陳諾梅，陳海萍，成熟，李璇，孫錦文，張威

糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation, IGR)也稱為糖尿病前期，包括空腹血糖受損和糖耐量受損，是2型糖尿病(diabetes mellitus type 2, T2DM)發(fā)生的早期事件。腸道菌群作為最大、最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，包含的微生物數(shù)量是人體細(xì)胞的近10倍[1]，與人體健康密切相關(guān)。多項(xiàng)研究證明糖調(diào)節(jié)受損及糖尿病患者腸道菌群發(fā)生紊亂[2-4]，腸道微生物結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致腸壁屏障受損，進(jìn)而引起體內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)，加劇胰島素抵抗，從而參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程[5-6]。

激光已廣泛用于疾病治療。根據(jù)采用的激光能量高低可分為低能量激光和高能量激光，低能量激光具有消炎止痛、改善循環(huán)、調(diào)節(jié)神經(jīng)及免疫功能等作用[7-8]。高能量激光可通過生物刺激作用影響細(xì)胞微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞代謝，并降低前列腺素、c反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素1等水平，控制炎癥反應(yīng)，高能量激光還具有脈沖發(fā)射、功率較大、組織穿透深等特點(diǎn)，可快速誘導(dǎo)組織深部光化學(xué)和光熱效應(yīng)，從而治療深層組織和結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可通過調(diào)節(jié)脈沖強(qiáng)度和頻率來控制光熱效應(yīng)，提高患者的安全性和舒適度[9-10]。激光已經(jīng)在改善糖脂代謝、治療糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病周圍神經(jīng)病變等方面取得了重大進(jìn)展[11]，但對糖耐量異?；颊吣c道菌群的調(diào)節(jié)作用目前尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用高能量激光輻照糖調(diào)節(jié)受損患者腹部，觀察輻照后患者腸道菌群的恢復(fù)情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年5月～2021年12月就診于武漢科技大學(xué)附屬華潤武鋼總醫(yī)院的糖調(diào)節(jié)受損患者13例作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：糖調(diào)節(jié)受損診斷參照1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病專家委員會(huì)制定標(biāo)準(zhǔn)，患者經(jīng)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)檢查提示6.1 mmol/L<空腹血糖<7.0 mmol/L或7.8 mmol/L<餐后2 h血糖<11.1 mmol/L；1個(gè)月內(nèi)未使用任何降糖藥物、抗生素及質(zhì)子泵抑制劑，無急性或慢性胃腸道疾病史；排除標(biāo)準(zhǔn)：有消化系統(tǒng)腫瘤或手術(shù)史；有心肝腎等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病，一般情況較差，嚴(yán)重營養(yǎng)不良；近4周有抗生素、益生元、益生菌、微生態(tài)活菌制劑等服用史；6個(gè)月內(nèi)有創(chuàng)傷或手術(shù)史；妊娠婦女及哺乳期婦女；無法配合隨訪者。另收集我院健康體檢者10例為對照組，年齡≥18歲，無糖尿病或糖調(diào)節(jié)受損病史，無嚴(yán)重器質(zhì)性疾病，無急性感染或慢性消化系統(tǒng)疾病史。實(shí)驗(yàn)期間所有研究對象保持常規(guī)、清淡、規(guī)律飲食。本次研究通過華潤武鋼總醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有研究對象均詳細(xì)了解研究過程并簽署知情同意書。2組研究對象的年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

1.2 方法 觀察組干預(yù)前記為A組，干預(yù)后記為B組，對照組記為H組。觀察組予以980nm半導(dǎo)體激光輻照腹部9個(gè)治療位點(diǎn)，療程1個(gè)月。高能激光發(fā)射器及治療方式 選用波長為980nm半導(dǎo)體激光設(shè)備(SAT-G30高能量半導(dǎo)體激光治療儀)，參數(shù)選擇：功率15w，脈沖7ms，頻率10Hz，選用點(diǎn)照式輻照方式輻照結(jié)腸體表投影9個(gè)點(diǎn)(如圖1所示)，圖1黃色圈圈代表的是腹股溝韌帶的中點(diǎn)，輔以定位激光輻照點(diǎn)。

