宮 賀 孟鋆鈺 倫昕月 陳海霞 顏超華 鄭婧柔 蘇月芬 張 豪 賽春梅△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，日照 276826；2沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽 110016；3濰坊醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，濰坊 261053)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌的女性第4大常見癌癥[1]?！度虬┌Y報(bào)告》統(tǒng)計(jì)，2020年全球新增宮頸癌病例為604000例，死亡人數(shù)為342000人[2]。西醫(yī)對(duì)宮頸癌的一線治療手段包括手術(shù)或化療和放療的聯(lián)合應(yīng)用[3-4]，但此類方法療效低，副作用大，一旦復(fù)發(fā)往往無法治愈[5-6]。中醫(yī)藥在治療宮頸癌上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)將宮頸癌歸屬于“五色帶”“癥瘕”“陰瘡”等范疇[7]，具有豐富的臨床治療經(jīng)驗(yàn)，而中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，且療效好，副作用少[8]。

中國(guó)藥典記載徐長(zhǎng)卿(CynanchiPaniculati Radix et Rhizoma)為蘿藦科鵝絨藤屬植物徐長(zhǎng)卿(Cynanchumpaniculatum(Bge.) Kitag.)的干燥根和根莖，具有祛風(fēng)除濕止痛的功效[9]。徐長(zhǎng)卿作為臨床常用藥，其主要化學(xué)成分C21甾體類、菲并吲哚里西定類生物堿、揮發(fā)油和多糖類物質(zhì)，具有抗癌作用[10]，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管形成[11]，但其治療宮頸癌的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方法，初步探究徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和作用通路，為其后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 徐長(zhǎng)卿活性成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)獲取徐長(zhǎng)卿的所有活性成分，根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行篩選，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(Drug-like，DL)≥0.18為篩選依據(jù)[12]，獲得徐長(zhǎng)卿的有效活性成分。

1.2 徐長(zhǎng)卿活性成分作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用Pubchem平臺(tái)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取徐長(zhǎng)卿中篩選出的每個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)的Smiles號(hào)，以Smiles號(hào)為關(guān)鍵詞在以下2個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，限定篩選條件為Homo Sapiens，獲得徐長(zhǎng)卿活性成分作用靶點(diǎn)：1)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch)，選擇排名前15的靶點(diǎn)；2)Targetnet數(shù)據(jù)庫(http://targetnet.scbdd.com)，選擇Prob>0的靶點(diǎn)，再用Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)轉(zhuǎn)換基因名。

1.3 宮頸癌靶點(diǎn)的收集

以“Cervical Cancer”為關(guān)鍵詞在以下3個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，獲取宮頸癌靶點(diǎn)的相關(guān)信息：1)Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)，選擇Score>20的靶點(diǎn)；2)OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org)；3)TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)。

1.4 核心靶點(diǎn)的篩選

利用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)在線工具繪制徐長(zhǎng)卿有效活性成分靶點(diǎn)和宮頸癌作用靶點(diǎn)的韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)。

1.5 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析

通過String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)將篩選得到的徐長(zhǎng)卿有效活性成分與宮頸癌交集靶點(diǎn)蛋白的基因名上傳到該數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為Homo Sapiens，構(gòu)建蛋白─蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。以大于平均度值(Degree)為篩選條件，選擇徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 KEGG信號(hào)通路及GO通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org)對(duì)交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析和GO通路富集分析。物種選擇H.Sapiens，進(jìn)行Custom Analysis，在下屬Enrichment Analysis工具中的列表中分別進(jìn)行KEGG Pathway、GO Molecular Functions、GO Biological Processes和GO Cellular Components分析，獲取KEGG數(shù)據(jù)及GO數(shù)據(jù)。通過微生信在線工具(www.bioinformatics.com.cn)將KEGG數(shù)據(jù)及GO數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，繪制KEGG通路富集氣泡圖和GO細(xì)胞組分、分子功能、生物過程三合一圖。

2 結(jié)果

2.1 徐長(zhǎng)卿活性成分

將TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取得到的徐長(zhǎng)卿活性成分，以O(shè)B和DL值篩選，共得到6個(gè)化合物，分別為Tomentolide A、cynapanoside C、cynatratoside B、sitosterol、sarcostin和tomentogenin。見表1。

