能富集分析表明，這些靶點主要與蛋白質(zhì)磷酸化、細胞對脂質(zhì)的反應，細胞遷移的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應等過程相關(guān)。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元抗AS與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等有關(guān)。分子對接表明，薯蕷皂苷元與Src、STAT3具有良好的結(jié)合親和力。體外實驗表明，薯蕷皂苷元顯著抑制THP-1巨噬細胞脂質(zhì)堆積和促炎細胞因子水平（＜0.05、0.01、0.001），顯著下調(diào)Src和STAT3的磷酸化水平（＜0.05、0.01、0.001）。薯蕷皂苷元能夠通過調(diào)節(jié)多個靶點和通路發(fā)揮抗AS作用，其作用機制可能與調(diào)節(jié)Src/STAT3通路從而改善脂質(zhì)代謝和炎癥有關(guān)。

薯蕷皂苷元；動脈粥樣硬化；網(wǎng)絡(luò)藥理學；分子對接；Src；信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種發(fā)生在大中動脈內(nèi)膜層的慢性炎癥性疾病[1]。脂質(zhì)代謝失衡是最初的公認原因，后來研究發(fā)現(xiàn)炎癥過程貫穿AS的始終。近年來，研究者逐漸認識到先天性和適應性免疫機制在AS進程中的重要作用[2]。AS晚期斑塊常造成血管狹窄、不穩(wěn)定斑塊破裂以及血栓形成，引起血管閉塞，導致致命的心血管疾病，這也成為老年人死亡最常見的原因之一[3]。目前臨床治療主要集中于降低低密度脂蛋白膽固醇水平和對并發(fā)癥進行治療。盡管目前抗膽固醇合成藥物中的他汀類藥物及抗血小板藥物在AS的防治中起到了積極的作用，但臨床應用中也發(fā)現(xiàn)了許多不良反應，例如他汀類藥物可引起肌炎、肌痛[4]，因此有必要開發(fā)更多替代藥物以擴充臨床用藥選擇。

中藥以及從中藥中提取的天然化合物由于其高治療價值、低全身毒性和廣泛的藥理活性而受到越來越多的關(guān)注。薯蕷皂苷元是一種來源于薯蕷屬植物（如盾葉薯蕷、黃山藥）的天然甾體皂苷元[5]，是地奧心血康、盾葉冠心寧的主要活性成分。地奧心血康、盾葉冠心寧主要用于治療冠心病、心絞痛、高脂血癥等。薯蕷皂苷元與膽固醇具有類似的化學結(jié)構(gòu)，在腸道中可競爭性地抑制膳食膽固醇吸收[6-7]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[8-9]、改善高膽固醇血癥[10-11]，同時還具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗增殖[14]等藥理作用，因此有望成為一種新型抗AS藥物。然而，目前關(guān)于薯蕷皂苷元在AS中研究仍處于初級階段，其潛在靶點及藥理學作用機制有待進一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一種基于系統(tǒng)生物學發(fā)展起來的，與高通量篩選、下一代測序、多組學應用相關(guān)的新型藥物研究范式[15]。其打破了傳統(tǒng)的“一種疾病-一個靶點-一種藥物”的思維范式，通過多靶點、多途徑的方式闡述復雜疾病的發(fā)病機制[16-17]。對于多靶點的天然產(chǎn)物未知藥理學作用的探索具有積極的預測作用。目前尚無薯蕷皂苷元抗AS的網(wǎng)絡(luò)藥理學相關(guān)研究，因此本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接技術(shù)預測薯蕷皂苷元與潛在靶標之間的相關(guān)性，并通過體外實驗對相關(guān)靶點和通路進行驗證，以期為薯蕷皂苷元抗AS的機制研究提供新思路。

