閆曉寧，李承睿

（1渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西渭南 714000；2 杭州娃哈哈啟力食品集團有限公司，陜西渭南 714000）

三唑類殺菌劑是主鏈上含有羥基（酮基）、取代苯基和1,2,4-三唑基化合物，為全球殺菌劑類別中品種最多的一個大類，三唑類殺菌劑與其他類型的殺菌劑的作用機制是不一樣的，它主要是阻礙真菌麥角甾醇的生物合成，從而影響真菌細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致菌體生長停滯甚至死亡[1]。同時，三唑類殺菌劑的作用機制和作用位點相對單一，長期頻繁使用容易引起抗性。例如在晚稻病害防治時，人們?nèi)菀兹蝾悮⒕鷦┏瑒┝渴┯?，不僅不利于水稻生長，還容易引起水體污染，進而在動物體內(nèi)富集。這種殺菌劑一旦在人體內(nèi)富集會對分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾影響，表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)的損害、機體的生殖機能下降、生物體的免疫能力降低以及誘發(fā)腫瘤等[2]。這種不良影響危害引發(fā)了人們對其殘留量超標的關(guān)注度，尤其是食品和飼料中三唑類農(nóng)藥殘留的檢測成為了人們重點管控的關(guān)口。目前，對于三唑類殺菌劑的檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法(GS)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)以及液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）等。王顏紅等[3]以MAA為單體，制備了阿特拉津MIP作為固相萃取填料，應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測，檢測回收率為90%。符瑞益等[4]采用液相色譜法以甲醇-水為流動相，測定三唑醇和腈菌唑的含量，檢測的相對標準偏差均小于4.5%，加標回收率良好。喬魯芹等[5]利用HPLC測定板栗中戊唑醇和咪酰胺的殘留，其中咪酰胺的回收率大于80%，RSD小于11.3%，滿足檢測需求。吳文鑲等[6]研究了模板物質(zhì)與功能單體的結(jié)合方式，考察了模板物質(zhì)的識別能力。對于三唑類殺菌劑殘留的檢測還存在一些亟待解決的問題，如殺菌劑殘留痕量、基質(zhì)的干擾以及同分異構(gòu)體的分離等問題[7-8],而分子印跡材料結(jié)合液相色譜法具有材料制備簡單、分析效率高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可以更加高效地分析殺菌劑殘留。本文制備了聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇分子印跡聚合物，其具有特異性選擇、可反復(fù)使用、分離凈化簡單等特點，通過色譜條件優(yōu)化，建立同時檢測這3種三唑類殺菌劑殘留的方法，這可以對國家農(nóng)產(chǎn)品中該類農(nóng)藥的殘留檢測提供技術(shù)支持。

1 試驗部分

1.1 儀器

LC-1260Ⅱ型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-9000S型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；JM-16D-40型超聲波清洗機，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；RC-FA-324C型電子分析天平，北京睿誠永創(chuàng)科技有限公司；R-300型高真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司。

1.2 試劑

聯(lián)苯三唑醇（分析標準品，純度>99%），上海江萊生物科技有限公司；腈菌唑（純度>97.5%），成都麥卡?；び邢薰荆幌┻虼迹兌?98.5%），麥克林試劑有限公司；氟康唑（純度>98%），北京慶凱華豐科技開發(fā)有限公司；磁性氧化石墨烯（純度>97%），中國科學(xué)院成都有機化學(xué)有限公司；苯胺基甲基三乙氧基硅烷(KH-42，純度>95%)、γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792，純度>95%)，成都麥卡?；び邢薰?；甲醇（色譜純），百靈威科技有限公司；無水乙醇、正硅酸乙酯、十六烷基甲基溴化銨、氨水、硝酸銨均為分析純，國藥試劑有限公司。

1.3 標準溶液配制

分別精確稱取0.01g聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑和烯唑醇標準品， 用乙腈溶解，并定容到100mL容量瓶中，配制成濃度為100mg/L的標準儲備液，保存于4℃冰箱中。在繪制標準曲線時，分別取儲備液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL，用乙腈溶解，并定容到100mL容量瓶中制成質(zhì)量濃度為0.1~1 mg/L的標準溶液。

1.4 分子印跡聚合物的制備[9]

