董慧玲，劉祥辰，孔鵬洲，徐恩偉，宋彬

1.山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院，山西 太原 030001；2.中山大學附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海 519000；3.山西醫(yī)科大學醫(yī)學轉(zhuǎn)化中心，山西 太原 030001；4.山西省腫瘤醫(yī)院，山西太原030001；5.山西醫(yī)科大學白求恩醫(yī)院，山西 太原 030001

我國是食管癌高發(fā)國家，其中食管鱗癌（esophageal squamous cancer，ESCC）是食管癌的主要病理學類型，占90%以上［1］。隨著醫(yī)學技術(shù)的進步，ESCC治療取得很大的進展，但晚期ESCC 的5年生存率仍很低［2-3］?；熓峭砥贓SCC 的主要治療手段［4-5］，食管癌診療指南（2020版）將鉑類聯(lián)合氟尿嘧啶類或紫杉醇類作為ESCC 的一線化療方案。治療食管癌常用鉑類化療藥主要有順鉑（cisplatin，DDP）、奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA、L-OHP）、卡鉑（carboplatin，CBP）等，隨著鉑類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，越來越多的食管癌患者表現(xiàn)出對鉑類藥物的耐藥［6］。

本研究建立了ESCC L-OHP耐藥細胞株，通過全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選差異表達基因和富集的可能信號通路，旨在探索食管癌L-OHP耐藥性的可能機制，為臨床ESCC的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞 人食管鱗癌細胞系KYSE150細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2 主要試劑及儀器L-OHP 為齊魯制藥有限公司生產(chǎn)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基RPMI1640購自美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）購自以色列BI公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄及qRCR 試劑SYBRGreenl 購自寶生生物科技有限公司；Matrigel 膠購自美國BD Biscience 公司；Transwell小室為美國Corning公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng) 將-80 ℃凍存的細胞取出，置于37 ℃溫水中迅速解凍，225×g離心3 min，棄上清，用含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，均勻鋪于小皿中，置37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 耐藥細胞培養(yǎng)及形態(tài)學變化 L-OHP 分子量為397.29 g／mol，濃度范圍0 ～200 μmol／L。用12.58 mL三蒸水溶解50 mg L-OHP，配制成濃度為10 mmol／L的母液，分裝，100 μL／管，-80 ℃密封儲存。分別將母液稀釋成2、4、8、16、32、64、128、200 μmol／L的稀釋液，CCK-8 法測定半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50）。用16 μmol／L 的L-OHP 沖擊KYSE150 細胞24 h，去除含藥培養(yǎng)基，PBS 洗去死細胞后換成新鮮完全培養(yǎng)基，細胞恢復(fù)正常生長速度，再用藥物濃度遞增方式誘導，直至細胞在16 μmol／L的L-OHP濃度下穩(wěn)定傳代即建成KYSE150／L-OHP細胞。每隔一段時間測定KYSE150和KYSE150／L-OHP組細胞的IC50值，并按下式計算耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。光學顯微鏡下觀察KYSE150和KYSE150／L-OHP組細胞形態(tài)。

RI=L-OHP組耐藥細胞IC50／親本細胞IC50

1.5 細胞抑制率測定 將KYSE150 及KYSE150／LOHP 細胞用胰酶消化為單個細胞，225 ×g離心后，用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并計數(shù)。將各組細胞以4 000個／孔接種于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；試驗組分別加入含不同濃度L-OHP 的完全培養(yǎng)基，對照組不加L-OHP，培養(yǎng)48 h；每孔加入10%CCK-8 試劑，作用2 h，酶標儀檢測450 nm 波長處各孔吸光度值，并按下式計算藥物對細胞的抑制率。

抑制率（%）=（對照組A450-試驗組A450）／（對照組A450-空白組A450）×100%

1.6 細胞侵襲／遷移能力的檢測

1.6.1 侵襲試驗 采用Transwell小室試驗。提前24 h將BD Matrigel 膠置4 ℃融化，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基按1∶7稀釋，每個小室中加入100 μL，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取各組細胞沉淀，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，在24 孔板的下室加入600 μL 含10%FBS的完全培養(yǎng)基，上室加入200 μL 細胞懸液（8 × 104個細胞），置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；用棉簽將小室里面底部的細胞擦凈，放入4%多聚甲醛中固定20 min，三蒸水洗滌1 次，用結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下觀察，隨機選取4 ～6個視野拍照計數(shù)。