表1 2組一般資料比較

圖1 激光輻照點(diǎn)圖示

激光發(fā)射探頭以按壓深度約2～3cm置于腹部9個(gè)輻照點(diǎn)上，單點(diǎn)單次輻照時(shí)間為60s，順時(shí)針方向依次進(jìn)行。治療頻次為2～3次/周，共4周。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn) 提取觀察組干預(yù)前后及對照組大便菌群基因組DNA進(jìn)行高通量測序。糞便樣本采集：于清晨空腹時(shí)分別采集觀察組干預(yù)前后及對照組受試者糞便樣本2～5g，置于滅菌糞便收集杯中，封口后立即保存于-80 ℃；糞便樣本檢測：DNA提取、擴(kuò)增及測序 糞便樣本用干冰運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后，對各組糞便樣本用干冰運(yùn)輸至武漢百齊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測。對糞便中微生物總DNA進(jìn)行提取并定量，針對細(xì)菌16SrRNA基因V3V4區(qū)，添加帶有barcode序列的特異物，利用引物序列(ACTCCTACGGGAGGCAGCA)和(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化回收、熒光定量(試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit)，并制備測序文庫，采用Illumina MiSeq/NovaSeq平臺(tái)進(jìn)行雙端測序，測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)過篩查合格后用Vsearch方法在97%相似水平上進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類，進(jìn)而得到物種分類學(xué)注釋，使用QIIME2軟件計(jì)算出Alpha多樣性指數(shù)(包括Chao1、Observed species、Shannon、Simpson)、繪制稀疏曲線，最終得到樣品的生物信息學(xué)結(jié)果，以上過程由武漢百齊生物技術(shù)有限公司完成。考慮到16SrRNA測序的特點(diǎn)，本研究將主要從門和屬水平以及ɑ多樣性方面對各樣本腸道菌群物種進(jìn)行生物學(xué)信息分析。α多樣性反映的是單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，包括α多樣性指數(shù)和稀釋曲線。α多樣性指數(shù)以Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度，Pielou’s evenness指數(shù)表征均勻度，數(shù)值越大，說明豐富度和均勻度越高；以Shannon和Simpson指數(shù)表征多樣性，Shannon指數(shù)與物種多樣性呈正相關(guān)，Simpson指數(shù)與物種多樣性呈負(fù)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析 對3組共36份樣本進(jìn)行細(xì)菌DNA提取及高通量測序后，切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，共獲得2216426份高質(zhì)量序列，通過Vsearch軟件進(jìn)行OTU聚類并繪制韋恩圖，3組樣本共獲得42519個(gè)OTU，其中3組共有的OTU有2228個(gè)(5.24%)，H組與A組共有2708個(gè)(6.37%)，A組與B組共有4599個(gè)(10.82%)。見圖2。

圖2 3組樣本OTU分布的韋恩圖

2.2 物種組成分析 將聚類得到每個(gè)OTU的代表序列與Greengene數(shù)據(jù)庫內(nèi)置數(shù)據(jù)進(jìn)行對比后，獲取各樣本在門、綱、目、科、屬、種6個(gè)分類學(xué)水平的注釋信息。

2.2.1 在門分類水平，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門是3組人群腸道菌群中的絕對優(yōu)勢菌門。A組與H組的4個(gè)菌門相對豐度均無顯著差異，而B組與A組相比擬桿菌門相對豐度升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，變形菌門及放線菌門相對豐度降低，但豐度變化均未達(dá)到顯著水平。見表2。

表2 3組樣本門水平相對豐度比較 M (P25, P75)