表1 徐長(zhǎng)卿活性成分

2.2 徐長(zhǎng)卿活性成分靶點(diǎn)與宮頸癌靶點(diǎn)的挖掘

檢索Swiss Target Prediction和Targetnet在線數(shù)據(jù)庫共得到徐長(zhǎng)卿活性成分的靶點(diǎn)共188個(gè)。檢索Genecards、OMIM、TTD 3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫共得到1014個(gè)宮頸癌的相關(guān)靶點(diǎn)。將上述數(shù)據(jù)利用Venny圖得到24個(gè)交集靶點(diǎn)(圖1)，主要包括JUN、MMP2、AURKA、MET、AR、DNMT1等(表2)。

圖1 徐長(zhǎng)卿與宮頸癌交集基因

表2 徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌相關(guān)靶點(diǎn)

2.3 徐長(zhǎng)卿—活性成分—靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建徐長(zhǎng)卿─活性成分─靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，得到了1個(gè)包括31個(gè)點(diǎn)和50條邊的網(wǎng)絡(luò)(圖2)。圖中藍(lán)色部分代表徐長(zhǎng)卿，綠色部分代表有效成分，黃色部分代表靶點(diǎn)名稱。依據(jù)有效成分與靶點(diǎn)交集數(shù)量由大到小排名，分別為14、8、6、6、5、5，對(duì)應(yīng)的有效成分依次是Tomentolide A、cynatratoside B、cynapanoside C、tomentogenin、sarcostion、sitosterol。

圖2 徐長(zhǎng)卿—活性成分—靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白—蛋白相互作用

將徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌相關(guān)的24個(gè)交集靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，得到蛋白─蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。利用Cytoscape軟件分析網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示該網(wǎng)絡(luò)圖包含22個(gè)點(diǎn)，144條邊，平均Degree值為10.36，平均局部聚類系數(shù)0.777。以大于Degree平均值為篩選條件，共選出8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為EGFR、ESR1、JUN、MTOR、PTGS2、PIK3CA、AR、PGR。

圖3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG信號(hào)通路和GO通路富集分析

KEGG通路富集分析中主要涉及的通路有Pathways in cancer、Endocrine resistance、Estrogen signaling pathway、Breast cancer等信號(hào)通路(圖4)，其中排名最高的Pathways in cancer通路，利用KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫進(jìn)行解讀，得到圖5。GO富集分析結(jié)果顯示，Biological Processes分析主要包括gland development、tube morphogenesis、reproductive structure development等； Cellular Components分析主要包括membrane raft、membrane microdomain、organelle outer membrane等；Molecular Functions分析主要包括protein serine/threonine/tyrosine kinase activity、protein kinase activity、phosphotransferase activity,alcohol group as acceptor等(圖6)。

圖4 徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌靶點(diǎn)的KEGG通路分析

圖5 徐長(zhǎng)卿交集靶點(diǎn)與Pathways in cancer通路

圖6 徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌靶點(diǎn)的GO分析

2.6 分子對(duì)接

基于已有數(shù)據(jù)，選擇與靶點(diǎn)交集數(shù)量較多的有效成分Tomentolide A和cynatratoside B(圖7)，與徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白核心結(jié)構(gòu)的pdb文件下載自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(https://www.rcsb.org)[13]：EGFR[5UG9(PDB ID,下同)]、ESR1(7NFW)、JUN(5T01)、MTOR(5WBH)、PTGS2(5IKR)、PIK3CA(7L1C)、AR(4OHA)、PGR(1SQN)。由Chem3D 20.0.0.41軟件畫出Tomentolide A和cynatratoside B的分子3D結(jié)構(gòu)圖，使用OpenBabel 3.1.1軟件轉(zhuǎn)換小分子與蛋白文件格式，利用AutoDockTools 1.5.7軟件進(jìn)行分子對(duì)接，并用PyMol 2.5.0軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析。分子對(duì)接最低結(jié)合能數(shù)據(jù)如表3所示，利用最低結(jié)合能的絕對(duì)值作雷達(dá)圖進(jìn)行可視化分析(圖8)。當(dāng)結(jié)合能≤-5 kcal/mol時(shí)判定有效成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合較為穩(wěn)定[14]，發(fā)現(xiàn)Tomentolide A和cynatratoside B分別與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、雄激素受體(AR)的對(duì)接最穩(wěn)定，充分說明了徐長(zhǎng)卿對(duì)宮頸癌的穩(wěn)定作用。對(duì)接結(jié)果見分子蛋白對(duì)接模擬圖(圖9)和對(duì)接口袋結(jié)構(gòu)圖(圖10)。

