曹素娟 劉書政 袁步奇 袁培樂 趙松鶴 張?jiān)品?/p>

血管鈣化是慢性尿毒癥患者發(fā)病和死亡的高危因素［1］。組織學(xué)上，血管鈣化分為2 種類型，一種是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的內(nèi)膜鈣化，表現(xiàn)為富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的內(nèi)膜增生；另一種是中膜鈣化，鈣磷酸鹽沉積于動(dòng)脈中膜的平滑肌層，主要見于代謝相關(guān)疾病，如慢性尿毒癥和糖尿病［2-3］。多項(xiàng)研究表明在慢性腎臟病患者中，高鈣血癥、甲狀旁腺激素水平升高、炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、高磷血癥等因素參與血管鈣化［4-8］。近年研究表明，血管鈣化是主動(dòng)的、細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控的生物學(xué)進(jìn)程，與軟骨和骨形成類似，表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞伴隨骨形成相關(guān)蛋白［Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP2）］的上調(diào)表達(dá)［9-10］。轉(zhuǎn)錄因子D 位點(diǎn)結(jié)合蛋白（DBP）屬于脯氨酸和酸性氨基酸含量豐富的堿性亮氨酸拉鏈（PAR bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)特異的序列并激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控生物晝夜節(jié)律［11］。DBP 是否參與尿毒癥的調(diào)控尚未闡明，因此本研究對(duì)尿毒癥血管鈣化模型大鼠尾靜脈注射小干擾DBP（shDBP）慢病毒，研究DBP 在抑制尿毒癥血管鈣化模型的作用及潛在機(jī)制。

材料與方法

一、材 料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只清潔級(jí)Sprague-Dawley 雄性大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理過(guò)程均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范。

2. 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶AgeI、EcoRI 購(gòu)于紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；RUNX2、β-actin 抗體購(gòu)于美國(guó)CST 中國(guó)公司。德國(guó)Eppendor 5920 R 高速低溫離心機(jī)，中國(guó)粵顯XJL-20/XJL-20BD 普通光學(xué)顯微鏡，美國(guó)Thermo HR1500-II 生物安全柜，美國(guó)伯樂小型水平電泳槽，海爾HCB-1300V 超凈工作臺(tái)。

3. 短發(fā)夾RNA（shRNA）設(shè)計(jì)和構(gòu)建

參照已知GenBank 所示DBP mRNA 序列以及shRNA 的設(shè)計(jì)要求，設(shè)計(jì)并合成靶向DBP的特異性shRNA（shDBP）序列：正向5′-CCGG GAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTC ATGATTGGCTGAGGCTTC-3′，反 向5′-AATTCAAA AAGAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTCAT GATTGGCTGAGGCTT-3′，同時(shí)設(shè)計(jì)相應(yīng)的陰性對(duì)照shRNA（shNC）序列：正向5′-UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3′，反 向5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。shDBP 和shNC 序列由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，并重組到pLKOGshRNA 質(zhì)粒，對(duì)應(yīng)質(zhì)粒的名稱為pLKOG-shDBP 和pLKOG-shNC。

二、方 法

1. shDBP 和shNC 慢病毒包裝及病毒滴度檢測(cè)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T 細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)將pLKOG-shDBP和pLKOG-shNC 分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞， 分別在24、48 h 轉(zhuǎn)染換液時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過(guò)低溫超速離心濃縮假病毒顆粒，磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸的慢病毒濃縮液根據(jù)Lentivirus Titration Kit（TaKaRa）操作手冊(cè)檢測(cè)病毒滴度。