2.2.2 在屬分類水平上，A組的梭菌屬、雙歧桿菌屬、志賀菌屬的相對豐度高于H組，而副桿菌屬、糞桿菌屬、鏈球菌屬的相對豐度低于H組，3組間具有顯著差異的是副桿菌屬和糞桿菌屬(P<0.05)。B組的梭菌屬、副桿菌屬、糞桿菌屬相對豐度較A組升高，其中副桿菌屬相對豐度變化具有顯著差異(P<0.05)，而雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、志賀菌屬較干預(yù)前降低，其中鏈球菌屬的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表3。

表3 3組樣本屬水平相對豐度比較 M (P25, P75)

2.3 α多樣性分析 所有樣本的測序覆蓋率均在97%以上，絕大多數(shù)樣本稀釋曲線趨于平緩，表明測序數(shù)據(jù)量足夠反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息，A組與H組的Chao1、Simpson指數(shù)曲線之間存在一定距離，而經(jīng)激光治療后的B組與H組曲線接近重合，A組與H組在Shannon指數(shù)、Pielou’s evenness指數(shù)上的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組在多樣性及均勻度上均顯著小于H組，A組的Chao1、Observed species、Simpson指數(shù)較H組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組的Chao1、Observed species、Shannon、Simpson、Pielou’s evenness指數(shù)均較A組顯著提高(P<0.05)，說明B組與A組比較在豐富度、多樣性及均勻度上均得到顯著提高(P<0.05)。見圖3，表4。

圖3 樣本Chao1、Simpson指數(shù)結(jié)果

表4 3組樣本α多樣性指數(shù)比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)糖調(diào)節(jié)受損患者腸道內(nèi)副桿菌屬相對豐度、糞桿菌屬相對豐度、物種多樣性及均勻度均明顯低于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。糖調(diào)節(jié)受損患者經(jīng)激光干預(yù)后與干預(yù)前相比，擬桿菌門和副桿菌屬相對豐度、物種豐富度、多樣性及均勻度均顯著提高，鏈球菌屬相對豐度顯著下降。

腸道微生物群與人體自身的代謝緊密相連，基因測序技術(shù)的發(fā)展推動(dòng)了人類關(guān)于代謝性疾病與腸道菌群之間關(guān)系的探索進(jìn)程。腸道微生物群可以通過水解發(fā)酵食物中的多糖促進(jìn)代謝并產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFAs)，SCFAs主要由乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽組成，在腸道細(xì)胞增殖、肥胖整體調(diào)控、維持腸道微生態(tài)平衡以及提高宿主免疫力中起重要作用。擬桿菌門主要產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，厚壁菌門產(chǎn)生丁酸鹽，放線菌門的某些種屬可產(chǎn)生乙酸鹽和丁酸鹽，研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門豐度與T2DM呈負(fù)相關(guān)[12-13]，擬桿菌門豐度降低與肥胖有關(guān)[14]，放線菌門與T2DM呈負(fù)相關(guān)，且患者體內(nèi)致病菌志賀菌存在富集現(xiàn)象[15-17]，而與之結(jié)論相反的另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)糖尿病前期和T2DM患者腸道內(nèi)放線菌門豐度增加[18]，變形菌門為革蘭氏陰性菌，其外膜成分脂多糖可促進(jìn)內(nèi)毒素血癥、加重炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，干預(yù)前觀察組變形菌門相對豐度較高，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門相對豐度較低，經(jīng)過激光干預(yù)之后，擬桿菌門相對豐度顯著提高，厚壁菌門較干預(yù)前升高，變形菌門較前下降，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與本研究樣本量較小有關(guān)，仍需進(jìn)行大樣本隨機(jī)對照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，T2DM患者腸道內(nèi)雙歧桿菌屬、糞桿菌屬含量下降，雙歧桿菌和梭菌含量與血糖水平呈負(fù)相關(guān)[19-23]。Allin等[24]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病前期患者腸道梭菌屬下降，鏈球菌屬上升，另一研究卻發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬的相對豐度從血糖正常人群到糖尿病前期再到T2DM患者呈逐漸持續(xù)下降趨勢[25]。糖調(diào)節(jié)受損是糖代謝正常向糖尿病發(fā)展的關(guān)鍵階段，目前關(guān)于糖調(diào)節(jié)受損患者腸道菌群變化的研究較少。本研究顯示糖調(diào)節(jié)受損患者腸道菌群中的擬桿菌門豐度降低，副桿菌屬和糞桿菌屬相對豐度降低。α多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。Alpha多樣性主要與兩個(gè)因素有關(guān)：一是種類數(shù)目，即豐富度，主要包括Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Observed species；二是多樣性，群落中個(gè)體分配上的均勻性，主要包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Pielou’s evenness指數(shù)。有研究顯示α多樣性在糖尿病患者中是降低的[26]，且與糖代謝紊亂的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)[23]，但也有研究報(bào)道健康人和T2DM患者的 α 多樣性無顯著差異[25-27]。本研究顯示糖調(diào)節(jié)受損患者在物種多樣性及均勻度上均低于健康人。

