熊瑩槐，羅曉春，錢(qián)雪橋,黃錦爐，劉緒博

(1. 廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511400；2. 華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

引 言

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對(duì)蝦，具有適溫范圍廣(6～39 ℃)，鹽度適應(yīng)能力強(qiáng)(0.5～50)，生長(zhǎng)速度快，抗病力強(qiáng)，肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，已成為中國(guó)和世界范圍內(nèi)的對(duì)蝦三大養(yǎng)殖種類(lèi)之一[1]。

在過(guò)去幾十年間，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，全球魚(yú)粉供應(yīng)量開(kāi)始出現(xiàn)短缺，魚(yú)粉價(jià)格昂貴，因此在水生生物飼料中用植物蛋白替代魚(yú)粉開(kāi)始被廣泛研究[2-3]。但是相對(duì)于動(dòng)物蛋白，植物蛋白源存在諸多抗?fàn)I養(yǎng)因子，諸如植酸鹽、大豆抗原蛋白等，這會(huì)導(dǎo)致蝦類(lèi)消化酶活性下降，甚至導(dǎo)致養(yǎng)殖動(dòng)物腸道組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理性的損傷[4-6]。據(jù)報(bào)道，通過(guò)飼料添加復(fù)合酶制劑是提高水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)飼料消化吸收能力的一個(gè)有效的途徑之一，甚至在一定程度上可以提高水生動(dòng)物的免疫能力[7-8]。例如，Yildirim等[9]報(bào)道飼料中添加復(fù)合酶制劑(果膠酶、木聚糖酶等)可顯著提高非洲鯰(Oreochromisniloticus×O.aureus)的飼料轉(zhuǎn)化率和生長(zhǎng)性能；王國(guó)霞等[4]報(bào)道飼料添加植酸酶和復(fù)合酶可以提高黃顙魚(yú)(Pelteobagrusfulvidraco)抗氧化能力和腸道健康狀況。

此外，隨著全球市場(chǎng)對(duì)蝦類(lèi)的需求越來(lái)越大，蝦養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展[10]，為提高蝦養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)社會(huì)利益，高密度養(yǎng)殖模式開(kāi)始在整個(gè)蝦產(chǎn)業(yè)中流行[11-12]，這使蝦持續(xù)暴露在人工和次優(yōu)的養(yǎng)殖條件下。在高密度養(yǎng)殖模式下，往往投入過(guò)多的餌料，從而導(dǎo)致殘餌糞便在蝦池的大量積累，使得對(duì)蝦對(duì)飼料利用率下降，且水環(huán)境急劇惡化，有害微生物大量繁殖，進(jìn)一步影響了對(duì)蝦的生長(zhǎng)、發(fā)育和產(chǎn)品質(zhì)量[13]。飼料添加益生菌可以在一定程度上緩解養(yǎng)殖弊端，益生菌在腸道中的繁殖速度大于凋亡速度，并與宿主、環(huán)境形成動(dòng)態(tài)平衡[14]。研究表明，益生菌可以在一定范圍內(nèi)形成占位效應(yīng)，從而抑制致病菌過(guò)度生長(zhǎng)，有助于調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡，并可以提高宿主的免疫力；此外，益生菌還可以為宿主提供養(yǎng)分，增強(qiáng)宿主消化酶活性，提高飼料消化率[15]。目前，較少研究報(bào)道飼料中添加微生態(tài)制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦體生化組成、能量收支和能量平衡的影響。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在飼料中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合菌制劑以及復(fù)合菌酶制劑來(lái)對(duì)比研究復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、體生化組成、和能量平衡的影響，以期為凡納濱對(duì)蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)于廣州海鷗島試驗(yàn)基地進(jìn)行，所用系統(tǒng)為循環(huán)水系統(tǒng)。以初始體重(2.05±0.05)g凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別設(shè)計(jì)了1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)處理組，其中，A為對(duì)照組，投喂基礎(chǔ)飼料(主要成分見(jiàn)表1)；B為基礎(chǔ)飼料+酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶等復(fù)合酶)；C為基礎(chǔ)飼料+復(fù)合菌制劑組(復(fù)合菌由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌構(gòu)成)；D為基礎(chǔ)飼料+復(fù)合菌酶制劑(主要由嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌復(fù)合菌與消化酶和非淀粉多糖酶等復(fù)合酶)。飼料制劑購(gòu)于歐科拜克生物有限公司(洛陽(yáng)，河南，中國(guó))。菌酶制劑通過(guò)攪拌的方法與飼料均勻混合，B組酶制劑濃度為150 mg/kg，C組復(fù)合菌濃度為2×109cfu/g，D組菌、酶濃度分別為2×109cfu/g、150 mg/kg；飼料中添加的菌、酶劑量均為25 g/kg。每個(gè)處理組分別設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)分別放養(yǎng)100尾蝦。