將0.5g磁性氧化石墨烯分散于300mL 60%的乙醇水溶液中，加入2g十六烷基甲基溴化銨，用氨水調(diào)節(jié)pH至9.5，超聲1h。150r/min攪拌下逐漸滴入5mL正硅酸乙酯，室溫下反應(yīng)過夜。磁收集固體，并真空抽濾，用20mL無水乙醇洗滌后收集材料。于60℃下，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)6h，得到介孔硅磁性氧化石墨烯材料（MGO@MS）。分別精確稱取0.01mg聯(lián)苯三唑醇、腈菌唑、烯唑醇混合后，加入50mL無水乙醇充分分散，滴加5mL去離子水并充分混合，分別緩慢滴加1.5mL的γ-氨乙基氨丙基三甲氧基硅烷（KH-792）和0.5mL的苯胺基甲基三乙氧基硅烷（KH-42），室溫反應(yīng)30min后，加入0.5g的MGO@MS，反應(yīng)過夜，在磁場作用下分離反應(yīng)物，先用100mL 20%甲酸甲醇溶液洗滌，然后用100mL甲醇洗至中性，真空干燥得到分子印跡聚合物（MGO@MS@MIP）。不添加模板分子的即為非印跡聚合物（MGO@MS@NIP）。

1.5 分子印跡聚合物固相萃取柱的制備

使用的固相萃取柱內(nèi)徑為 1cm，長為15cm，填充到固相萃取柱中的MIP，其腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的質(zhì)量比為1：1：1，柱填裝高度為 5cm，固相填裝結(jié)束后在柱上端加少量脫脂棉并輕輕擠壓使之充實。

1.6 樣品前處理

1.6.1 提取

將100.0g番茄樣品，切成丁狀后置于粉碎機中，搗碎5min。將破碎后的番茄汁轉(zhuǎn)入500mL燒杯中，在燒杯中加入100.0mL乙腈，密封，然后置于超聲波清洗器中超聲10min，取出后用離心杯分裝，平衡，經(jīng)8000r/min離心10min，取100.0mL上清液，過0.22μm有機濾膜，收集后待進行下一步的磁性固相萃取。

1.6.2 磁性固相萃取實驗[10-12]

稱取100.0mg MGO@MS@MIP于燒杯中，加入100.0mL提取的上清液，100r/min下振蕩吸附30min，然后在施加外磁場作用下收集吸附完成的吸附劑，用100mL 20%甲酸甲醇溶液洗脫30min，最后吸取洗脫液過0.22μm有機濾膜過濾后，進行HPLC分析。

1.7 液相條件

色譜柱：InertSustain AQ-C18（250mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-水（體積比為85：15）；柱溫：25℃；流速：0.8mL/min；進樣量：10μL；檢測波長：210nm。

1.8 試驗設(shè)計

1.8.1 分子印跡聚合物固相萃取條件優(yōu)化

采用分子印跡聚合物MGO@MS@MIP為吸附劑，吸附劑用量為100mg；樣品為配置的標準樣品，腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇濃度均為100mg/L，體積為100 mL；萃取時間為0.5h，洗脫時間為0.5h，通過調(diào)整不同的進料溶液pH值（分別為4.0、 5.0、 6.0、 7.0、8.0），考察其對提取回收率的影響。在確定最優(yōu)的溶液進料pH值后，考察不同樣品進樣體積（20、40、60、80、100 mL），確定最優(yōu)進料體積后，萃取時間分別為5、10、20、40、60、80 min，最后，使用20%甲酸甲醇溶液進行洗脫，洗脫時間分別為10、20、30、40、50、60 min，收集并測定洗脫液中腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的含量，然后計算各組分的回收率。

1.8.2 檢測方法（方法學(xué)確認）

（1）線性范圍與檢測限

配制濃度為0.1、0.2、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/L標準溶液，HPLC分析后，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，通過線性回歸得到標準曲線和方程式，通過方程式來評估方法的線性范圍及其相關(guān)性。以信噪比S/N=3計算檢出限。

（2）回收率與精密度

分別在0.05、0.50、1.00 mg/kg 3個水平下添加到實際樣品中進行加標回收實驗，來驗證不同濃度下3種殺菌劑的回收率和精密度。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性分子印跡聚合物的表征

采用SEM分別對磁性材料MGO@MS和MGO@MS@MIP的表面和內(nèi)部進行形態(tài)掃描，結(jié)果如圖1所示，從外表可見，MGO@MS的結(jié)構(gòu)相對規(guī)整、表面更加光滑，而MGO@MS@MIP粒徑明顯增大，個體相對飽滿。從內(nèi)部結(jié)構(gòu)來看，修飾后的MGO@MS@MIP內(nèi)部更為緊密，溝壑相對要少，說明分子印跡聚合物已經(jīng)成功修飾至MGO@MS材料中。