2. 模型制備

選取24 只雄性SD 大鼠按數(shù)字表法分為4 組，每組各6 只。根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］采用兩步法切除腎臟：選取18 只大鼠予5%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）腹腔注射麻醉，切除大鼠2/3 左腎，并于4 d 后全切除大鼠右腎，術(shù)后1 周存活的大鼠喂飼高磷飼料（含0.9%鈣、1.2%磷，購(gòu)于江西協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司）誘導(dǎo)血管鈣化模型［13］。模型組：慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后，予尾靜脈注射生理鹽水4周。慢病毒對(duì)照組（shNC組）：慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后，予尾靜脈注射對(duì)照慢病毒4 周。抑制DBP慢病毒組（shDBP 組）：慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后，給予抑制DBP 慢病毒尾靜脈注射4 周。余下喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料的6 只大鼠為空白組。治療4 周后，測(cè)量4 組大鼠的體質(zhì)量，并收集4 組大鼠的頸靜脈血、尿液、胸主動(dòng)脈組織樣本用于后續(xù)的指標(biāo)檢測(cè)，每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

3. 生化指標(biāo)檢測(cè)

取大鼠頸靜脈血離心分離血清，采用山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測(cè)其血清肌酐、血鈣、血磷及尿液尿素氮水平。

4. 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織DBP 和RUNX2 的mRNA 表達(dá)檢測(cè)

采用逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)。根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書提取4 組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)。所需引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成（表1），以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照，采用2-ΔΔCt法分析DBP 和RUNX2 的mRNA表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR 檢測(cè)各基因引物序列

5.大鼠胸主動(dòng)脈血管組織RUNX2 蛋白表達(dá)檢測(cè)

用RIPA 裂解液處理4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織，蛋白定量后取10 μg 總蛋白進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。加入RUNX2 抗體（1∶1000）、β-actin 抗 體（1∶1000）于4 ℃過(guò) 夜 孵 育，用Image J 軟件分析條帶的灰度值。

6. 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織病理學(xué)檢測(cè)

免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色：取4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織制作石蠟切片后行抗原修復(fù)，加入增殖細(xì)胞核抗原（PCNA） 抗體（1∶1000）于4 ℃孵育過(guò)夜，37 ℃孵育二抗2 h，3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB）顯色。HE 染色：取4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織制作石蠟切片后行HE 染色，光鏡下觀察血管病理學(xué)變化。

7. 數(shù)據(jù)來(lái)源及預(yù)處理

本研究所用的測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（GEO）。慢性尿毒癥大鼠的主動(dòng)脈血管平滑肌mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于GSE146638［14］。對(duì)所篩選的慢性尿毒癥大鼠（慢性尿毒癥組）與對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌中差異表達(dá)的基因，分別進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以 表示，2 組間比較用t 檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、GEO 分析結(jié)果

選取數(shù)據(jù)集GSE146638 中的5 只慢性尿毒癥大鼠（慢性尿毒癥組）和5 只正常對(duì)照大鼠（對(duì)照組）的主動(dòng)脈血管平滑肌組織mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)， 結(jié)果顯示有86 個(gè)基因上調(diào)、335 個(gè)基因下調(diào)，差異表達(dá)基因主要富集在MAPK 信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路。根據(jù)分析結(jié)果，選取差異表達(dá)基因糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SLC22A2、轉(zhuǎn)錄激活因子3（ATF3）、DBP、鞘磷脂磷酸二酯酶3（SMPD3）為候選基因。RT-qPCR法檢測(cè)結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組相比，慢性尿毒癥組的血清DBP 和SMPD3 mRNA 相對(duì)表達(dá)量上調(diào)（P 均＜0.05）。見表2。

表2 GEO 中慢性尿毒癥組與對(duì)照組大鼠血清中差異表達(dá)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

二、4 組大鼠的一般狀態(tài)及生化指標(biāo)比較

喂飼高磷飼料8 周并干預(yù)治療4 周后，與空白組比較，模型組、shNC 組和shDBP 組大鼠的體質(zhì)量較低、血清肌酐水平較高（P 均＜0.05）。其中shDBP 組大鼠體質(zhì)量比基線輕微增加，shNC 組、shDBP 組血清肌酐水平均低于模型組，但比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均> 0.05）；4 組的血鈣、血磷和尿液尿素氮水平比較差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）。見圖1。