表1 基礎(chǔ)飼料的主要成分Table 1 composition of the basic feed

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將對(duì)蝦暫養(yǎng)于鹽度17的半咸水中進(jìn)行馴化，整個(gè)馴化期為10 d。期間保持合適充氧，定時(shí)測(cè)定水溫，定時(shí)投喂適量基礎(chǔ)飼料，并且將養(yǎng)殖用水的鹽度每天提升2，逐漸馴化直到鹽度升至養(yǎng)殖用水的自然鹽度31。馴化暫養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定2 d，準(zhǔn)備進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

暫養(yǎng)馴化階段結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)蝦饑餓1 d，然后選取規(guī)格相近，無(wú)病無(wú)傷、健康活潑的凡納濱對(duì)蝦分輪次隨機(jī)放入16個(gè)相同規(guī)格的400 L塑料桶中，每次放入對(duì)蝦10尾，共放10輪即每個(gè)養(yǎng)殖桶中共放凡納濱對(duì)蝦100尾，在放蝦過(guò)程中稱量并記錄每個(gè)重復(fù)中蝦的總重量。然后進(jìn)行45 d的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。養(yǎng)殖過(guò)程中，使水溫保持27 ℃左右，溶氧高于5 mg/L，養(yǎng)殖用水鹽度31，酸堿度8.0±0.1。養(yǎng)殖水質(zhì)使用多功能YSI專業(yè)水質(zhì)分析儀進(jìn)行測(cè)定(Yellow Spring Instrument Co., Yellow Spring, Ohio, USA)。每天于上午8:30及下午5：00定時(shí)投喂，每天的投喂量以對(duì)蝦體重3%～5%為準(zhǔn)。每次投喂前分別收集養(yǎng)殖桶底部的殘餌、糞便，同時(shí)換水1/3～2/3。每天檢查并記錄對(duì)蝦的攝食和死亡情況。

1.2 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 糞便收集與肌肉采集

實(shí)驗(yàn)用飼料隨機(jī)取樣3份，用于飼料成分的分析。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)投喂時(shí)間內(nèi)飼料的1.5 h溶失率進(jìn)行測(cè)定，用于校正溶失造成的攝食量計(jì)算中的誤差。殘餌在投喂后1 h用虹吸法及時(shí)收集，每次在投喂前和投喂后1.5 h用虹吸法收集糞便和蝦殼，再分別裝入對(duì)應(yīng)燒杯，在70 ℃下烘干至恒重后在-20 ℃下保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)蝦停食24 h，然后對(duì)每個(gè)桶的蝦分別稱重，樣品在70 ℃下烘干至恒重后在-20 ℃下保存。

肌肉組織經(jīng)液氮迅速冷凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于肌肉組織腺苷酸的測(cè)定。

1.2.2 生長(zhǎng)指標(biāo)的計(jì)算

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，測(cè)量記錄實(shí)驗(yàn)用蝦的初總體重、初均重、初均長(zhǎng)、對(duì)蝦的總數(shù)。45 d的養(yǎng)殖之后，將實(shí)驗(yàn)用蝦進(jìn)行24 h的饑餓處理，統(tǒng)計(jì)存活的數(shù)量，計(jì)算均增重、增重率、特定生長(zhǎng)率等。

