蔣澤元，盧俊義，張丹丹，黃思琪，宋靜，翁凌云，鄭榮泉,3*，田葦

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004； 2.浙江省野生動物生物技術(shù)與保護利用重點實驗室，浙江 金華 321004；3.浙江師范大學 行知學院，浙江 金華 321100； 4.貴州黔東南橋水農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司，貴州 黔東南 556000)

棘胸蛙俗稱石蛙、石雞等，隸屬于兩棲綱，無尾目，叉舌蛙科，棘胸蛙屬，主要分布在我國的云貴、華南、華東等長江以南地區(qū)[1]。

由于棘胸蛙是我國叉舌蛙科物種中資源利用最廣泛的物種之一，同時兼具食用和藥用價值，因此，棘胸蛙遺傳特征及生長發(fā)育條件的相關(guān)研究已經(jīng)成為學者們關(guān)注的熱點。利用線粒體及微衛(wèi)星基因標記對棘胸蛙13個地理種群進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生棘胸蛙可分為4個不同的進化支系，并認為棘胸蛙可能是一種未發(fā)現(xiàn)形態(tài)變異的物種復合體[2-4]。在宏觀特征上，不同地理種群棘胸蛙的鳴聲[5]、熱偏好性[6]、形態(tài)大小[7-9]都存在著顯著差異，且不同地理種群的棘胸蛙在熱偏好性以及形態(tài)大小上與緯度相關(guān)[5-6]。本研究旨在分析不同支系棘胸蛙的環(huán)境數(shù)據(jù)與其形態(tài)指標之間的關(guān)系，以期尋找棘胸蛙支系分化與溫度適應方面的聯(lián)系，同時也為棘胸蛙規(guī)模化養(yǎng)殖和品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與數(shù)據(jù)采集

2019年6—9月份在韶關(guān)、南昌、鷹潭、池州、黃山、龍巖、德化、遵義共8個樣地采集二齡性成熟雄性棘胸蛙各15只。采集樣品的環(huán)境一般為靜水的池塘或溪流的緩流處，且均為健康活潑成體。采集的棘胸蛙在實驗室條件下馴養(yǎng)待用。

依據(jù)費梁等[10]和Watters等[11]的測量標準，利用電子數(shù)顯游標卡尺(精度0.01 mm)測定了所有樣本的16個形態(tài)特征性狀。所有形態(tài)參數(shù)測量所用樣本均為活體，形態(tài)學指標均參考《中國動物志》[12]。

1.2 環(huán)境因子數(shù)據(jù)收集

結(jié)合中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)以及樣地野外溫濕度記錄儀的數(shù)據(jù)，對8個樣地的12個環(huán)境因子進行收集。通過多維變量的降維分析，推斷出影響棘胸蛙適應性進化的主導因子。

1.3 不同地理種群棘胸蛙形態(tài)分化

為消除樣本個體年齡差異對貢獻值分析結(jié)果的影響，本研究中采用棘胸蛙各形態(tài)指標數(shù)據(jù)與體長的比值為變量進行主成分分析，結(jié)果共得到15個特征變量，提取變量的主成分，并計算各主成分的特征值和貢獻率，最后基于主成分得分值做散點圖。

通過逐步法對8個地理種群棘胸蛙的形態(tài)數(shù)據(jù)進行判別式分析，從而探討棘胸蛙不同地理種群間形態(tài)差異情況。逐步判別刪除或保留變量是由變量的F值決定，當F值大于Entry默認值3.84時，該變量就會進入模型；當變量的F值小于默認的Removal值2.71時，該變量就會從模型中剔除。利用SPSS 21.0計算所測量形態(tài)數(shù)據(jù)的特征值、典型相關(guān)系數(shù)、Wilks’λ和非標準化系數(shù)，并根據(jù)判別系數(shù)計算各種群棘胸蛙的判別函數(shù)，最后利用判別函數(shù)的得分值繪制散點圖。樣本的歸屬判別則是通過馬氏距離判斷，馬氏距離指每個樣本在圖中的位置到每個分組組心的距離，樣本到哪個分組組心的馬氏距離最短，該樣本則被判為該組。利用交互檢驗方法檢驗判別函數(shù)的正確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學指標

通過對8個地理種群的形態(tài)學數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，描述性統(tǒng)計結(jié)果以平均數(shù)±標準差(Mean±SD)形式標出，結(jié)果見表1。

