任晉東，牛寶龍，樓寶

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是世界上最大形的淡水蝦之一。原產(chǎn)于印度洋-太平洋熱帶地區(qū)，自1976年引入我國后，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴大，市場需求不斷上升，目前已成為我國重要的經(jīng)濟淡水蝦類，年均總產(chǎn)值達到80多億元[1]。羅氏沼蝦的性別決定屬于ZW型，雌雄個體表型差異較大，雄性個體體形較大，在生長速度、抗病性等方面都有著顯著的優(yōu)勢[2]，因此，利用生物技術(shù)探索羅氏沼蝦性別決定機理，對培育羅氏沼蝦單性群體具有重要的意義。但由于羅氏沼蝦細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)體系的缺乏，目前常用的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)染進行基因功能研究的方法在甲殼類動物上效率較低[2-3]，探索有效的外源基因表達體系是羅氏沼蝦發(fā)育、繁殖等分子遺傳機理研究的基礎(chǔ)。

已有相關(guān)研究表明，慢病毒表達體系能夠攜帶外源基因進入對蝦體內(nèi)進行表達[4]，也有研究進行精子介導(dǎo)的CMV啟動子表達質(zhì)粒能夠整合到羅氏沼蝦體內(nèi)基因組中[5]，但該研究未進行表達效果驗證研究。在蝦類疾病-白斑病毒研究過程中，發(fā)現(xiàn)其囊膜蛋白VP28啟動子IE1在蝦類體內(nèi)具有較強的促轉(zhuǎn)錄表達作用[6]，節(jié)肢類動物家蠶上同名的IE1啟動子也有較好的促轉(zhuǎn)錄表達效果，但是表達效率不如融合了hr5增強子的IE1轉(zhuǎn)錄活性強[7]，而目前關(guān)于羅氏沼蝦的外源基因高效表達啟動子效果的研究尚未有報道。

因此，本文利用當(dāng)前常用啟動子為研究對象構(gòu)建表達載體，進行活體注射，并通過熒光報告基因和基因轉(zhuǎn)錄相對表達量來探索不同啟動子在羅氏沼蝦活體的表達效率，為羅氏沼蝦開展基因功能驗證研究提供有效的分子工具。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建分別包含hr5-IE1、IE1、SV40啟動子和下游表達基因eGFP及終止信號的表達質(zhì)粒(圖1)。

圖1 不同啟動表達質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

1.2 活體注射

按照構(gòu)建的啟動子質(zhì)粒分3個組別和1個對照組，每組選擇6只體重為5～7 g的羅氏沼蝦個體注射表達質(zhì)粒，對照組注射同樣體積的PBS作為參照。注射部位選擇頭胸甲與后驅(qū)間的肌肉組織，注射量為每克體重1 μg的DNA濃度標(biāo)準(zhǔn)進行注射，注射12 h后采集所有個體肌肉組織，并立即置于液氮中用于后續(xù)分析。

1.3 組織熒光檢測及定量分析

利用綠色熒光燈在黑色背景下檢測各個組別樣品的熒光特性。利用全式金Trizol UP試劑盒，提取各樣品總RNA。并利用諾唯贊RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄合格RNA樣品，20 μL體系添加總RNA量控制在1 μg以內(nèi)。

以β-Actin基因為內(nèi)參基因，對eGFP基因表達量進行qPCR定量分析，qPCR引物序列如表1所示。按照10 μL 2×Mix buffer，2 μL Primer-F，2 μL Primer-R，2 μL cDNA和4 μL高純水配制成20 μL的qPCR反應(yīng)體系，利用Bio-Rad的CFX96型qPCR儀進行所有樣品的兩步法定量反應(yīng)，程序運行結(jié)束記錄所有樣品β-Actin和eGFP基因Ct值用于后續(xù)統(tǒng)計分析。

表1 基因表達量qPCR用引物的序列

1.4 相對表達量統(tǒng)計分析

利用各樣品測定的eGFP和β-Actin基因Ct值計算，以對照組為內(nèi)參計算各組別內(nèi)所有樣品eGFP基因相對表達量2-ΔΔCt值。利用方差分析比較不同組間的相對表達量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光檢測

對實驗個體注射12 h后，利用綠色熒光檢測設(shè)備進行羅氏沼蝦活體檢測，結(jié)果表明，攜帶hr5-IE1啟動子的樣品組熒光亮度最大，IE1啟動子組注射個體僅有微弱熒光，SV40和對照組看不到熒光效果(圖2)。

圖2 不同啟動子組個體活體注射后的熒光檢測

2.2 定量分析

對注射個體以對照組為參照，以β-Actin基因為內(nèi)參對3個不同啟動子組質(zhì)粒注射個體eGFP基因表達量進行比較分析，結(jié)果表明，hr5-IE1組eGFP基因的相對表達量極顯著高于SV40組，顯著高于IE1組，而IE1組也顯著高于SV40組(圖3)。

*和**分別表示差異達到顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)水平。圖3 不同啟動子組eGFP相對表達量比較結(jié)果

3 小結(jié)與討論

同一個啟動子在不同物種之間存在著顯著轉(zhuǎn)錄效率和關(guān)鍵保守域上的差異[8]，也具有在不同物種之間活化和引導(dǎo)特異性RNA聚合酶進行下游基因表達的調(diào)控功能[9]。因此，進行不同物種啟動子轉(zhuǎn)錄活性研究是進行外源基因體內(nèi)表達的重要依據(jù)。羅氏沼蝦作為重要的淡水養(yǎng)殖生物，特別是其單基因調(diào)控性別決定機制的獨特性，成為性別決定分子機制研究的重要對象。而本文章通過對常見節(jié)肢動物啟動子IE1、hr5-IE1及Sv40攜帶外源基因表達效率的研究，篩選出了羅氏沼蝦活體表達更加高效的啟動子。

IE1是羅氏沼蝦白斑病毒研究中發(fā)現(xiàn)的在其體內(nèi)復(fù)制組裝的關(guān)鍵調(diào)控元件[10]，并且在家蠶等動物中都具有轉(zhuǎn)錄外源基因的活性[7]，瞬時轉(zhuǎn)錄活性較家蠶肌動蛋白Actin4(A4)、α微管蛋白、絲素H鏈(Fib-H)啟動子較弱[11]，在家蠶遺傳轉(zhuǎn)化研究中其轉(zhuǎn)錄活性也較hr5-IE1有所下降，該結(jié)果與本研究結(jié)果一致，表明插入了增強子hr5的IE1啟動子攜帶外源基因進行轉(zhuǎn)錄表達的效率顯著提高，也表明hr5這個來源于苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件[12]，在羅氏沼蝦水生動物體內(nèi)也具有增強下游啟動子的功能，和RNA聚合酶結(jié)合增強表達的效率可以達到219%以上。

SV40啟動子是來源于哺乳動物猿猴病毒40的啟動子，是哺乳動物分子生物工程重要的強啟動元件[13]，也在植物細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄啟動活性[14]，在水生動物上的轉(zhuǎn)錄啟動活性還未見報道，在本研究中該啟動子和對照組不具有啟動外源基因在羅氏沼蝦體內(nèi)進行轉(zhuǎn)錄表達的作用，因此，在羅氏沼蝦體內(nèi)進行外源基因表達研究時建議不作為主要考慮啟動子，而IE1啟動子和含有hr5增強子的啟動子可以重點考慮，但對于hr5為何在羅氏沼蝦體內(nèi)具有增強IE1啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用機制還尚不清楚，還需進一步探索研究。