曹素娟 劉書政 袁步奇 袁培樂 趙松鶴 張?jiān)品?/p>
血管鈣化是慢性尿毒癥患者發(fā)病和死亡的高危因素[1]。組織學(xué)上,血管鈣化分為2 種類型,一種是與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的內(nèi)膜鈣化,表現(xiàn)為富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞浸潤的內(nèi)膜增生;另一種是中膜鈣化,鈣磷酸鹽沉積于動(dòng)脈中膜的平滑肌層,主要見于代謝相關(guān)疾病,如慢性尿毒癥和糖尿病[2-3]。多項(xiàng)研究表明在慢性腎臟病患者中,高鈣血癥、甲狀旁腺激素水平升高、炎癥細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激、高磷血癥等因素參與血管鈣化[4-8]。近年研究表明,血管鈣化是主動(dòng)的、細(xì)胞介導(dǎo)調(diào)控的生物學(xué)進(jìn)程,與軟骨和骨形成類似,表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞伴隨骨形成相關(guān)蛋白[Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP2)]的上調(diào)表達(dá)[9-10]。轉(zhuǎn)錄因子D 位點(diǎn)結(jié)合蛋白(DBP)屬于脯氨酸和酸性氨基酸含量豐富的堿性亮氨酸拉鏈(PAR bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族成員,可結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)特異的序列并激活轉(zhuǎn)錄調(diào)控生物晝夜節(jié)律[11]。DBP 是否參與尿毒癥的調(diào)控尚未闡明,因此本研究對尿毒癥血管鈣化模型大鼠尾靜脈注射小干擾DBP(shDBP)慢病毒,研究DBP 在抑制尿毒癥血管鈣化模型的作用及潛在機(jī)制。
1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
24 只清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠,8 周齡,體質(zhì)量180~220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理過程均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范。
2. 主要試劑和儀器
限制性內(nèi)切酶AgeI、EcoRI 購于紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司;RUNX2、β-actin 抗體購于美國CST 中國公司。德國Eppendor 5920 R 高速低溫離心機(jī),中國粵顯XJL-20/XJL-20BD 普通光學(xué)顯微鏡,美國Thermo HR1500-II 生物安全柜,美國伯樂小型水平電泳槽,海爾HCB-1300V 超凈工作臺(tái)。
3. 短發(fā)夾RNA(shRNA)設(shè)計(jì)和構(gòu)建
參照已知GenBank 所示DBP mRNA 序列以及shRNA 的設(shè)計(jì)要求,設(shè)計(jì)并合成靶向DBP的特異性shRNA(shDBP)序列:正向5′-CCGG GAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTC ATGATTGGCTGAGGCTTC-3′,反 向5′-AATTCAAA AAGAAGCCTCAGCCAATCATGAACTCGAGTTCAT GATTGGCTGAGGCTT-3′,同時(shí)設(shè)計(jì)相應(yīng)的陰性對照shRNA(shNC)序列:正向5′-UUCUCCGAACG UGUCACGUTT-3′,反 向5′-ACGUGACACGUUCGG AGAATT-3′。shDBP 和shNC 序列由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)、合成,并重組到pLKOGshRNA 質(zhì)粒,對應(yīng)質(zhì)粒的名稱為pLKOG-shDBP 和pLKOG-shNC。
1. shDBP 和shNC 慢病毒包裝及病毒滴度檢測
將處于對數(shù)生長期的293T 細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿,待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時(shí)將pLKOG-shDBP和pLKOG-shNC 分別與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T 細(xì)胞, 分別在24、48 h 轉(zhuǎn)染換液時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,通過低溫超速離心濃縮假病毒顆粒,磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸的慢病毒濃縮液根據(jù)Lentivirus Titration Kit(TaKaRa)操作手冊檢測病毒滴度。
2. 模型制備