表1 不同地理種群棘胸蛙形態(tài)特征的描述性統(tǒng)計值

2.2 主成分分析

對15個形態(tài)指標量度與體長的比值進行主成分分析，分析顯示，數(shù)據(jù)的KMO值為0.926，Barttlett’s球形檢驗拒絕零假設，變量之間存在相關(guān)性，可以進行主成分分析。前3個主成分的特征根分別為7.467、1.241和1.02，貢獻率分別為49.781%、8.271%和6.802%。3個主成分的累積貢獻率為64.854%，涵蓋了全部數(shù)據(jù)的大部分信息，所以，我們只對前3個主成分進行分析。3個主成分因子負荷值見表2。依據(jù)所得的第一主成分和第二主成分得分值繪制PCA散點圖(圖1中A)，結(jié)果顯示，不同地理種群的棘胸蛙在散點圖上明顯可分為2個組。而黃山、德化、鷹潭等種群樣本差異不大。在PC2軸上，廣東韶關(guān)的棘胸蛙樣本特征指標值范圍大于其他地理種群，說明在吻長/體長、鼻間距/體長、眼間距/體長和眼瞼寬/體長等與頭部橫向形態(tài)量度相關(guān)的特征上，廣東韶關(guān)樣本多樣性較高。

表2 棘胸蛙外部可量度性狀主成分分析的因子負荷值

A—不同地區(qū)棘胸蛙外形數(shù)據(jù)聚類分析；DH—德化；NC—南昌；YT—鷹潭；SG—韶關(guān)；LY—龍巖；HS—黃山；CZ—池州；ZY—遵義；B—不同地區(qū)棘胸蛙外形數(shù)據(jù)判別分析散點。圖1 不同地區(qū)棘胸蛙分子形態(tài)與身體形態(tài)分析

2.3 判別式分析

對親緣關(guān)系較遠的物種，傳統(tǒng)意義上的測量及計算就能得到有效的鑒別特征描述，然而對于表型特征相近或者相似的物種，傳統(tǒng)的分類方法無法鑒定分類。聚類分析可以量化相似個體的細微差異，因此，能夠用來作物種初步鑒別歸類的依據(jù)，因而該方法在相似程度較大的物種辨別分析中應用廣泛。本研究中對15個樣本形態(tài)指標與體長的比值進行聚類分析(圖1中A)，顯示各地區(qū)間無明顯差異。進一步對15個形態(tài)指標量度與體長的比值進行對數(shù)變換的逐步判別分析，其中頭長/體長，鼻間距/體長，眼徑/體長，脛寬/體長，吻長/體長，手長/體長和跗褶長/體長7個指標對判別貢獻率較高，被選擇進入函數(shù)。使用7個性狀的特征值建立了不同地理種群棘胸蛙的判別函數(shù)。其中，函數(shù)式中的X1至X7分別代表上述7個判別貢獻率高的性狀。8個地理種群的判別公式如下：

安徽池州地理種群：Y=-52.83+48.62X1+63.53X2+117.03X3-60.80X4+56.57X5+195.97X6+

111.42X7；

安徽黃山地理種群：Y=-58.43+82.80X1+18.86X2+79.93X3+66.01X4+122.35X5+103.07X6+

88.19X7；

福建德化地理種群：Y=-51.20+23.91X1-18.78X2+90.12X3+129.19X4+157.17X5+113.07X6+

57.05X7；

江西鷹譚地理種群：Y=-55.61+93.26X1-36.12X2-29.96X3+125.12X4+132.35X5+130.72X6+

52.45X7；

江西南昌地理種群：Y=-57.96+59.20X1-55.82X2+102.00X3+229.08X4+113.72X5+109.29X6+

66.97X7；

福建龍巖地理種群：Y=-63.21+14.27X1+11.32X2+192.80X3+120.05X4+98.33X5+166.24X6+

97.16X7；

廣東韶關(guān)地理種群：Y=-61.74+66.73X1-53.26X2+101.01X3+158.56X4+99.42X5+153.76X6+

94.27X7；

貴州遵義地理種群：Y=-61.90+49.47X1+12.10X2-59.65X3+174.65X4+126.10X5+152.69X6+

103.64X7。

依據(jù)判別函數(shù)的得分值分別作為X軸和Y軸，繪制不同地理種群棘胸蛙外形數(shù)據(jù)判別分析的散點圖(圖1中B)。依據(jù)各個樣本中心到各組中心的馬氏距離長短來判別樣本組別，樣本到哪組組心的馬氏距離最短，該樣本則被判為該組。判別分析散點圖顯示，8個不同地理種群的棘胸蛙樣本被區(qū)分為三組，通過主成分分析對8個地理種群棘胸蛙進行了形態(tài)上相似性和差異性的分析和比對，在判別分析散點圖中(圖1中B)，遵義地區(qū)一組，德化、龍巖、鷹潭、韶關(guān)、南昌、黃山地區(qū)一組，池州地區(qū)一組。結(jié)果說明，這三組地理種群的棘胸蛙在形態(tài)學度量數(shù)據(jù)上存在較大差異。

