譚一羅，蘇文英，任立凱，劉曉梅，秦裕營，楊和川

(連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000)

猴頭菇因形似猴頭得名，又名猴頭蘑、刺猬菌等，在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門、層菌綱、多孔菌目、齒菌科、猴頭菇屬。研究表明，猴頭菇具有保護胃黏膜、提高免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性，且猴頭菇中的多糖等物質(zhì)有很高的保健品開發(fā)價值[1-3]。因此，選育優(yōu)質(zhì)猴頭菇菌株對猴頭菇栽培和保健品的開發(fā)具有重要意義。

近年來，離子束注入技術(shù)逐漸發(fā)展成新型的誘變育種手段，廣泛應(yīng)用于水稻、蔬菜、花卉、微生物等品種選育和改良，對豐富農(nóng)作物及微生物種質(zhì)資源、促進農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域發(fā)展發(fā)揮了重要作用[4-8]。其中，低能離子束注入技術(shù)產(chǎn)生的能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷交換4個效應(yīng)具有損傷輕、變異率高、變異譜寬等優(yōu)點[9-10]。但是，低能離子束注入產(chǎn)生的具體生物學(xué)效應(yīng)仍不明確。本研究以猴頭菇作為試驗菌株，研究了離子注入對猴頭菇的生物學(xué)效應(yīng)，篩選潛在的優(yōu)質(zhì)菌株，為離子束技術(shù)在大型真菌中的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

試驗菌株為猴頭菇920，來源于高郵食用菌研究所，菌種于4 ℃保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保存和平板培養(yǎng)(MYG固體培養(yǎng)基)：麥芽糖10 g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉13 g，水1 L，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基(PDA液體培養(yǎng)基)：取新鮮、去皮馬鈴薯200 g煮沸過濾浸出液，葡萄糖20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，水1 L，pH自然。

1.1.3 離子束生物工程裝置

離子束生物工程裝置購自南京恒樂機電設(shè)備有限公司，型號LSZ-2，離子能量0～40 keV，離子束流0～15 mA，離子束均勻度≥90%，離子束直徑>200 mm。

1.2 方法

1.2.1 樣品稀釋及預(yù)處理

采用無菌操作將新鮮猴頭菇子實體置于無菌空白培養(yǎng)皿過夜，獲得新鮮猴頭菇孢子。用1 mL無菌水沖洗培養(yǎng)皿，收集孢子液。通過血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子液稀釋至濃度為105mL-1。取100 μL孢子液涂布于空白9 cm培養(yǎng)皿，置于超凈工作臺吹干后形成菌膜，鏡檢無細胞重疊后可準備離子束注入。

1.2.2 N+注入

離子束注入儀按操作說明開機預(yù)熱并對靶室進行滅菌，將形成菌膜的培養(yǎng)皿依次放入靶室內(nèi)，調(diào)節(jié)靶室真空至1×10-3～2×10-3Pa，打開氮氣充氣閥，維持靶室氣壓8×10-3～9×10-3Pa，注入能量為15 keV，注入劑量分別為1×1016、4×1016、8×1016、12×1016、16×1016、20×1016ions·cm-2。將同時放置在靶室內(nèi)抽真空但不注入劑量的培養(yǎng)皿作為空白對照。

1.2.3 存活率曲線測定

將注入后的培養(yǎng)皿及空白對照分別用1 mL無菌水洗脫，收集洗脫液至1.5 mL離心管中。取處理后的孢子液90 μL涂布于MYG培養(yǎng)平板，每個劑量10次重復(fù)，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計平板上形成的單菌落并繪制相應(yīng)的生存曲線。

1.2.4 突變菌株篩選及突變率統(tǒng)計

將離子束注入后的菌落進行鎖狀聯(lián)合鑒定，挑選有鎖狀聯(lián)合的菌落分別保種并接種于MYG培養(yǎng)平板，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d。采用5 mm直徑打孔器將菌絲平板打孔并將圓形菌塊分別接種于MYG培養(yǎng)平板中央，重復(fù)3次，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)，測量菌絲生長速率并評估菌絲長勢。菌絲長勢評分標(biāo)準[11]為：5分，菌絲濃密且均勻；4分，菌絲濃密且較均勻；3分，菌絲較濃密且較均勻；2分，菌絲較稀疏但較均勻；1分，菌絲稀疏且不均勻。以猴頭菇920菌絲生長速度作為對照，生長速度超過對照10%的菌株記為正突變，反之記為負突變。

1.2.5 突變菌株復(fù)篩

挑選菌絲長勢優(yōu)良的正突變菌株，用5 mm直徑打孔器打孔，接種圓形菌塊至100 mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為每瓶3塊，25 ℃ 140 r·min-1搖床避光恒溫培養(yǎng)10 d。將菌絲打碎，吸取2 mL菌液接種至100 mL PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基，3次重復(fù)，25 ℃ 140 r·min-1搖床避光恒溫培養(yǎng)10 d。將菌絲過濾收集，隨機選取10個菌絲球測量平均直徑。將菌絲烘干至恒重，記錄菌絲生物量。