1 材料

1.1 細胞

人單核THP-1細胞（批號20210723A1）購自大連美侖生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基（批號AG2957469）購自美國HyClone公司；薯蕷皂苷元（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號1105F023）購自北京索萊寶科技有限公司；阿托伐他?。ㄅ朙RAC0148）購自美國Sigma公司；胎牛血清購自BI公司；氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，批號YB-002）購自益源生物科技有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 ELISA試劑盒（批號EH6306M、EH6281M、EH6513M）購自上海威奧生物科技有限公司；Src抗體（批號36D10）、磷酸化Src（Tyr416）抗體（批號D49G4）購自美國CST公司；信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）抗體（批號EP2147Y）、β-actin抗體（批號10021787）購自美國Proteintech公司；磷酸化STAT3（Tyr705）抗體（批號ab76315）購自英國Abcam公司；油紅O染液（批號052821210930）、CCK-8試劑盒（批號031921211102）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，批號P3102110）、山羊抗小鼠IgG抗體（批號P3221170）購自翌圣生物科技有限公司；山羊抗兔IgG抗體（批號8715）購自SAB公司；膽甾烯酮對照品（質(zhì)量分數(shù)≥98%，批號21J040-A3）購自上海甄準生物科技有限公司；膽固醇氧化酶（批號J08HS184254）、膽固醇酯酶（批號M26HS179245）、TritonX-100（批號A20GS158556）、膽酸鈉（批號1305S11J123719）、無水MgCl2（批號S25O10T100980）、Tri-HCl緩沖液（批號N01GR166405）購自源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器

Eclipse E100型正置光學顯微鏡（日本尼康公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK型酶標儀、BB5060型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PYX-DHS型數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；TGL-168型離心機（上海安亭科學儀器廠）；蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；XW-80A型漩渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；ChemiScope系列熒光及化學發(fā)光成像系統(tǒng)（勤翔科學儀器有限公司）；1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析

2.1.1 薯蕷皂苷元靶點的預測 通過SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction. ch）[18]、Pharmmapper（http://lilab.ecust.edu.cn/ pharmmapper/index.php）[19]、CheMBL（http://www. ebi.ac.uk/chembl/）[20]數(shù)據(jù)庫進行薯蕷皂苷元靶點預測，所有靶點限定為“human”。去除重復數(shù)據(jù)后，將預測的靶點輸入到UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www. uniprot.org/）中進行標準化。

2.1.2 AS靶點的預測 在OMIM數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）[21-22]、Drugbank數(shù)據(jù)庫（https:// www.drugbank.ca）、Genecards數(shù)據(jù)庫（https://www. genecards.org/）和[23]DisGeNET數(shù)據(jù)庫（http://www. disgenet.org/）[24]搜索關(guān)鍵詞“atherosclerosis”，預測AS相關(guān)靶點。

2.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Venny2.1.0（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，篩選出薯蕷皂苷元和AS共同靶點。將這些靶點上傳到STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）中生成PPI網(wǎng)絡(luò)[25]，將條件設(shè)置為“human”，置信度設(shè)置為最高置信度（得分值＞0.9）并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，將得到的PPI網(wǎng)絡(luò)保存為TSV文件，導入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建和可視化靶網(wǎng)，并通過設(shè)定度值大于平均值篩選出核心靶點[26]。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 通過Metascape對交集靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，選擇物種為“human”，分別對生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG進行富集分析，以獲得主要生物學功能和信號通路，篩選＜0.01、最小計數(shù)為3且富集因子＞1.5的條目。采用OmicShare工具（http://www.omicshare.com/tools）可視化KEGG氣泡圖。

2.1.5 分子對接 使用PubChem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[27]獲得薯蕷皂苷元的SDF格式文件，通過Open Babel GUI軟件轉(zhuǎn)換為“mol2”格式文件，通過PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲得核心靶蛋白的PDB格式文件，然后使用Pymol軟件去除所有配體和水分子，并保存為PDB格式。通過Auto Dock Tools進行對接模擬，采用PyMOL 2.3.0和Discovery Studio 4.5 Client進行結(jié)果處理和可視化[28]。結(jié)合能小于?20.92 kJ/mol，認為配體和受體蛋白之間對接結(jié)果穩(wěn)定。

2.2 體外實驗驗證

2.2.1 THP-1巨噬細胞源性泡沫細胞的培養(yǎng)、模型構(gòu)建及給藥 THP-1細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育。用100 ng/mL PMA孵育2 d誘導貼壁巨噬細胞形成，之后用含100 μg/mL ox-LDL和0.2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基誘導巨噬細胞分化為泡沫細胞，給予低、中、高劑量（0.1、1.0、10.0 μmol/L）的薯蕷皂苷元或阿托伐他?。? μmol/L）干預48 h，對照組為未經(jīng)分化的巨噬細胞。

2.2.2 CCK-8法檢測細胞活力 將THP-1細胞用PMA誘導分化為貼壁巨噬細胞，以1×105個/孔接種于96孔板中，每孔加入100 μL不同濃度（0.01、0.1、1、10、20、40、80、160 μmol/L）的薯蕷皂苷元，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值。