注：A.Tomentolide A；B.cynatratoside B

圖8 分子對(duì)接數(shù)據(jù)雷達(dá)圖

注：A.EGFR與Tomentolide A在MET-793位點(diǎn)結(jié)合；B.EGFR與 cynatratoside B在GLY-917、LYS-879位點(diǎn)結(jié)合；C.AR與Tomentolide A在GLU-683位點(diǎn)結(jié)合；D.AR與cynatratoside B在GLN-733、LYS-720、HIS-714、GLY-683位點(diǎn)結(jié)合

注：A.EGFR與Tomentolide A；B.EGFR與 cynatratoside B； C.AR與Tomentolide A；D.AR與cynatratoside B

表3 最低結(jié)合自由能(kcal/mol)

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，整體評(píng)價(jià)了徐長(zhǎng)卿與宮頸癌的相互作用關(guān)系，預(yù)測(cè)了徐長(zhǎng)卿作用于宮頸癌的分子機(jī)制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選發(fā)現(xiàn)徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的主要活性成分包括Tomentolide A、cynapanoside C、cynatratoside B、sitosterol、sarcostin和tomentogenin，并交集得到24個(gè)與宮頸癌相關(guān)的徐長(zhǎng)卿的作用靶點(diǎn)。通過String在線數(shù)據(jù)平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出8個(gè)相互作用度較高的關(guān)鍵靶點(diǎn)，分別為EGFR、ESR1、JUN、MTOR、PTGS2、PIK3CA、AR、PGR。其中EGFR的擴(kuò)增、缺失、突變和過表達(dá)激活酪氨酸激酶，會(huì)啟動(dòng)一系列下游信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)展[15-16]。有研究表明，PIK3CA激酶活性的增強(qiáng)導(dǎo)致PI3K/AKT/MTOR信號(hào)通路的激活[17-19]，其中MTOR起到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的作用，是細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞代謝和增殖中發(fā)揮重要作用[20]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在從健康的宮頸組織到癌變的宮頸組織發(fā)展過程中，AR的表達(dá)逐漸降低，加劇了宮頸癌細(xì)胞的增殖與侵襲[21]。這提示徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的機(jī)制可能與抑制腫瘤發(fā)展和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡最為相關(guān)。

KEGG信號(hào)通路富集分析表明Pathways in cancer通路與徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌最為相關(guān)，其中EGFR蛋白引起了筆者關(guān)注，作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，目前已成為腫瘤治療中不可缺少的靶點(diǎn)[22]。如圖5所示，以EGFR為起始靶點(diǎn)的PI3K/AKT/MTOR和Ras/Raf/MEK/ERK兩條信號(hào)通路[23-24]，可能是徐長(zhǎng)卿發(fā)揮治療作用的重要通路。PI3K/AKT/MTOR通路在腫瘤發(fā)展中具有控制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和凋亡功能[25]，在宮頸癌組織中PI3K/AKT/MTOR基因及蛋白水平隨著癌癥惡性程度的增加而升高[26]。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，化療耐藥和靶向治療敏感性方面發(fā)揮重要作用，抑制此信號(hào)通路的異常激活是降低癌細(xì)胞增殖的一種治療方式[27]。這兩條信號(hào)通路均與宮頸癌密切相關(guān)[28-30]，這為我們深入探討徐長(zhǎng)卿抗癌的藥理作用提供了思路。

通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)，腺體發(fā)育(gland development)通路在Biological Processes中富集較高，F(xiàn)an等[21]發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α(ERα)和雄激素受體(AR)的過表達(dá)會(huì)顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與侵襲，這提示腺體發(fā)育水平對(duì)激素分泌的影響可能與宮頸癌的發(fā)展有關(guān)。此外，Molecular Functions高富集的蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性(protein serine / threonine / tyrosine kinase activity)通路也進(jìn)一步佐證了PI3K/AKT/MTOR通路與徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的相關(guān)性，因?yàn)镸TOR具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶的作用，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和蛋白質(zhì)的合成，自噬和轉(zhuǎn)錄[31-32]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選得到徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)，并利用分子對(duì)接的分析方法，驗(yàn)證了徐長(zhǎng)卿對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用方式?；谕犯患治?，發(fā)現(xiàn)徐長(zhǎng)卿可能通過抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到治療宮頸癌的作用。目前本課題組正在進(jìn)行徐長(zhǎng)卿抗腫瘤活性成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定，本研究后續(xù)將進(jìn)行蛋白水平實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[33]，進(jìn)一步驗(yàn)證其治療宮頸癌的作用機(jī)制，從而明確徐長(zhǎng)卿治療宮頸癌的藥理作用。

利益沖突：所有作者均申明不存在利益沖突。