1.2.6 遺傳穩(wěn)定性試驗

將復(fù)篩篩選出的菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，按照同樣方法分別測定5代菌株菌絲生長速度及液體發(fā)酵生物量，篩選無明顯退化的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+注入對孢子存活率的影響

圖1表明，隨著注入劑量的增大，孢子的存活率先下降，后上升，再下降，呈現(xiàn)“馬鞍型”效應(yīng)曲線。當(dāng)注入劑量較小時，由于N+注入損傷了細胞表面并發(fā)生刻蝕，導(dǎo)致細胞的損傷或死亡，因此孢子存活率隨著注入劑量增大而降低；隨著劑量增大，離子的庫侖力形成屏障，同時，細胞損傷的加劇激活了細胞各種酶和修復(fù)機制，所以存活率回升；當(dāng)細胞損傷繼續(xù)加重至無法修復(fù)時，最終導(dǎo)致細胞死亡，存活率下降。

圖1 注入劑量對孢子存活率的影響

2.2 N+注入對菌株突變率的影響

圖2顯示，突變率隨著N+注入劑量增加先上升，后下降，再上升。推測是由于一定劑量范圍內(nèi)，由于庫侖力的保護作用和細胞修復(fù)機制使突變率出現(xiàn)下降。負突變率受N+注入劑量的影響與總突變率一致，但正突變率隨N+注入劑量的走勢未發(fā)現(xiàn)明顯趨勢。

圖2 注入劑量對菌株突變率的影響

2.3 突變菌株初篩及復(fù)篩

棄除負突變菌株和無義突變菌株以及正突變菌株中菌絲長勢較差的菌株，試驗共篩選到菌絲生長濃密、旺盛、均勻的正突變菌株16株(表1)。該16株菌株菌絲生長速度快，8～9 d即可滿板；經(jīng)過液體發(fā)酵培養(yǎng)復(fù)篩得到生物量高于出發(fā)菌株10%且菌絲球大小均勻的菌株6株，分別為H0121、H1206、H1211、H1215。

表1 突變菌株篩選結(jié)果

2.4 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性比較

突變菌株傳代5代的遺傳穩(wěn)定性見表2。菌株H1211和H1215在傳代5代過程中，其每代菌絲生長速率、液體菌絲發(fā)酵生物量均未出現(xiàn)明顯下降，說明該菌株遺傳性狀穩(wěn)定，優(yōu)于其他試驗菌株。菌株H0121、H1206在傳代過程中菌絲生長速率以及液體菌絲發(fā)酵生物量均發(fā)生下降，說明菌株可能發(fā)生了回復(fù)突變。

表2 遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 討論

近年來，低能離子束注入技術(shù)廣泛應(yīng)用于微生物菌種改良和品種選育[12]。試驗采用6個劑量梯度的N+注入，突變率在30.77%～92.31%，說明離子束注入技術(shù)具有突變率高的優(yōu)勢。結(jié)合不同劑量處理的生存率和突變率，突變率在最高點時注入劑量為12×1016ions·cm-2，此時存活率也是峰值，因此，該劑量可以作為猴頭菇孢子誘變的最佳劑量。

目前，低能離子束對食用菌產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)未有一致結(jié)論。本研究猴頭菇孢子N+注入劑量的存活率曲線呈現(xiàn)“馬鞍型”曲線，與付永前等[13]和Chen等[14]結(jié)論一致；但汪維云[15]研究表明，灰樹花隨著N+注入劑量增大，細胞死亡率逐漸增大至100%，推測是由于灰樹花極不耐輻照所致。蔣益等[16]研究表明，云芝細胞突變率隨著N+注入劑量增大，呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高的趨勢，與本試驗研究結(jié)果一致；但是，全衛(wèi)豐等[17]研究表明，桑黃細胞突變率隨著注入劑量增加，其突變率先上升后下降，且正突變率曲線也符合同樣趨勢。因此，目前研究結(jié)果的不一致推測是材料、方法的差異以及突變的不定向性和隨機性造成的。本研究運用N+注入技術(shù)誘變猴頭菇菌株，篩選出1株遺傳性狀穩(wěn)定的猴頭菇菌株H1215，對比出發(fā)菌株其生長速率及液體發(fā)酵生物量分別提高了25.30%和30.67%，進一步證實了基于低能離子束的誘變育種是可行的育種方法，但是誘變菌株在遺傳穩(wěn)定性上存在退化或回復(fù)突變，需要進一步開展生產(chǎn)試驗驗證突變菌株的穩(wěn)定性和綜合性狀。