2.2.3 油紅O染色評估泡沫細胞形成 將2 mL THP-1細胞以1×106個/mL接種于6孔板中，按“2.2.1”項下方法誘導泡沫細胞形成，并給予藥物干預48 h后，將細胞于4%多聚甲醛中固定10 min，用60%異丙醇漂洗15 s；用油紅O染液染色15 min，用60%異丙醇洗滌10 s；用蘇木精復染細胞1 min，用PBS洗滌3次后，在倒置顯微鏡下對陽性染色的細胞（紅色）進行拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析油紅染色中脂滴與整個圖像面積的面積比進行定量。

2.2.4 HPLC分析細胞內(nèi)脂質(zhì)水平[29]按“2.2.3”項下方法處理細胞并給藥后，用0.1% TritonX-100裂解細胞，測定蛋白質(zhì)濃度后，用10 μL酶促反應混合液［含500 mmol/L MgCl2、500 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L DTT、5%膽酸鈉］加入到100 μL細胞裂解液中混勻，然后將膽固醇酯酶聯(lián)合膽固醇氧化酶加入細胞裂解液中，37 ℃各作用1 h，用于測定細胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）含量；或僅加入膽固醇氧化酶用于測定細胞內(nèi)游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）含量；最后加入甲醇-乙醇混合液終止反應，10 000 r/min離心15 min，取10 μL上清液用于HPLC分析。膽固醇酯（cholesteryl ester，CE）含量為TC與FC的差值。

2.2.5 ELISA檢測細胞上清液中炎性細胞因子水平 按“2.2.3”項下方法處理細胞并給藥后，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書測定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

2.2.6 Western blotting檢測Src/STAT3通路相關(guān)蛋白表達 按“2.2.3”項下方法處理細胞并給藥后，收集細胞，用含或不含磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細胞，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入封閉液，37 ℃封閉2 h，分別加入Src（1∶1000）、p-Src（1∶1000）、STAT3（1∶500）、p-STAT3（1∶2000）、β-actin（1∶5000）抗體，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次5 min，加入HRP標記的山羊抗兔/小鼠IgG抗體（1∶5000），室溫孵育1 h；TBST洗滌3次后，加入化學發(fā)光試劑顯影，采用ChemiScope Capture圖像分析軟件對條帶灰度值進行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 薯蕷皂苷元和AS的潛在靶點篩選

通過SwissTargetPrediction、Pharmmapper、CheMBL數(shù)據(jù)庫分別預測出100、278、246個薯蕷皂苷元靶點。去除重復靶點，共獲得588個候選靶點。通過OMIM、Genecards、DisGeNET和Drugbank數(shù)據(jù)庫分別預測出626、4710、2044、33個抗AS的相關(guān)靶點，去除1891重復靶點，共獲得5489個與AS相關(guān)的靶點。

3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Omicshare網(wǎng)站獲得275個薯蕷皂苷元與AS的交叉靶點（圖1），將這275個靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，將生成的PPI網(wǎng)絡(luò)導入Cytoscape軟件，計算所有節(jié)點的拓撲特征并進行可視化。移除PPI網(wǎng)絡(luò)中與主要網(wǎng)絡(luò)離散且邊緣較少的節(jié)點后，最終呈現(xiàn)191個靶點、604條邊。根據(jù)度值≥6.324 6，鑒定出包括Src、STAT3在內(nèi)的52個關(guān)鍵靶點，如圖2所示，顏色越紅，面積越大代表度值越高，52個關(guān)鍵靶點分別位于圓圈中心2層。

3.3 GO功能和KEGG通路富集分析

對191個靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，共富集出198條分子功能、1818條生物學過程、111條細胞成分。圖3列出了前20個BP、MF、CC條目（＜0.01），結(jié)果表明薯蕷皂苷元對AS的潛在靶點與蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、核受體活性等分子功能有關(guān)，與蛋白質(zhì)磷酸化、細胞對脂質(zhì)的反應、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)等生物學過程有關(guān)，與受體復合物、細胞體、膜筏等細胞成分有關(guān)。圖4列出了前20條KEGG信號通路，去除不相關(guān)的廣譜通路，KEGG富集分析顯示主要涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化途徑、鈣信號通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路等通路。表明薯蕷皂苷元可能通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和炎癥對AS發(fā)揮作用。其中，脂質(zhì)與動脈粥樣硬化途徑是一個包含27個靶基因的重要途徑，涵蓋了包括、等眾多靶基因（圖5），因此基于Src/STAT3通路進行后續(xù)研究。