體重增長(zhǎng)率=[均增重(g)/初均重(g)]×100%；

(1)

成活率=養(yǎng)殖結(jié)束后對(duì)蝦總數(shù)/養(yǎng)殖開(kāi)始前對(duì)蝦總數(shù)×100%

(2)

特定生長(zhǎng)率=(lnW2-lnW1)/t×100%；

(3)

W1表示初始體重，W2表示末體重，t表示養(yǎng)殖時(shí)間。

1.2.3 生化組成和能值的測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)蝦樣品放入烘箱70 ℃下烘干至恒重，得到干物質(zhì)含量；以馬福爐(HRMF-7000，熱博特有限公司，中國(guó))550 ℃灼燒6 h灰化至恒重得到灰分含量；元素分析儀(Vario ELⅢ，元素分析系統(tǒng)公司，德國(guó))測(cè)得N含量后，再計(jì)算得到蛋白質(zhì)含量(6.25×N)；以脂肪抽提儀(BUCHI36680，力辰儀器有限公司，中國(guó))測(cè)定蝦體脂肪含量(乙醚為抽提劑)；蝦體組織能值以氧彈熱量?jī)x(PARR6400，Parr儀器公司,美國(guó))測(cè)得。

對(duì)蝦的攝食(C)、生長(zhǎng)(G)、呼吸(R)、糞便(F)、排泄(U)和蛻殼(E)的能量符合下列關(guān)系：

C=G+R+F+U+E

(4)

其中，C為攝入的餌料能量，G為生長(zhǎng)能，R為代謝能，F(xiàn)為糞能，U為排泄能，E為蛻殼能。其中，C、G、F和E所含的能值用PARR 6400型氧彈熱量?jī)x測(cè)定，排泄能以下式計(jì)算：

U=(CN-GN-FN-EN)×24.83

(5)

式中,CN為攝食食物中所含的氮，GN為蝦體中積累的氮，F(xiàn)N和EN為糞便和蛻殼損失的氮，24.83為每克氨氮的能值(KJ)。這里假定氨是唯一的氮排泄物。含氮量用VarioELⅢ型元素分析儀測(cè)定。呼吸耗能由能量收支式R=C-G-F-U-E求出。

1.2.4 腺苷酸含量的測(cè)定

腺苷酸含量采用Agilent 1100高效液相色譜儀(HPLC,Agilent Corp., USA)進(jìn)行測(cè)定。適量冷凍肌肉組織樣品加入9倍體積的冰冷高氯酸(0.9 mol·L-1)溶液進(jìn)行勻漿。勻漿液于7 000 g、4 ℃下離心5 min，收集上清液并以3.75 mol·L-1K2CO3中和至pH6.5。中和后的溶液于7 000 g、4 ℃下離心10 min，收集上清液用于測(cè)定相應(yīng)組織中腺苷酸含量。組織樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后用于測(cè)定腺苷三磷酸(ATP)、腺苷二磷酸(ADP)和腺苷一磷酸(AMP)含量。以UltimateTM AQ-C18柱(4.6×250 mm)，柱溫為35 ℃，洗脫時(shí)間為24 min，流速為1.0 ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。以磷酸緩沖液(40 mmol·L-1KH2PO4和60 mmol·L-1K2HPO4，pH6.50)作為流動(dòng)相。根據(jù)測(cè)得的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腺苷酸含量(微摩爾每克組織，μmol·gww-1)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由已知濃度的ATP(0-0.8 mmol·L-1)、ADP(0-1.2 mmol·L-1)和AMP(0-1.5 mmol·L-1)溶液制作而成[16]?；貧w曲線方程、總腺苷酸(TAN)含量計(jì)算公式如下：

ATP Y=14.045x+9.374，R2=1.000

(6)

ADP Y=18.11x-25.053，R2=0.9998

(7)

