鄭善堅，胡金春，葉霆，史文競，于瑾

(1.浙江師范大學，浙江 金華 321004； 2.衢州市水產(chǎn)技術推廣中心，浙江 衢州 324000；3.龍游縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心，浙江 龍游 324400)

草魚(Ctenopharyngodonidella)是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的淡水魚類，2019年產(chǎn)量達到553.3萬t(2020中國漁業(yè)年鑒)。草魚耐粗飼，生長速度快，肉質(zhì)細嫩，具有極高的經(jīng)濟價值。但隨著草魚養(yǎng)殖密度提高，受水質(zhì)、飼料質(zhì)量及種質(zhì)退化等影響，草魚病害問題突出，造成巨大的經(jīng)濟損失。

研究表明，單一或復方的中草藥內(nèi)服等可以提高水產(chǎn)動物抵御外界不良環(huán)境的能力，可促進水產(chǎn)動物的非特異性免疫指標的提高，增強其免疫機能，提高水產(chǎn)動物生存能力[1]。田照輝等[2]將由植物多糖、益生素、寡糖和天然分子篩等成分有機結合成的復方中草藥制劑在飼料中添加1%飼喂，顯著降低了草魚的病害發(fā)生率和死亡率。植物多糖、益生素和寡糖還能調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)環(huán)境，增加消化酶的分泌，促進動物生長，增強機體免疫力和抗病力[3-6]。本試驗通過篩選復方中草藥制劑，研究其在不同拌喂策略時對草魚血清免疫活性影響，以期為草魚的健康養(yǎng)殖提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用草魚來自于浙江龍和水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司，草魚體質(zhì)健壯，外表無傷，規(guī)格為(162.04±7.31)g，經(jīng)室內(nèi)循環(huán)流水暫養(yǎng)7 d后開始試驗。

1.2 復方中草藥制劑組成

使用的復方中草藥制劑主要由郁金、五味子、甘草、黃芪多糖等組成，使用前與草魚飼料(通威飼料182，蛋白28%)按1%的添加比例制成粒徑約2.0 mm的飼料顆粒，避光風干備用。

1.3 處理設計

試驗以未添加復方中草藥制劑的實驗初始草魚為對照(SⅠ)；設計4個試驗組，分別為持續(xù)拌喂復方中草藥制劑7 d組(SⅡ)，持續(xù)拌喂復方中草藥制劑14 d組(SⅢ)，拌喂7 d后停7 d組(SⅣ)及拌喂7 d后停14 d組(SⅤ)，每個試驗組設3個重復。試驗在養(yǎng)殖桶(直徑1 m，水位0.5 m)內(nèi)進行，每桶放養(yǎng)10尾試驗草魚；每日19：00投喂1次，投餌率為魚體重的2%；試驗期間水溫為26～32 ℃，溶解氧保持在6 mg·L-1以上，pH為7.8±0.1。

1.4 指標測定與分析

1.4.1 血液生化指標測定

隨機選取3尾魚進行尾靜脈采血，室溫自然凝固20 min后，3 000 r·min-1室溫離心20 min取上清液，-20 ℃保存，用于血液生化指標測定。SOD采用WST-1法測定，MDA采用TBA法，使用試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 血液中免疫相關基因MHCⅠ的表達量分析

草魚MHCⅠ基因引物F：5′-GATCCCTCCTCTC CAGTGACG-3′，R：5′-GTCCTCATTGGGAAGAAGTTCA-3′，委托上海生工合成。取試驗草魚血液樣品300 μL，RNA提取試劑盒提取總RNA，按照cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書要求進行mRNA反轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA模板置于qRT-PCR反應體系中，經(jīng)過6 000 r·min-1離心后，置于ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀，以95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)為擴增程序；β-actin(登錄號：DQ211096.1)為內(nèi)參基因，每孔3個技術重復。采用2-ΔΔCt法分別計算MHCⅠ免疫基因在血液中的相對表達量，重復做3次獨立反應。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，使用Shapiro-Wilk和Levene檢驗進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差同質(zhì)性分析，利用方差分析(ANOVA)檢驗各組之間的顯著性，并用Duncan’s法進行多重分析，P<0.05為差異顯著。結果以平均值±標準誤(Mean±SE)來表示。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥制劑對草魚免疫活性的影響

由圖1可知，使用復方中草藥制劑后的試驗組草魚SOD活性均顯著高于對照組，除SⅣ組和SⅤ組之間無顯著性差異外，其余各組間差異顯著。草魚SOD活性依次是SⅡ組>SⅢ組>SⅣ組>SⅤ組>對照組；試驗組草魚血液MDA含量和對照組無顯著性差異。