圖1 薯蕷皂苷元治療AS靶點的Venn圖

圓點代表靶點，圓點越大越紅代表度值越高，圓點越小越紫代表度值越低；連線代表蛋白間的功能關(guān)聯(lián)，連線顏色越深越粗代表關(guān)聯(lián)越強

圖3 薯蕷皂苷元治療AS的GO功能富集分析(前20)

圖4 薯蕷皂苷元治療AS的KEGG通路富集分析(前20)

圖5 薯蕷皂苷元參與脂質(zhì)與動脈粥樣硬化途徑

3.4 分子對接分析

如圖6所示，薯蕷皂苷元和Src的殘基LYSA:298氫鍵結(jié)合有助于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，其次薯蕷皂苷元和Src間形成alkyl鍵、Pi-alkyl鍵和范德華力作用。薯蕷皂苷元和STAT3的殘基ASPA:334氫鍵結(jié)合有助于結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，其次薯蕷皂苷元和STAT3間也形成alkyl鍵、Pi-alkyl鍵和范德華力作用。薯蕷皂苷元與Src、STAT3的相互作用能分別為?34.31、?34.73 kJ/mol，均小于?20.92 kJ/mol，表明薯蕷皂苷元與2個靶點之間具有良好的結(jié)合親和力。

圖6 薯蕷皂苷元與Src (A) 和STAT3 (B)的分子對接結(jié)果

3.5 體外實驗驗證結(jié)果

3.5.1 薯蕷皂苷元對巨噬細胞活力的影響 如圖7所示，當薯蕷皂苷元濃度低于20 μmol/L時，對細胞活性無顯著影響；當薯蕷皂苷元濃度高于20 μmol/L時，呈劑量相關(guān)性地抑制細胞活力（＜0.01、0.001），因此以0.1、1.0、10.0 μmol/L作為薯蕷皂苷元的低、中、高劑量進行后續(xù)實驗。

與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

3.5.2 薯蕷皂苷元對泡沫細胞形成的影響 如圖8所示，與對照組比較，ox-LDL負載顯著增加脂滴染色（＜0.001），表明泡沫細胞誘導成功；與模型組比較，薯蕷皂苷元中、高劑量組和阿托伐他汀組顯著抑制泡沫細胞中脂質(zhì)的積累（＜0.001）。

3.5.3 薯蕷皂苷元對THP-1巨噬細胞衍生的泡沫細胞TC、FC和CE水平的影響 如表1所示，與對照組比較，模型組TC、FC和CE水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組TC和CE水平均顯著降低（＜0.05、0.01），薯蕷皂苷元中、高劑量組和阿托伐他汀組FC水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.5.4 薯蕷皂苷元對THP-1巨噬細胞衍生泡沫細胞上清液中促炎細胞因子水平的影響 如圖9所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組細胞上清液中TNF-α水平顯著降低（＜0.001），薯蕷皂苷元中、高劑量組和阿托伐他汀組細胞上清液中IL-6和IL-1β水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。

與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

表1 薯蕷皂苷元對泡沫細胞脂質(zhì)積累的影響(, n = 3)

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group

圖9 薯蕷皂苷元對泡沫細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平的影響(, n = 6)

3.5.5 薯蕷皂苷元對THP-1巨噬細胞衍生泡沫細胞中Src/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 Src是STAT3信號傳導的重要調(diào)節(jié)劑[30]，Src激活可觸發(fā)STAT3活性[31]。此外，ox-LDL可顯著上調(diào)大鼠胸主動脈平滑肌VSMC細胞中Src磷酸化水平，而沉默Src可顯著逆轉(zhuǎn)這一效應[32]。如圖10所示，與對照組比較，模型組Src和STAT3的磷酸化水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組Src和STAT3的磷酸化水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。因此，薯蕷皂苷元可能通過抑制Src/STAT3信號通路，減輕脂質(zhì)代謝和促炎細胞因子的分泌，進而改善AS。

圖10 薯蕷皂苷元對泡沫細胞Src/STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

AS是造成急性冠脈綜合征、腦卒中等心腦血管疾病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)。薯蕷屬植物作為一種藥食同源的植物，其毒性極低，產(chǎn)量豐富，價格低廉，并且含有豐富的甾體皂苷，這些甾體皂苷經(jīng)提取已被制成多種心血管病臨床藥物。薯蕷皂苷元作為盾葉冠心寧、地奧心血康的最主要的活性成分之一，具有廣泛的臨床應用價值。薯蕷皂苷元在多種慢性病中發(fā)揮重要作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元可以抑制AS小鼠疾病進展[34]，降低高脂飲食喂養(yǎng)大鼠血清中TC、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和極低密度脂蛋白膽固醇水平，下調(diào)NF-κB表達，減輕炎癥反應[35]。薯蕷皂苷元抗AS的作用機制尚未被全面揭示。