AMP Y=18.32x-31.33，R2=0.9998

(8)

TAN=[ATP]+[ADP]+[AMP]

(9)

上式中，Y表示腺苷酸峰面積，X表示腺苷酸濃度，[ATP]、[ADP]和[AMP]分別表示ATP、ADP和AMP濃度。

1.3 數(shù)據(jù)計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.)表示。利用SPSS 22.0對(duì)凡納濱對(duì)蝦以上各指標(biāo)的變化作單因子方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，并以P<0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)指標(biāo)

由表2所示，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，飼料酶制劑和菌制劑均可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。投喂不同飼料45 d后，實(shí)驗(yàn)組(B、C、D組)凡納濱對(duì)蝦的末體重、均增重、增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組(A組)，且D組生長(zhǎng)指標(biāo)顯著高于其他組(P<0.05)。C組對(duì)蝦的末體重、均增重和增重率顯著高于B組，但顯著低于D組(P<0.05)。

表2 不同處理凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)情況Table 2 Growth performance of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.2 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的含能量及體生化組成

如表3所示，飼料酶制劑和菌制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦體脂肪和灰分影響不顯著(P>0.05)。D組對(duì)蝦體蛋白質(zhì)含量顯著高于A、B兩組，且D組對(duì)蝦體水分含量顯著低于A、B和C組(P<0.05)。B組和C組對(duì)蝦體水分和蛋白質(zhì)差異不顯著(P>0.05)。飼料添加復(fù)合菌制劑可以顯著提高對(duì)蝦體能量值，其中C組和D組對(duì)蝦體能量顯著高于A和B組(P<0.05)。

表3 不同處理凡納濱對(duì)蝦體成分組成和體能量Table 3 Body composition and energy content of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.3 不同處理組凡納濱對(duì)蝦的能量分配

由表4和表5可知，飼料添加酶制劑和菌制劑可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦的攝食能，生長(zhǎng)能，呼吸能和蛻殼能，其中D組各能值含量最高(P<0.05)。相比于對(duì)照組(A組)，B組對(duì)蝦生長(zhǎng)能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例顯著升高，且呼吸能占攝食能比例顯著降低(P<0.05)。同樣地，C組對(duì)蝦生長(zhǎng)能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例也顯著升高；呼吸能占攝食能比例和排泄能占攝食能比例均顯著降低，且B、C兩組間也存在顯著性差異(P<0.05)。D組對(duì)蝦生長(zhǎng)能占攝食能比例、蛻殼能占攝食能比例顯著高于其他三組，且呼吸能占攝食能比例和排泄能占攝食能比例顯著低于其他三組(P<0.05)。

表4 不同處理凡納濱對(duì)蝦能量收支各組分能量值Table 4 Energy budget components of Litopenaeus vannamei fed with different diets

表5 不同處理凡納濱對(duì)蝦能量收支各組分能量分配Table 5 The ratio of the energy of each component to the energy of ingestion of Litopenaeus vannamei fed with different diets

2.4 不同處理組凡納濱對(duì)蝦肌肉的腺苷酸含量

由圖1可知，不同處理對(duì)凡納濱對(duì)蝦肌肉的TAN無(wú)顯著影響(圖1a)；飼料酶制劑(B組)和菌制劑(C組)顯著提高了凡納濱對(duì)蝦肌肉ATP含量，且酶菌制劑(D組)肌肉ATP含量顯著高于其他三組(P<0.05，圖1b)。同時(shí)，飼料酶制劑組(B組)、菌制劑組(C組)和菌酶制劑組(D組)凡納濱對(duì)蝦肌肉AMP/ATP和ADP/ATP值顯著低于對(duì)照組，且C組顯著低于B組，D組顯著低于其他三組(P<0.05，圖1c，d)。

圖1 不同處理凡納濱對(duì)蝦肌肉的腺苷酸含量注：ATP為腺苷三磷酸，ADP為腺苷二磷酸，AMP為腺苷一磷酸，TAN為三者之和。不同字母上標(biāo)表示單因素分析Duncan’s檢驗(yàn)差異性顯著，下同。Fig.1 Adenine nucleotides in the muscles of Litopenaeus vannamei fed with different dietsNotes：ATP is adenosine triphosphate, ADP is adenosine diphosphate, AMP is adenosine monophosphate, TAN is the sum of the ATP, ADP and AMP. Means with different superscripts indicate significant differences (P<0.05) based on e-way ANOVA and the Duncan’s test.