圖1 掃描電子顯微鏡下觀察MGO@MS和MGO@MS@MIPFig. 1 Scanning electron microscope observation of MGO@MS and MGO@MS@MIP

采用FT-IR對材料中的官能團進行分析，從圖2的紅外光譜圖可知，3條曲線均在490cm-1和l098cm-1處存在一致的吸收峰，而只在MIP和NIP曲線觀察到3450cm-1處的吸收峰。490cm-1為載體中的含有的磁性Fe3O4顆粒所產(chǎn)生的Fe-O吸收峰。1098cm-1硅氧鍵有高強度拉伸振動作用引起的Si-O-Si吸收峰。3450cm-1吸收峰為功能單體的N-H彎曲振動所致。通過對MIP和NIP紅外光譜圖進行比較發(fā)現(xiàn)，它們具有高度相似的振動吸收峰，表明MIP和NIP的官能團和結(jié)構(gòu)是一致的，進一步說明印跡材料已經(jīng)不攜帶模板分子，印跡材料已完成制備。

圖2 MGO@MS、MGO@MS@NIP和MGO@MS@MIP紅外光譜圖Fig. 2 Infrared spectra of MGO@MS, MGO@MS@NIP and MGO@MS@MIP

通過測試MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滯曲線，磁化強度可以反饋出分子印跡材料的分離效果，從圖3結(jié)果可知，MGO@MS因未經(jīng)修飾其磁化后，飽和磁化強度可達18.12emu/g。但是，當在其表面進行分子印跡聚合物修飾后，所得產(chǎn)物(MGO@MS@MIP)的飽和磁化強度發(fā)生明顯的降低，降至4.32emu/g，盡管MGO@MS@MIP的磁化強度下降但仍表現(xiàn)出較好的超順磁性，因此，該方法制備的分子印跡聚合物可用于三唑類的快速分離。

圖3 MGO@MS和MGO@MS@MIP磁滯回線圖Fig. 3 MGO@MS and MGO@MS@MIP hysteresis loops

2.2 分子印跡聚合物的吸附選擇性

利用結(jié)構(gòu)類似物氟康唑評價MGO@MS@MIP磁性材料對腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇三種殺菌劑的特異性吸附能力，結(jié)果如圖4所示。不管是MGO@MS@NIP還是MGO@MS@MIP對氟康唑都基本不吸附，MGO@MS@NIP對腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇的吸附量分別為0.75、0.87、0.73 mg/g，而MGO@MS@MIP對三種殺菌劑的吸附量分別為8.92、4.86、6.87 mg/g?？梢?，MGO@MS@MIP和MGO@MS@NIP對三種殺菌劑的吸附量相差較大，說明MGO@MS@MIP對三唑類物質(zhì)有良好的吸附選擇性，且對三種不同三唑類殺菌劑吸附選擇性不同。

圖4 MGO@MS@NIP和MGO@MS@MIP對三唑類殺菌劑的吸附選擇性Fig. 4 Different selective adsorption of MGO@MS@NIP and MGO@MS@MIP on triazole fungicides