近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學的興起無疑為多靶點疾病機制的探討以及多靶點藥物藥理作用的探討提供了一種新的分析工具[36-37]。本研究通過公開數(shù)據(jù)庫篩選了薯蕷皂苷元和AS共同靶點，并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)以獲得核心靶點。通過GO功能和KEGG通路富集分析探討薯蕷皂苷元抗AS的作用機制。KEGG分析結(jié)果中涉及癌癥通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、甲狀腺癌等癌癥相關(guān)信號通路，推測Src、STAT3、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）等多個靶點共同參與癌癥與AS相關(guān)信號通路，并在發(fā)病機制上顯示出一些相似性，如抑制細胞的增殖與遷移、抑制血管新生、抑制炎癥等。在剔除不相關(guān)的信號通路后，發(fā)現(xiàn)薯蕷皂苷元抗AS主要與脂質(zhì)代謝和炎癥相關(guān)，涉及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化途徑、Janus激酶（Janus kinase，JAK）-STAT信號通路、NF-κB信號通路等。此外，GO功能分析表明了薯蕷皂苷元抗AS涉及蛋白質(zhì)磷酸化、細胞對脂質(zhì)的反應、細胞遷移的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應、細胞黏附的調(diào)節(jié)、上皮細胞增殖的調(diào)節(jié)、細胞群增殖的負調(diào)控、細胞死亡等生物學過程。提示薯蕷皂苷元可能在脂質(zhì)代謝、炎癥、上皮細胞與血管平滑肌細胞的增殖與遷移、巨噬細胞的遷移與黏附、血管生成、細胞凋亡等AS病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用。在篩選的52個核心靶點中，Src與STAT3度值最高，同時富集出現(xiàn)在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、黏附連接、凋亡、炎癥相關(guān)信號通路、JAK-STAT信號通路等9條通路中，并且Src處于STAT3上游。Src激活可觸發(fā)STAT3活性，促進磷酸化STAT3表達[30]。分子對接結(jié)果也表明Src、STAT3與薯蕷皂苷元具有較高的結(jié)合親和力。

Src是一種與遷移相關(guān)的非受體酪氨酸激酶，抑制Src信號通路可抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[38-39]。Src在調(diào)節(jié)巨噬細胞功能中發(fā)揮重要作用，尤其是巨噬細胞介導的炎癥反應和免疫反應。巨噬細胞的黏附遷移和炎癥作為AS的重要環(huán)節(jié)，而Src參與調(diào)節(jié)所有Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）家族成員介導的炎癥信號通路，表明Src在AS巨噬細胞炎癥中發(fā)揮潛在作用[40]。此外，Src的激活提供了初始炎癥信號，觸發(fā)了NF-κB介導的炎癥途徑，NF-κB可刺激IL-6表達，IL-6的激活又可促進STAT3的激活，以響應炎癥信號[41]。在巨噬細胞脂質(zhì)代謝中，Src活性的抑制可減輕巨噬細胞脂質(zhì)積累[42]。Src家族激酶還通過參與解整合素-金屬蛋白酶15（a disintegrin and metalloproteinase 15，ADAM15）誘導的內(nèi)皮屏障功能障礙，減輕AS[43]。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，抑制Src可以抑制STAT3的激活[44]。薯蕷皂苷可通過抑制Src/STAT3信號通路減少血管生成，在抑制黑色素瘤的生長中發(fā)揮重要作用[45]。薯蕷皂苷是薯蕷皂苷元的糖苷形式，兩者具有相似的效應，推測薯蕷皂苷元對Src/STAT3信號通路也有積極的調(diào)控作用。