2.4 環(huán)境因子與形態(tài)特征

6種主要環(huán)境因子分別與棘胸蛙各形態(tài)特征相關(guān)性分析的結(jié)果表明，手長與體長的比值與溫度因子呈顯著正相關(guān)，與年均降水因子、氣壓因子、緯度因子呈顯著負相關(guān)；眼徑與體長的比值與溫度因子呈顯著正相關(guān)，與年均降水因子、緯度因子呈顯著負相關(guān)；跗褶長與體長的比值與經(jīng)度因子呈極顯著負相關(guān)(表3)。

表3 環(huán)境因子與形態(tài)特征的關(guān)系

3 小結(jié)與討論

形態(tài)學方法是最早進行物種分類的基本方法之一，在兩棲動物的物種分化及新種界定研究中應用廣泛，例如早在1991年，魏剛等[13]就通過脛長與體長的比例，頭長與頭寬等形態(tài)特征的比較，將不同地理種群的中國林蛙進行區(qū)分及定種。費梁等[14]在中國西北地區(qū)中國林蛙各居群的分類學研

究中發(fā)現(xiàn)，中國林蛙與高原林蛙后肢與體長之比存在顯著性差異，因此，將該特征作為高原林蛙的鑒別特征之一。費梁等[15]對分布于廣西龍勝和湖南宜章的龍勝臭蛙作了對比分析，發(fā)現(xiàn)分布于湖南宜章的龍勝臭蛙前臂寬與體長之比與龍勝種群產(chǎn)生了顯著性差異，因此，將其命名為宜章臭蛙。本研究中，不同地理種群棘胸蛙形態(tài)特征存在顯著的分化，其中安徽池州種群棘胸蛙的形態(tài)特征最為清晰穩(wěn)定，江西南昌、福建龍巖可能處于種群形態(tài)分化的過渡帶，安徽池州與其他地理種群的棘胸蛙形態(tài)分化最為明顯，尤其是與貴州遵義種群形態(tài)差異顯著，已達到種間可區(qū)分的水平。

生態(tài)過渡帶中棲息地的多樣性形成了各種各樣的生物形式，然后形成了帶有可以遺傳的多種生物物種。環(huán)境梯度變化產(chǎn)生形態(tài)變異、交配方式變異，生殖隔離通常經(jīng)歷生態(tài)過渡帶的演化并保持[16]。不同棲息地選擇比地理隔離更能引起適應性形態(tài)分化。依賴棲息地的選擇影響一些具有生態(tài)意義的特征，形成形態(tài)和行為分化，這些分化特征促進了相應的交配，從而建立沿著環(huán)境梯度的遺傳分化的機制[17]。近年來隨著全球氣候的變化，兩棲類的物種或種群數(shù)量受到嚴重威脅，了解環(huán)境因素對群落成員的影響是確定物種在空間中分布方式的重要部分[18]。從環(huán)境因素的角度解釋物種的地理布局模式，可以對物種在其分布區(qū)域的適應機制提供見解，同時通過整合環(huán)境和生態(tài)變量，可以更好地解釋物種分布格局[19]。例如，Amador等[20]研究了空間和環(huán)境因素對南美洲兩棲動物物種分布格局的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降水和海拔對保持當?shù)貎蓷珓游镂锓N多樣性起著關(guān)鍵的作用。在中國林蛙中發(fā)現(xiàn)，體型及四肢隨著緯度的增加、溫度的降低而逐漸增長[21]。生活于溫度較低的高海拔紅瘰疣螈，會增長四肢及頭部以獲取更多的食物[22]。在本研究中探究了不同支系棘胸蛙形態(tài)特征與環(huán)境因子間的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示，與個體大小相關(guān)的形態(tài)特征與當?shù)丨h(huán)境溫度呈現(xiàn)明顯負相關(guān)，即生活于溫度更高的較低緯度棘胸蛙顯示出前肢更長，眼徑更大，從而其整體體形偏大的趨勢，該趨勢符合“初級生產(chǎn)力假說”。同時棘胸蛙作為叉舌蛙科資源利用最廣泛的類群之一，早期對其生物學特征地理變異的研究已較為普遍，比如，體形大小、鳴聲、性二態(tài)性、熱生理學特征等，本文中僅探討了棘胸蛙形態(tài)特征與環(huán)境因子間的相關(guān)關(guān)系，對于闡述其適應性進化的問題研究還不夠全面，因此，對于棘胸蛙適應性分化及其影響因子的研究需要進一步增加綜合特征指標及環(huán)境因子種類并使用更科學的分析方法。