同一指標不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 復方中草藥制劑對草魚免疫活性的影響

2.2 復方中草藥制劑對草魚免疫基因MHCⅠ表達量的影響

由表1可知，使用復方中草藥制劑后試驗組草魚SⅢ的MHCⅠ免疫基因的相對表達量顯著高于其他組，其他各組之間無顯著性差異。

表1 抗應激劑對草魚免疫基因MHC Ⅰ 表達量的影響

3 討論

3.1 復方中草藥制劑對草魚非特異性免疫功能的影響

SOD是魚體非特異性免疫功能的重要指標。SOD可以幫助魚體清除自由基，對增強吞噬細胞的防御能力和機體的免疫功能具有重要作用[7]。試驗發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加1%的復方中草藥制劑可以顯著提高草魚血清中SOD活性。其中，添加1%復方中草藥制劑持續(xù)拌喂7 d時草魚的SOD活性最高，其次是持續(xù)拌喂14 d時的草魚，然后是拌7 d停7 d和拌7 d停14 d時的草魚。李赫等[8]發(fā)現(xiàn)投喂含黃芪多糖、枸杞多糖和金絲桃素的飼料使草魚血清SOD活性顯著高于對照組。本試驗用的復方中草藥制劑含有黃芪多糖、姜黃等，被證明具有增強機體免疫機能，能不同程度地提高草魚血清的SOD活性。研究也發(fā)現(xiàn)，持續(xù)拌喂復方中草藥制劑14 d時草魚血清SOD活性較持續(xù)拌喂7 d時反而下降，分析原因可能是持續(xù)拌喂復方中草藥制劑造成了草魚的免疫疲勞。這與Lin等[9]認為,長期口服復方中草藥制劑會降低魚類免疫水平的結果一致。姚嘉赟等[10]在研究3種免疫增強劑(黃芪、參芪和酵母)對黃顙魚血清中SOD活性的影響中發(fā)現(xiàn)，各試驗組的血清SOD活性在7 d達到峰值，此后呈降低趨勢，與本研究的結果類似。

本研究發(fā)現(xiàn)，添加復方中草藥制劑草魚血清的MDA含量與對照差異不顯著。MDA是細胞氧化代謝產(chǎn)物之一，其含量的高低可以反映機體細胞受到自由基攻擊的程度。當生物體內(nèi)的氧化脅迫超過生物體自身抗氧化防御系統(tǒng)的保護能力時，就不可避免地對生物體造成毒害[11]。徐軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當草魚受到臭氧的脅迫時，其血清中的MDA含量會升高，脅迫解除時，MDA含量的水平會恢復至正常水平。本研究草魚血清中的MDA含量未見顯著性差異，推測可能是由于本試驗草魚并未受到外來脅迫，因此,變化并不明顯。

3.2 復方中草藥制劑對草魚MHCⅠ免疫基因的影響

主要組織相容性復合體(MHC)在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，通過編碼抗原識別蛋白激發(fā)機體特異性免疫反應。MHCⅠ類分子主要是呈遞內(nèi)源性抗原多肽，與處理后的多肽結合形成復合體，并激活細胞毒性T細胞(CD8+)，使T細胞進行細胞免疫[13]。吳凡等[14]檢測草魚在嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染后的MHCⅠ區(qū)部分免疫基因表達量發(fā)現(xiàn)，BRD2、MHCⅠa、PSMB9、TAP2的表達量在攻毒后都有顯著性變化，表明這4個基因在草魚免疫方面具有重要的作用。許友卿等[15]發(fā)現(xiàn),在飼料中添加5.0%和7.5%杜仲葉粉組使青魚腎組織中MHCⅠ基因表達顯著高于對照組，添加2.5%杜仲葉粉組相比于對照組無顯著差異。本研究中1%復方中草藥制劑持續(xù)拌喂14 d，草魚血清中MHCⅠ免疫基因的表達量有顯著提升，其他試驗組與對照組無顯著性差異。說明1%復方中草藥制劑具有調(diào)節(jié)免疫基因的功能，但需要一定的持續(xù)時間。

3.3 復方中草藥制劑的作用機制

本試驗的復方中草藥制劑主要組成為郁金、五味子、甘草、黃芪多糖等。其中郁金含有揮發(fā)油和姜黃素，具有行氣解郁、清心涼血、利膽退黃等功效[16]，姜黃素能夠顯著提高羅非魚的SOD活性，增強機體免疫力，促進腸道組織發(fā)育[17]；五味子具有降血脂和舒張血管的心血管保護作用，具有抗氧化和免疫活性[18]；甘草中的甘草多糖可對特異性免疫、非特異性免疫有正向調(diào)節(jié)作用，可以提高異育銀鯽上清中GSH-Px和SOD活力以及抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的生成來減輕對肝細胞的損傷；黃芪多糖則具有增強機體免疫功能、抗病毒、抗氧化等多種藥理功效。黃芪多糖可使小鼠血清中IgA、IgG、IgM的含量顯著提高；還可刺激T、B淋巴細胞、抗體分泌細胞及自然殺傷細胞，使其活力增強[19]。復方中草藥制劑通過綜合調(diào)節(jié)動物機體的特異性與非特異性免疫，參與草魚的免疫保護。