STAT3是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在AS過程中參與內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)代謝、巨噬細胞極化、炎癥調(diào)節(jié)、血管平滑肌增殖與遷移[46]。STAT3抑制劑可抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質(zhì)積累，減輕巨噬細胞炎癥反應[47]。在體內(nèi)和體外實驗中，抑制JAK2/STAT3通路可降低巨噬細胞內(nèi)三酰甘油、TC和低密度脂蛋白膽固醇水平[48]，抑制血管平滑肌細胞增殖，減輕頸動脈內(nèi)膜厚度[49]。STAT3在不穩(wěn)定斑塊中可能也發(fā)揮重要作用，抑制STAT3可能通過抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，減少血管生成，延緩不穩(wěn)定斑塊的進展[50]。本研究通過體外誘導泡沫細胞模擬AS斑塊中泡沫細胞的形成過程，探索薯蕷皂苷元抗AS的作用機制，結(jié)果顯示，薯蕷皂苷元可顯著降低ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質(zhì)堆積，表現(xiàn)為泡沫細胞脂滴明顯減少，TC、CE和FC水平降低，同時炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平也顯著降低；此外，薯蕷皂苷元可抑制Src和STAT3的磷酸化水平，表明薯蕷皂苷元可能通過抑制Src/STAT3信號通路，抑制巨噬細胞脂質(zhì)堆積和促炎因子表達，改善AS。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學結(jié)合分子對接和體外實驗驗證，探討了薯蕷皂苷元治療AS的作用機制。薯蕷皂苷元參與調(diào)節(jié)多條與AS相關(guān)的通路，涵蓋眾多靶點和細胞成分。薯蕷皂苷元可減輕巨噬細胞炎癥及脂質(zhì)堆積，這一效應可能與抑制Src/STAT3信號通路有關(guān)。本研究拓展了薯蕷皂苷元抗AS的機制，為AS的治療和新藥研發(fā)提供了一種思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Weber C, Noels H. Atherosclerosis: Current pathogenesis and therapeutic options [J]., 2011, 17(11): 1410-1422.

[2] Kobiyama K, Ley K. Atherosclerosis [J]., 2018, 123(10): 1118-1120.

[3] Zhu Y H, Xian X M, Wang Z Z,. Research progress on the relationship between atherosclerosis and inflammation [J]., 2018, 8(3): E80.

[4] Tomaszewski M, St?pień K M, Tomaszewska J,. Statin-induced myopathies [J]., 2011, 63(4): 859-866.

[5] Li X F, Liu S L, Qu L P,. Dioscin and diosgenin: Insights into their potential protective effects in cardiac diseases [J]., 2021, 274: 114018.

[6] Ondevilla J C, Hanashima S, Mukogawa A,. Diosgenin-induced physicochemical effects on phospholipid bilayers in comparison with cholesterol [J]., 2021, 36: 127816.

[7] Laguna J, Gomez-puyou A, Pena A,. Effect of diosgenin on cholesterol metabolism [J]., 1962, 2: 459-470.

[8] Cayen M N, Dvornik D. Effect of diosgenin on lipid metabolism in rats [J]., 1979, 20(2): 162-174.

[9] Sun F C, Yang X F, Ma C Q,. The effects of diosgenin on hypolipidemia and its underlying mechanism: A review [J]., 2021, 14: 4015-4030.

[10] Li R Q, Liu Y, Shi J J,. Diosgenin regulates cholesterol metabolism in hypercholesterolemic rats by inhibiting NPC1L1 and enhancing ABCG5 and ABCG8 [J]., 2019, 1864(8): 1124-1133.

[11] Yu L, Lu H F, Yang X F,. Diosgenin alleviates hypercholesterolemia via SRB1/CES-1/CYP7A1/FXR pathway in high-fat diet-fed rats [J]., 2021, 412: 115388.

[12] Jayachandran K S, Vasanthi H R, Rajamanickam G V. Antilipoperoxidative and membrane stabilizing effect of diosgenin, in experimentally induced myocardial infarction [J]., 2009, 327(1/2): 203-210.

[13] Choi K W, Park H J, Jung D H,. Inhibition of TNF-α-induced adhesion molecule expression by diosgenin in mouse vascular smooth muscle cells via downregulation of the MAPK, Akt and NF-κB signaling pathways [J]., 2010, 53(5/6): 273-280.

[14] Esfandiarei M, Lam J T, Yazdi S A,. Diosgenin modulates vascular smooth muscle cell function by regulating cell viability, migration, and calcium homeostasis [J]., 2011, 336(3): 925-939.

[15] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡(luò)藥理學評價方法指南》解讀 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

[16] Nogales C, Mamdouh Z M, List M,. Network pharmacology: Curing causal mechanisms instead of treating symptoms [J]., 2022, 43(2): 136-150.

[17] He R P, Jin Z, Ma R Y,. Network pharmacology unveils spleen-fortifying effect ofon different gastric diseases based on theory of “same treatment for different diseases” in traditional Chinese medicine [J]., 2021, 13(2): 189-201.

[18] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: Updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules [J]., 2019, 47(W1): W357-W364.