選取24 只雄性SD 大鼠按數(shù)字表法分為4 組,每組各6 只。根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]采用兩步法切除腎臟:選取18 只大鼠予5%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉,切除大鼠2/3 左腎,并于4 d 后全切除大鼠右腎,術(shù)后1 周存活的大鼠喂飼高磷飼料(含0.9%鈣、1.2%磷,購于江西協(xié)同生物工程有限責(zé)任公司)誘導(dǎo)血管鈣化模型[13]。模型組:慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后,予尾靜脈注射生理鹽水4周。慢病毒對照組(shNC組):慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后,予尾靜脈注射對照慢病毒4 周。抑制DBP慢病毒組(shDBP 組):慢性尿毒癥血管鈣化模型大鼠喂飼高磷飼料8 周后,給予抑制DBP 慢病毒尾靜脈注射4 周。余下喂飼標(biāo)準(zhǔn)飼料的6 只大鼠為空白組。治療4 周后,測量4 組大鼠的體質(zhì)量,并收集4 組大鼠的頸靜脈血、尿液、胸主動(dòng)脈組織樣本用于后續(xù)的指標(biāo)檢測,每個(gè)指標(biāo)檢測至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。
3. 生化指標(biāo)檢測
取大鼠頸靜脈血離心分離血清,采用山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑檢測其血清肌酐、血鈣、血磷及尿液尿素氮水平。
4. 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織DBP 和RUNX2 的mRNA 表達(dá)檢測
采用逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測。根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取4 組大鼠胸主動(dòng)脈血管組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為模板DNA,進(jìn)行RT-qPCR 檢測。所需引物由廣州艾基生物技術(shù)有限公司合成(表1),以β-actin 為內(nèi)參對照,采用2-ΔΔCt法分析DBP 和RUNX2 的mRNA表達(dá)水平。
表1 RT-qPCR 檢測各基因引物序列
5.大鼠胸主動(dòng)脈血管組織RUNX2 蛋白表達(dá)檢測
用RIPA 裂解液處理4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織,蛋白定量后取10 μg 總蛋白進(jìn)行電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。加入RUNX2 抗體(1∶1000)、β-actin 抗 體(1∶1000)于4 ℃過 夜 孵 育,用Image J 軟件分析條帶的灰度值。
6. 大鼠胸主動(dòng)脈血管組織病理學(xué)檢測
免疫組織化學(xué)(免疫組化)染色:取4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織制作石蠟切片后行抗原修復(fù),加入增殖細(xì)胞核抗原(PCNA) 抗體(1∶1000)于4 ℃孵育過夜,37 ℃孵育二抗2 h,3,3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色。HE 染色:取4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管組織制作石蠟切片后行HE 染色,光鏡下觀察血管病理學(xué)變化。
7. 數(shù)據(jù)來源及預(yù)處理
本研究所用的測序數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)。慢性尿毒癥大鼠的主動(dòng)脈血管平滑肌mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GSE146638[14]。對所篩選的慢性尿毒癥大鼠(慢性尿毒癥組)與對照組大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌中差異表達(dá)的基因,分別進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析。
采用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以 表示,2 組間比較用t 檢驗(yàn),多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用M(P25,P75)表示,組間比較采用Wilcoxon 符號(hào)秩檢驗(yàn)。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
選取數(shù)據(jù)集GSE146638 中的5 只慢性尿毒癥大鼠(慢性尿毒癥組)和5 只正常對照大鼠(對照組)的主動(dòng)脈血管平滑肌組織mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù), 結(jié)果顯示有86 個(gè)基因上調(diào)、335 個(gè)基因下調(diào),差異表達(dá)基因主要富集在MAPK 信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路。根據(jù)分析結(jié)果,選取差異表達(dá)基因糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SLC22A2、轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)、DBP、鞘磷脂磷酸二酯酶3(SMPD3)為候選基因。RT-qPCR法檢測結(jié)果分析顯示,與對照組相比,慢性尿毒癥組的血清DBP 和SMPD3 mRNA 相對表達(dá)量上調(diào)(P 均<0.05)。見表2。