1.6.2 遷移試驗 除小室不鋪基質(zhì)膠，其余步驟同1.6.1項。

1.7 轉(zhuǎn)錄組測序及差異表達基因篩選 RNA 提取、文庫構(gòu)建、質(zhì)控由中國北京諾禾致源科技有限公司（簡稱諾禾致源）完成。文庫檢測合格，將各組文庫按照有效濃度及目標數(shù)據(jù)匯集后進行Illumina 測序［7］。本研究采用諾禾致源illumina HiSeqTM2500／MiSeq 等測序平臺對KYSE150 和KYSE150／L-OHP細胞進行測序［8］。利用edgeR 分析軟件對miRNA、LncRNA、circRNA、mRNA表達譜數(shù)據(jù)均一化后，進行組間差異基因表達分析。用差異倍數(shù)（fold change）≥2倍，P值或矯正后的P值判斷顯著性水平，校正后的P值越小代表越顯著。將P＜0.05 作為差異顯著性標準（若P＜0.05 篩選差異過少，則使用q＜0.05 進行差異篩選，篩選條件見火山圖）。為探究差異表達基因的功能，通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫來尋找這些差異基因主要參與的信號通路。使用KOBAS（2.0）進行pathway 富集［9］，F(xiàn)DR ≤0.05 的pathway 定義為在差異表達基因中顯著富集的pathway。

1.8 差異表達基因的RT-PCR 驗證 為驗證所篩選的差異表達基因的準確性，從中選取5 個差異倍數(shù)相對較大的基因進行RT-PCR 驗證。提取細胞總RNA，使用Prime Script TMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，體系為20 μL。利用在線引物設(shè)計工具Oligo設(shè)計qRCR特異性擴增引物，GAPDH正義鏈：5′-CCAGAACATCATCCCTGCCT-3′，反義鏈：5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；ACTG1正義鏈：5′-CATTGTCATGGACTCTGGAGAC-3′，反義鏈：5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCG-3′；CKM正義鏈：5′-AGAGTCCTGCTCCCTCACTC-3′，反義鏈：5′-AGGATGGAGCCCATTGGTTG-3′；CCL3正義鏈：5′-TGCCCTTGCTGTCCTCCTCTG-3′，反義鏈：5′-GGCTGCTCGTCTCAAAGTAGTCAG-3′；HNRNPH1正義鏈：5′-CAGTTCAGCGACCACGTTTG-3′，反義鏈：5′-CACCACGAATCCCTCTCCAC-3′；STAT1正義鏈：5′-TCTGTGTCTGAAGTTCACCCT-3′，反義鏈：5′-ACAGAGCCCACTATCCGAGA-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以對照組管家基因GAPDH為內(nèi)參照，采用△△Ct法計算目的基因相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。采用T檢驗和單向方差分析比較正態(tài)分布的測量數(shù)據(jù)，秩和檢驗比較非正態(tài)分布的測量數(shù)據(jù)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 細胞的IC50及耐藥性 KYSE150／L-OHP 細胞的IC50［（74.6 ±4.43）μmol／L］明顯高于KYSE150 細胞［（18.65 ±3.35）μmol／L］（t= 22.9，P＜0.01）。KYSE150／LOHP對L-OHP的耐藥指數(shù)為（4.0±1.35）。見圖1。

圖1 L-OHP 對KYSE150 和KYSE150／L-OHP 細胞的抑制率Fig.1 Inhibition rate of L-OHP on KYSE150 and KYSE-150／L-OHP cells

2.2 KYSE150／L-OHP 細胞的形態(tài)學變化 顯微鏡下觀察顯示，KYSE150 細胞形態(tài)清晰，呈梭形；與親代細胞相比，KYSE150／L-OHP 細胞大小不一，體積增大，形態(tài)不規(guī)則，個別細胞出現(xiàn)崩解、細胞核碎裂、固縮。見圖2。

圖2 KYSE150（A）和KYSE150／L-OHP（B）細胞形態(tài)的顯微鏡觀察（×200）Fig.2 Microscopy of cell morphology of KYSE150（A）and KYSE150／L-OHP（B）（×200）

2.3 KYSE150／L-OHP細胞侵襲／遷移能力的變化 與親本KYSE150細胞相比，耐藥細胞KYSE150／L-OHP的侵襲和遷移能力均顯著增強（t分別為25.49 和46.05，P均＜0.000 1），見圖3和表1。

表1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 細胞侵襲／遷移能力的差異（±s，n=3）Tab.1 Difference of cell invasion or migration ability of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP（±s，n=3）

表1 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 細胞侵襲／遷移能力的差異（±s，n=3）Tab.1 Difference of cell invasion or migration ability of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP（±s，n=3）

細胞KYSE150 KYSE1150／L-OHP侵襲細胞數(shù)61.67±2.73 164.3±2.96遷移細胞數(shù)102.7±1.45 263.7±3.18

圖3 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 細胞侵襲／遷移能力的比較（結(jié)晶紫染色，×200）Fig.3 Comparison of cell invasion or migration ability of KYSE150 and KYSE150／L-OHP（crystal violet staining，×200）

2.4 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差異表達基因篩選 為探索ESCC L-OHP 耐藥細胞的耐藥機制，對耐藥細胞及其親代細胞進行了全轉(zhuǎn)錄組測序并篩選差異表達基因。KYSE150 和KYSE150／L-OHP（分別對應(yīng)150NC 和150RS）miRNA 水平最終獲得45 個差異性表達基因，其中31 個基因在150RS 中表達上調(diào)，14 個基因在150RS 中表達下調(diào)，見圖4A；circRNA 水平最終獲得514 個差異性表達基因，其中229 個基因在150RS 中表達上調(diào)，285 個基因在150RS 中表達下調(diào)，見圖4B；LncRNA 水平最終獲得24 個差異性表達基因，其中21 個基因在150RS 中表達上調(diào)，3 個基因在150RS 中表達下調(diào)，見圖4C；mRNA 水平最終獲得408 個差異性表達基因，其中256 個基因在150RS 中表達上調(diào)，152 個基因在150RS中表達下調(diào)，見圖4D。