[19] Wang X, Shen Y H, Wang S W,. PharmMapper 2017 update: A web server for potential drug target identification with a comprehensive target pharmacophore database [J]., 2017, 45(W1): W356-W360.

[20] Gaulton A, Hersey A, Nowotka M,. The ChEMBL database in 2017 [J]., 2017, 45(D1): D945-D954.

[21] Amberger J S, Hamosh A. Searching online Mendelian inheritance in man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes [J]., 2017, 58: 1-20.

[22] Amberger J S, Bocchini C A, Schiettecatte F,. OMIM.org: Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM?), an online catalog of human genes and genetic disorders [J]., 2015, 43: D789-D798.

[23] Rebhan M, Chalifa-Caspi V, Prilusky J,. GeneCards: Integrating information about genes, proteins and diseases [J]., 1997, 13(4): 163.

[24] Pi?ero J, Queralt-Rosinach N, Bravo à,. DisGeNET: A discovery platform for the dynamical exploration of human diseases and their genes [J]., 2015, 2015: bav028.

[25] Szklarczyk D, Morris J H, Cook H,. The STRING database in 2017: Quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible [J]., 2017, 45(D1): D362-D368.

[26] Shannon P, Markiel A, Ozier O,. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks [J]., 2003, 13(11): 2498-2504.

[27] Kim S, Thiessen P A, Bolton E E,. PubChem substance and compound databases [J]., 2016, 44(D1): D1202-D1213.

[28] Seeliger D, de Groot B L. Ligand docking and binding site analysis with PyMOL and Autodock/Vina [J]., 2010, 24(5): 417-422.

[29] 馬衛(wèi)列, 龔曉華, 李觀強, 等. HPLC法測定apoA-1介導的泡沫細胞膽固醇流出的實驗研究 [J]. 重慶醫(yī)學, 2015, 44(29): 4116-4119.

[30] Kim M, Morales L D, Jang I S,. Protein tyrosine phosphatases as potential regulators of STAT3 signaling [J]., 2018, 19(9): E2708.

[31] Zhu J Y, Luo L, Tian L X,. Aryl hydrocarbon receptor promotes IL-10 expression in inflammatory macrophages through Src-STAT3 signaling pathway [J]., 2018, 9: 2033.

[32] Zhang W, Zhang L M, Zhang X S. Anti-atherosclerotic effects of genistein in preventing ox-low-density lipoprotein-induced smooth muscle-derived foam cell formation via inhibiting SRC expression and L-Ca channel currents [J]., 2022, 10(12): 700.

[33] Parama D, Boruah M, Yachna K,. Diosgenin, a steroidal saponin, and its analogs: Effective therapies against different chronic diseases [J]., 2020, 260: 118182.

[34] Lv Y C, Yang J, Yao F,. Diosgenin inhibits atherosclerosis via suppressing the-induced downregulation of ATP-binding cassette transporter A1 [J]., 2015, 240(1): 80-89.

[35] Binesh A, Devaraj S N, Devaraj H. Expression of chemokines in macrophage polarization and downregulation of NF-κB in aorta allow macrophage polarization by diosgenin in atherosclerosis [J]., 2020, 34(2): e22422.

[36] Hopkins A L. Network pharmacology [J]., 2007, 25(10): 1110-1111.

[37] Zhang Y Y, Wang Z, Wang Y Y. Multi-hierarchical profiling: An emerging and quantitative approach to characterizing diverse biological networks [J]., 2017, 18(1): 57-68.

[38] Cho H M, Choi S H, Hwang K C,. The Src/PLC/PKC/MEK/ERK signaling pathway is involved in aortic smooth muscle cell proliferation induced by glycated LDL [J]., 2005, 19(1): 60-66.

[39] Lang Y S, Chen D, Li D Y,. Luteolin inhibited hydrogen peroxide-induced vascular smooth muscle cells proliferation and migration by suppressing the Src and Akt signalling pathways [J]., 2012, 64(4): 597-603.

[40] Byeon S E, Yi Y S, Oh J,. The role of Src kinase in macrophage-mediated inflammatory responses [J]., 2012, 2012: 512926.

[41] Iliopoulos D, Hirsch H A, Struhl K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 microRNA, and IL6 links inflammation to cell transformation [J]., 2009, 139(4): 693-706.

[42] Yang K, Wang X Q, Liu Z H,. Oxidized low-density lipoprotein promotes macrophage lipid accumulation via the toll-like receptor 4-Src pathway [J]., 2015, 79(11): 2509-2516.