經(jīng)980nm激光治療后，鏈球菌屬相對豐度降低, 副桿菌屬相對豐度升高，研究表明鏈球菌屬可觸發(fā)免疫紊亂，加重腸道炎癥反應(yīng)，而副桿菌屬能夠減少大腸桿菌誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥因子，增強(qiáng)上皮細(xì)胞的完整性，從而發(fā)揮抗炎作用[28-29]。α多樣性指數(shù)較治療前均有提高，表明腸道菌群的豐富度、多樣性及均勻度均得到改善。有研究表明，波長在600～700nm和780～1100nm的紅色或近紅外區(qū)域內(nèi)的激光可與人體細(xì)胞色素c氧化酶產(chǎn)生相互作用，刺激線粒體電子傳遞鏈并增加三磷酸腺苷的產(chǎn)生，影響活性氧的短暫爆發(fā)、一氧化氮和鈣離子水平的調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)組織修復(fù)和愈合以及新的蛋白質(zhì)合成[30-31]。既往有學(xué)者使用低能激光照射小鼠腹部，結(jié)果顯示治療后小鼠的微生物群多樣性發(fā)生變化，與健康微生物群相關(guān)的細(xì)菌的數(shù)量明顯增加[32]。對人類個(gè)體進(jìn)行同樣的研究發(fā)現(xiàn)，人類腸道微生物群也發(fā)生了變化：與健康微生物群相關(guān)的粘液阿克曼氏菌、雙歧桿菌屬和桿狀桿菌屬增加，而厚壁與擬桿菌比率降低，推測這一作用可能與光刺激的抗炎和氧化還原信號(hào)作用有關(guān)[33]。高能激光具有更好的組織穿透性和更大的功率，更具有優(yōu)勢。我們的研究顯示高能激光輻照后糖調(diào)節(jié)異?；颊叩哪c道菌群發(fā)生改變。

綜上，糖調(diào)節(jié)異?；颊呔航Y(jié)構(gòu)存在失衡，多樣性下降，而高能量激光干預(yù)能夠在一定程度上改變腸道菌群，提高腸道菌群的多樣性。本研究可為今后繼續(xù)探索激光對腸道菌群的干預(yù)作用提供思路?？蛇M(jìn)一步探討不同波長、頻率、能量、治療次數(shù)、治療時(shí)間等參數(shù)下激光對腸道菌群的影響效果，并增加血糖、糖化血紅蛋白、胰島素抵抗指數(shù)等觀察指標(biāo)，為激光作為一種新的糾正腸道菌群紊亂、延緩糖調(diào)節(jié)受損向糖尿病進(jìn)展的治療手段積累依據(jù)。由于腸道菌群影響因素眾多，諸如飲食習(xí)慣、作息規(guī)律以及患者血糖水平等，加之本次研究的樣本量較少，因此，仍需要更多基于嚴(yán)格控制影響因素的大樣本研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。