2.3 分子印跡聚合物萃取條件優(yōu)化

圖5~圖8顯示了分子印跡聚合物MGO@MS@MIP對三唑類物質(zhì)的不同萃取條件對洗脫收率的影響。

圖5 樣品pH值對洗脫回收率的影響Fig. 5 Influence of pH value on elution recovery

圖8 洗脫時間對洗脫收率的影響Fig. 8 Effect of elution time on elution recovery

從圖5可知，在pH值4~7范圍內(nèi)，三種三唑類殺菌劑的回收率隨著上樣溶液pH值的上升而上升，當上樣溶液pH值 >7時，聯(lián)苯三唑醇和腈菌唑的洗脫回收率均出現(xiàn)不同程度的降低，而烯唑醇的洗脫回收率繼續(xù)緩慢上升?？赡艿脑驗榈蚿H值有利于吸附劑表面的氨基進行質(zhì)子化作用，給電子能力減弱從而強化了氨基與目標物質(zhì)的氫鍵作用力，不容易被酸溶液洗脫，造成整體的回收率低。當繼續(xù)增大進料pH值時，由于體系中游離的銨根離子迅速增多，弱化了吸附劑上的氨基與目標物質(zhì)的氫鍵作用，所以整體回收率上升。而氨基在不同的物質(zhì)中去質(zhì)子化不同，造成不同三唑類在最佳吸附量下為不同的pH值[13]。從圖6可知，殺菌劑的回收率隨著溶液體積的增加而降低，在相同進料質(zhì)量下，樣品體積小則吸附劑濃度高，高濃度的樣品進料有利于吸附率的提高，從產(chǎn)品的檢測靈敏度考慮，選取100mL為進料體積。從圖7可以看出，在萃取5min初始階段，GO@MS@MIP表面有大量的吸附位點，高濃度的目標物快速占據(jù)吸附位點，因此吸附量迅速增大。當萃取時間達到40min后吸附速率變緩，在50min基本吸附平衡。萃取吸附時間較佳為50min。從圖8可知，三種唑類殺菌劑在MGO@MS@MIP上的洗脫率變化具有高度一致性，在2~20 min范圍內(nèi)，三唑類殺菌劑在MGO@MS@MIP上的洗脫率隨著時間的增長而快速升高，達到78%以上，繼續(xù)延長洗脫時間至80min，洗脫率則緩慢上升至90%左右，所以較佳的洗脫時間為20min。

圖6 樣品進料體積對洗脫回收率的影響Fig. 6 Influence of sample feed volume on elution recovery

圖7 萃取時間對洗脫回收率的影響Fig. 7 Effect of extration time onelution recovery

2.4 方法學(xué)確認

2.4.1 線性范圍與檢測限

從表1可以看出，3種三唑類殺菌劑的質(zhì)量濃度在0.3～200.0 mg/L時，所得到的線性回歸方程的具有良好的相關(guān)性，決定系數(shù)R2>0.990，說明得到的回歸線性方程可以使用。在該檢測范圍內(nèi)，聯(lián)苯三唑醇的檢測限最小，達到了6.52×10-2mg?kg-1。

表1 3種三唑類殺菌劑線性范圍和檢測限Table 1 Linear range and detection limit of three triazole fungicides

2.4.2 回收率與精密度

從表2可知，3種殺菌劑檢測的平均回收率在96.34%~101.82%，相對標準偏差(RSD)在1.76%~3.27%，均滿足RSD<5%范圍內(nèi)的標準要求。當添加的質(zhì)量濃度為0.05~0.50 mg/kg時，回收率為96.34%~99.23%，相對標準偏差≤2.67%；當添加的質(zhì)量濃度為0.50~1.00 mg/kg時，回收率為97.13%~101.82%，相對標準偏差≤3.27%。因此，該檢測方法可以運用在不同濃度范圍的檢測且準確度高、重復(fù)性好。

表2 番茄中3種三唑類殺菌劑的添加回收率和相對標準偏差（n=3）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of three kinds of triazole fungicides in tomato (n=3)

2.5 討論

分子印跡-高效液相色譜法應(yīng)用于番茄中三唑類殺菌劑殘留測定，克服了傳統(tǒng)前處理手段的目標產(chǎn)物分離困難、基質(zhì)干擾大、檢測時間長、回收率低等一系列問題。采用MIP對目標物和結(jié)構(gòu)類似物的吸附試驗，表明MIP對該三唑類物質(zhì)或其粒徑結(jié)構(gòu)類似物都具有良好的吸附效果，將其運用于樣品的分離檢測，得到了良好的結(jié)果，3種三唑類殺菌劑平均回收率在96.34%~101.82%，相對標準偏差（RSD)在1.76%~3.27%。另外，三唑類殺菌劑使用分子印跡固相萃取-高效液相色譜分析為不同種類模板同時提供理論依據(jù)其改變了傳統(tǒng)分子印跡技術(shù)只針對一種或一類物質(zhì)有高回收率特異性吸附能力的現(xiàn)狀。

3 結(jié)論

本文以分子印跡和色譜技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了應(yīng)用于番茄可同時測定腈菌唑、聯(lián)苯三唑醇和烯唑醇等殺菌劑的方法，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快，是一種比較有前景的分析方法。分子印跡固相萃取技術(shù)除了可以用于農(nóng)獸藥等有毒物質(zhì)的殘留檢測外，還可以用于食品添加劑等違規(guī)物質(zhì)的檢測。但是分子印跡技術(shù)也存在一些問題，例如目標物質(zhì)的選擇及制備材料來源受限、應(yīng)用對象和應(yīng)用領(lǐng)域相對狹窄、聚合物材料還無法很好地在水相中合成等一系列問題。隨著新材料的不斷發(fā)現(xiàn)和檢測儀器的不斷更新發(fā)展，這種分子印跡制備技術(shù)將會更加完善，其應(yīng)用將會更加廣闊。