圖1 4 組大鼠的一般狀態(tài)及生化指標(biāo)比較

三、4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管病理檢查結(jié)果比較

喂飼高磷飼料8 周并干預(yù)治療4 周后，HE 染色結(jié)果顯示，模型組和shNC 組胸主動(dòng)脈壁中膜厚度增厚，shDBP 組的增厚程度較模型組減輕；免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示模型組和shNC 組胸主動(dòng)脈PCNA 表達(dá)上調(diào)，shDBP 組較模型組PCNA 表達(dá)減弱。見圖2。

圖2 4 組大鼠胸主動(dòng)脈HE 染色和PCNA 蛋白免疫組化結(jié)果

四、4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管DBP 及RUNX2表達(dá)情況比較

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組DBP mRNA 表達(dá)水平上調(diào)（P ＜0.05）；與模型組相比，shNC 組、shDBP 組胸主動(dòng)脈血管中DBP mRNA 表達(dá)均下調(diào)（P 均＜0.05），提示靶向DBP 的干擾RNA 能夠抑制靶基因表達(dá)。RUNX2 mRNA 表達(dá)水平顯示，與空白組相比，模型組、shNC 組RUNX2 mRNA 表 達(dá) 上 調(diào)，其 中shNC 組RUNX2 表達(dá)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），shDBP 組RUNX2 mRNA 表達(dá)下調(diào)（P ＜0.05）；RUNX2 蛋白表達(dá)豐度也觀察到相似的結(jié)果。見圖3。

圖3 4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管DBP 及RUNX2 表達(dá)情況比較

討 論

DBP 屬于PAR bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)有較大的晝夜節(jié)律波動(dòng)，主要參與細(xì)胞生物節(jié)律調(diào)控。當(dāng)DBP 形成二聚體時(shí)，它會(huì)結(jié)合晝夜節(jié)律或時(shí)鐘控制相關(guān)基因啟動(dòng)子的D-box序列，激活該相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而調(diào)節(jié)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、激素受體異?；蚬欠€(wěn)態(tài)等疾病過(guò)程［15-16］。研究表明，骨祖細(xì)胞中DBP 與成骨分化呈正相關(guān)［17］。DBP 過(guò)表達(dá)通過(guò)人親吻素1/促性腺激素釋放激素/雌二醇（hKiss1/GnRH/E2）信號(hào)通路上調(diào)成骨相關(guān)標(biāo)志物，如RUNX2、骨橋素、Osterix、BMP4、堿性磷酸酶（ALP）活性和鈣沉積，而抑制DBP 表達(dá)成骨相關(guān)標(biāo)志物則下調(diào)［18］。

本研究予慢性尿毒癥大鼠喂飼特殊配方飼料，以高磷飼料誘導(dǎo)血管鈣化模型，經(jīng)GEO 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)DBP 在慢性尿毒癥組血管組織中上調(diào)，構(gòu)建了DBP 慢病毒抑制表達(dá)載體，通過(guò)尾靜脈將慢病毒注射到慢性尿毒癥大鼠體內(nèi)，并分析抑制DBP 表達(dá)對(duì)慢性尿毒癥大鼠血管鈣化的影響及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，抑制DBP 表達(dá)可改善尿毒癥大鼠血清肌酐水平，同時(shí)成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2的蛋白和mRNA 表達(dá)水平也受到抑制，這可能與DBP 參與成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)［19］。研究表明，血管鈣化與軟骨和骨形成類似，即通過(guò)上調(diào)骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)。抑制DBP 基因能下調(diào)尿毒癥大鼠主動(dòng)脈血管RUNX2 表達(dá)，故能緩解尿毒癥大鼠的血管鈣化。

綜上所述，抑制DBP 基因可能通過(guò)抑制主動(dòng)脈血管中的RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá)，減輕慢性尿毒癥大鼠血管鈣化程度和尿毒癥相關(guān)癥狀。本研究為利用抑制DBP 基因修飾減輕慢性尿毒癥相關(guān)癥狀和血管鈣化提供了理論依據(jù)。