3 討論

通過(guò)添加酶制劑和菌制劑提高水產(chǎn)動(dòng)物的生產(chǎn)性能已有大量成功的報(bào)道[13,15,17-18]。相似地，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)飼料中添加復(fù)合酶制劑(消化酶和非淀粉多糖酶)和復(fù)合菌制劑(嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和糞鏈球菌)可顯著提高凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。這可能因?yàn)?，飼料中添加的消化酶增?qiáng)了凡納濱對(duì)蝦對(duì)飼料的利用率，加大了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而提高了生長(zhǎng)性能。此外，酶制劑中的非淀粉多糖酶可降解可溶性非淀粉多糖，減少食糜粘性，也可以摧毀植物細(xì)胞壁，進(jìn)一步釋放飼料的營(yíng)養(yǎng)成分[19]而被對(duì)蝦所吸收利用。飼料中所添加的復(fù)合菌制劑本身可以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被對(duì)蝦利用，更可以改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸道成熟，增強(qiáng)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力[20-21]。其中，枯草芽孢桿菌自身可以合成α-淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、蛋白酶等，在消化道中與動(dòng)物體內(nèi)的消化酶類(lèi)一同發(fā)揮作用[22]。此外，本實(shí)驗(yàn)表明，飼料中同時(shí)添加酶制劑和菌制劑效果比分別單獨(dú)添加酶制劑或菌制劑效果好，表明凡納濱飼料中復(fù)合酶和復(fù)合菌制劑可以起到協(xié)同作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，飼料中復(fù)合菌酶制劑的添加會(huì)顯著降低凡納濱對(duì)蝦體水分含量，并顯著提高體蛋白質(zhì)含量，從而提高凡納濱對(duì)蝦的品質(zhì)。飼料中菌酶制劑的添加顯著提高了凡納濱對(duì)蝦的攝食能，且菌酶制劑組凡納濱對(duì)蝦的(生長(zhǎng)能/攝食能)和(蛻殼能/攝食能)顯著高于其他組，而(呼吸能/攝食能)和(排泄能/攝食能)顯著低于其他組，表明菌酶制劑組凡納濱對(duì)蝦更多的能量被用來(lái)生長(zhǎng)和蛻殼。此外，相較于對(duì)照組，在飼料中單獨(dú)添加酶制劑或菌制劑也可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦用于生長(zhǎng)的能量，但該效果均不如菌酶制劑組好。

在生物體內(nèi)，ATP是能量的儲(chǔ)存形式，而ADP和AMP是能量被利用的形式，當(dāng)機(jī)體的能量被大量?jī)?chǔ)存時(shí)，生物體可以獲得更好的生長(zhǎng)性能[23]。本研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)在飼料中添加復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑均可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦肌肉ATP含量，并降低ADP/ATP和AMP/ATP含量，表明酶制劑和菌制劑的添加可以促進(jìn)對(duì)蝦能量的保存率，從而提高其生長(zhǎng)效率。此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在飼料中同時(shí)添加復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑效果比單獨(dú)添加這兩種制劑更好。這進(jìn)一步解釋了菌酶制劑組凡納濱對(duì)蝦具有最佳生長(zhǎng)性能。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在飼料中添加復(fù)合酶制劑，復(fù)合菌制劑可以顯著提高凡納濱對(duì)蝦能量收支狀況和肌肉ATP含量，從而顯著提高了凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。同時(shí)本研究結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦飼料中酶制劑和菌制劑起到協(xié)同作用，同時(shí)添加效果最好。