圖4 KYSE150和KYSE150／L-OHP差異基因表達火山圖Fig.4 Volcano map of differential gene expression of KYSE-150 and KYSE150／L-OHP

2.5 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差異表達基因KEGG 功能注釋 miRNA 水平差異表達基因顯著富集在磷脂酰肌醇、嘌呤代謝、PI3K／AKT／mTOR 和MAPK 等信號通路，見圖5A；circRNA 水平差異表達基因富集在轉(zhuǎn)錄水平、緊密連接、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、泛素介導的蛋白水解等相關(guān)信號通路，見圖5B；LncRNA 水平差異表達基因富集在趨化因子信號通路、溶酶體、細胞因子受體相互作用等相關(guān)信號通路，見圖5C；mRNA 水平差異表達基因富集在癌癥相關(guān)途徑、局灶性黏附信號通路、Hippo 信號通路、ECM-受體相互作用以及脂肪酸代謝等相關(guān)信號通路，見圖5D。

圖5 KYSE150和KYSE150／L-OHP差異表達基因KEGG注釋Fig.5 KEGG function annotation of differentially expressed genes of KYSE150 and KYSE150／L-OHP

2.6 KYSE150 和KYSE150／L-OHP 差異表達基因的驗證 5 個差異倍數(shù)相對較大的基因ACTG1、CKM、CCL3、HNRNPH1、STAT1均在L-OHP 耐藥細胞中高表達，其中CCL3、STAT1表達遠高于其他基因，差異有統(tǒng)計學意義（t分別為47.62 和7.47，P均＜0.001），見圖6。

圖6 KYSE150和KYSE150／L-OHP差異表達基因的RTPCR驗證Fig.6 RT-PCR verification of differentially expressed genes of KYSE150 and KYSE150／L-OHP

3 討論

由于ESCC 早期癥狀不明顯和缺乏早期診斷分子標志物，50%的患者確診時已處于中晚期，失去了最佳治療時機。部分患者只能給予局部放射治療或全身化學治療、靶向治療與免疫治療［10］。全身化學治療是大部分晚期ESCC患者的首選治療方式，但原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥往往導致治療失敗。因此，急需尋找特異性的分子標志物來預(yù)測ESCC 治療療效及是否耐藥，為ESCC的治療提供指導。

本研究建立ESCC L-OHP 耐藥細胞株后進行全轉(zhuǎn)錄本測序，通過差異表達基因篩選和通路富集進一步探索L-OHP耐藥的分子機制。根據(jù)差異表達基因篩選結(jié)合文獻發(fā)現(xiàn)，EBNA2 通過CCL3 和CCL4 介導的NF-κB 和Btk 激活來指導B 細胞淋巴瘤對阿霉素的耐藥性［11］。CCL3基因可能與癌癥耐藥相關(guān)，對細胞的增殖、侵襲、遷移等均有影響，并參與免疫應(yīng)答，可作為后續(xù)研究的靶分子。差異表達基因在KEGG數(shù)據(jù)庫功能注釋結(jié)果顯示，參與耐藥通路有P13KAkt、MAPK、Hippo 信號通路［12-14］。越來越多的證據(jù)表明，PI3K／AKT 途徑與癌細胞的耐藥性有關(guān)［15-17］。如WANG 等［18］證明，分泌型簇蛋白通過肝細胞癌中的Gadd45a／PI3K／Akt 信號通路介導L-OHP耐藥；LI 等［19］證明，ATXN2L 可由EGF 通過PI3K／Akt 信號傳導上調(diào)，促進細胞侵襲性和L-OHP 抗性；LIAO等［20］證明，正反饋激活CCN2-MAPK-Id1 信號能顯著促肝癌L-OHP 耐藥。Hippo 信號的失活使癌細胞對各種類型的癌癥化學治療藥物具有抗性。Hippo 信號通路在人類多種癌癥中均失調(diào)，且在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［21］。Hippo 途徑的失活將未磷酸化的YAP 入細胞核，誘導與細胞生長相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［22］。TFAP2C 通過轉(zhuǎn)錄激活Hippo 信號傳導的負調(diào)控因子ROCK1和ROCK2促進CSCs特征和化療耐藥，導致結(jié)腸直腸癌細胞中Hippo 信號的失活［23］。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了ESCC L-OHP耐藥細胞模型，并通過全轉(zhuǎn)錄本測序技術(shù)初步篩選出耐藥前后差異表達的基因，經(jīng)過通路富集及生物信息學分析，探討了耐藥可能發(fā)生的分子機制，為尋找L-OHP耐藥的新型分子標志物和治療靶點提供了思路。