[43] Sun C X, Wu M H, Lee E S,. A disintegrin and metalloproteinase 15 contributes to atherosclerosis by mediating endothelial barrier dysfunction via Src family kinase activity [J]., 2012, 32(10): 2444-2451.

[44] Giordano M, Decio A, Battistini C,. L1CAM promotes ovarian cancer stemness and tumor initiation via FGFR1/SRC/STAT3 signaling [J]., 2021, 40(1): 319.

[45] Liu Y X, Xu B W, Niu X D,. Inhibition of Src/STAT3 signaling-mediated angiogenesis is involved in the anti-melanoma effects of dioscin [J]., 2022, 175: 105983.

[46] Chen Q, Lv J J, Yang W W,. Targeted inhibition of STAT3 as a potential treatment strategy for atherosclerosis [J]., 2019, 9(22): 6424-6442.

[47] Wang R, Zhang Y J, Xu L R,. Protein inhibitor of activated STAT3 suppresses oxidized LDL-induced cell responses during atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice [J]., 2016, 6: 36790.

[48] Yang L W, Song Z K, Pan Y,. PM2.5 promoted lipid accumulation in macrophage via inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathways and aggravating the inflammatory reaction [J]., 2021, 226: 112872.

[49] Song H T, Cui Y, Zhang L L,. Ruxolitinib attenuates intimal hyperplasia via inhibiting JAK2/STAT3 signaling pathway activation induced by PDGF-BB in vascular smooth muscle cells [J]., 2020, 132: 104060.

[50] Li S F, Geng Q, Chen H,. The potential inhibitory effects ofon vulnerable plaque formation via the suppression of STAT3 transcriptional activity [J]., 2018, 41(2): 859-867.

Mechanism of diosgenin in treatment of atherosclerosis based on network pharmacology, molecular docking and experimental validation

WAND Dan1, 2, WANG Xiao-long1, 2

1. Branch of National Clinical Research Center for Chinese Medicine Cardiology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Cardiovascular Research Institute of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

To explore the potential targets and mechanism of diosgenin against atherosclerosis (AS) through network pharmacology, molecular docking andverification.The targets of diosgenin were mined by SwissTargetPrediction, Pharmmapper and CheMBL databases, and then the targets related to AS were predicted by OMIM, Drugbank, Genecards and DisGeNET databases, and protein-protein interaction (PPI) network was constructed by taking the common targets of them. Cytoscape 3.7.2 software was used to visualize, then core targets were screened out and performed gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) enrichment analysis. AutodockTools, PyMOL and Discovery Studio software were used for molecular docking to verify the correlation between diosgenin and targets. The effects of diosgenin on lipid metabolism, levels of pro-inflammatory cytokines and expressions of key targets in foam cells were investigated by constructing foam cell model.A total of 588 targets of diosgenin and 5489 targets related to AS were obtained, and 275 cross targets between diosgenin and AS were obtained. Through PPI network screening, 52 key targets such as Src, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) were obtained. GO function enrichment analysis showed that these targets were mainly related to the phosphorylation of protein, reaction of cells to lipids, positive regulation of cell migration, inflammatory reaction and other processes. KEGG pathway enrichment analysis showed that the effect of diosgenin on AS was related to lipid and atherosclerosis pathway, nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway, etc. Molecular docking showed that diosgenin had good binding affinity with Src and STAT3.experiments showed that diosgenin significantly inhibited THP-1 macrophage lipid accumulation and pro-inflammatory cytokine levels (< 0.05, 0.01, 0.001), significantly up-regulated Src and STAT3 phosphorylation levels (< 0.05, 0.01, 0.001).Diosgenin plays an anti-AS role by regulating multiple targets and pathways, and its mechanism may be related to improving lipid metabolism and inflammation by regulating Src/STAT3 pathway.

diosgenin; atherosclerosis; network pharmacology; molecular docking; Src; signal transducer and activator of transcription 3

R285.5

A

0253 - 2670(2022)24 - 7783 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.016

2022-09-06

國家自然科學基金面上項目（81573647）；國家自然科學基金面上項目（82074222）；上海市中醫(yī)臨床重點實驗室（14DZ2273200）；上海市科委引導類項目（19401934300）；上海市衛(wèi)健委中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（ZY[2018-2020]-CCCX-2003-07）；上海市臨床重點?？祈椖浚╯hslczdzk05301）

王 丹（1994—），女，碩士研究生，研究方向為中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病。E-mail: 1055466579@qq.com

王肖龍，博士生導師，教授。E-mail: wxlqy0214@163.com

[責任編輯 李亞楠]