表2 GEO 中慢性尿毒癥組與對照組大鼠血清中差異表達(dá)基因mRNA 相對表達(dá)量比較
喂飼高磷飼料8 周并干預(yù)治療4 周后,與空白組比較,模型組、shNC 組和shDBP 組大鼠的體質(zhì)量較低、血清肌酐水平較高(P 均<0.05)。其中shDBP 組大鼠體質(zhì)量比基線輕微增加,shNC 組、shDBP 組血清肌酐水平均低于模型組,但比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均> 0.05);4 組的血鈣、血磷和尿液尿素氮水平比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均> 0.05)。見圖1。
圖1 4 組大鼠的一般狀態(tài)及生化指標(biāo)比較
喂飼高磷飼料8 周并干預(yù)治療4 周后,HE 染色結(jié)果顯示,模型組和shNC 組胸主動(dòng)脈壁中膜厚度增厚,shDBP 組的增厚程度較模型組減輕;免疫組化檢測結(jié)果顯示模型組和shNC 組胸主動(dòng)脈PCNA 表達(dá)上調(diào),shDBP 組較模型組PCNA 表達(dá)減弱。見圖2。
圖2 4 組大鼠胸主動(dòng)脈HE 染色和PCNA 蛋白免疫組化結(jié)果
RT-qPCR 結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組DBP mRNA 表達(dá)水平上調(diào)(P <0.05);與模型組相比,shNC 組、shDBP 組胸主動(dòng)脈血管中DBP mRNA 表達(dá)均下調(diào)(P 均<0.05),提示靶向DBP 的干擾RNA 能夠抑制靶基因表達(dá)。RUNX2 mRNA 表達(dá)水平顯示,與空白組相比,模型組、shNC 組RUNX2 mRNA 表 達(dá) 上 調(diào),其 中shNC 組RUNX2 表達(dá)與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),shDBP 組RUNX2 mRNA 表達(dá)下調(diào)(P <0.05);RUNX2 蛋白表達(dá)豐度也觀察到相似的結(jié)果。見圖3。
圖3 4 組大鼠的胸主動(dòng)脈血管DBP 及RUNX2 表達(dá)情況比較
DBP 屬于PAR bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)有較大的晝夜節(jié)律波動(dòng),主要參與細(xì)胞生物節(jié)律調(diào)控。當(dāng)DBP 形成二聚體時(shí),它會(huì)結(jié)合晝夜節(jié)律或時(shí)鐘控制相關(guān)基因啟動(dòng)子的D-box序列,激活該相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,從而調(diào)節(jié)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、激素受體異?;蚬欠€(wěn)態(tài)等疾病過程[15-16]。研究表明,骨祖細(xì)胞中DBP 與成骨分化呈正相關(guān)[17]。DBP 過表達(dá)通過人親吻素1/促性腺激素釋放激素/雌二醇(hKiss1/GnRH/E2)信號(hào)通路上調(diào)成骨相關(guān)標(biāo)志物,如RUNX2、骨橋素、Osterix、BMP4、堿性磷酸酶(ALP)活性和鈣沉積,而抑制DBP 表達(dá)成骨相關(guān)標(biāo)志物則下調(diào)[18]。
本研究予慢性尿毒癥大鼠喂飼特殊配方飼料,以高磷飼料誘導(dǎo)血管鈣化模型,經(jīng)GEO 數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)DBP 在慢性尿毒癥組血管組織中上調(diào),構(gòu)建了DBP 慢病毒抑制表達(dá)載體,通過尾靜脈將慢病毒注射到慢性尿毒癥大鼠體內(nèi),并分析抑制DBP 表達(dá)對慢性尿毒癥大鼠血管鈣化的影響及其機(jī)制。研究結(jié)果表明,抑制DBP 表達(dá)可改善尿毒癥大鼠血清肌酐水平,同時(shí)成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2的蛋白和mRNA 表達(dá)水平也受到抑制,這可能與DBP 參與成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[19]。研究表明,血管鈣化與軟骨和骨形成類似,即通過上調(diào)骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)。抑制DBP 基因能下調(diào)尿毒癥大鼠主動(dòng)脈血管RUNX2 表達(dá),故能緩解尿毒癥大鼠的血管鈣化。
綜上所述,抑制DBP 基因可能通過抑制主動(dòng)脈血管中的RUNX2 mRNA 和蛋白表達(dá),減輕慢性尿毒癥大鼠血管鈣化程度和尿毒癥相關(guān)癥狀。本研究為利用抑制DBP 基因修飾減輕慢性尿毒癥相關(guān)癥狀和血管鈣化提供了理論依據(jù)。