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        Angiopep-2修飾白藜蘆醇脂質(zhì)體的處方優(yōu)化與體外評價

        2022-12-27 12:35:40劉婉瀅李灃芮李學濤
        中草藥 2022年24期

        于 洋,孔 亮,劉婉瀅,李灃芮,李學濤

        Angiopep-2修飾白藜蘆醇脂質(zhì)體的處方優(yōu)化與體外評價

        于 洋,孔 亮,劉婉瀅,李灃芮,李學濤*

        遼寧中醫(yī)藥大學藥學院,遼寧 大連 116600

        制備Angiopep-2(Ang)修飾的白藜蘆醇(resveratrol,Res)脂質(zhì)體(Ang-Lip/Res),并對其進行處方優(yōu)化和體外腦靶向性研究。采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res,利用Box-Benhken響應面法對影響其包封率的3因素(磷脂的質(zhì)量濃度、磷脂與藥物的質(zhì)量比、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比)進行優(yōu)化處方最佳制備工藝并驗證脂質(zhì)體的包封率;采用磺酰羅丹明B蛋白法考察脂質(zhì)體對小鼠神經(jīng)細胞的毒性;采用流式細胞儀和熒光顯微鏡探究細胞攝取情況;構建體外血腦屏障模型,比較白藜蘆醇脂質(zhì)體(Res-Lip)跨越血腦屏障的能力。Ang-Lip/Res的最優(yōu)處方:磷脂的質(zhì)量濃度為4.4 mg/mL,磷脂與白藜蘆醇的質(zhì)量比為11∶1,磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為5.5∶1。按照最佳處方,以磷脂、膽固醇、DSPE-PEG2000及DSPE-PEG2000-Ang為膜材制備的Ang-Lip/Res包封率為(93.28±1.35)%。細胞毒實驗結(jié)果表明,50 μmol/L濃度以內(nèi),Ang-Lip/Res對小鼠神經(jīng)細胞N2a和bEnd.3無明顯毒性;體外細胞攝取實驗結(jié)果表明,與非靶向Res-Lip相比,Ang的修飾明顯增加了bEnd.3細胞對脂質(zhì)體的攝取,提高了脂質(zhì)體體外BBB滲透率。成功制備Ang-Lip/Res,可進一步應用于防治腦部疾病的研究。

        白藜蘆醇;Angiopep-2;脂質(zhì)體;細胞攝?。惑w外靶向性

        白藜蘆醇(3,5,4-三羥基二苯乙烯,resveratrol,Res)是一種存在于虎杖、花生和葡萄等植物中的多酚類化合物,因其具有多種保護健康的生物學特性,而備受國內(nèi)外專家學者的高度重視[1]。在相關報道中,白藜蘆醇表現(xiàn)出卓越的抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護活性,常用于腦部疾病的研究[2]。然而,白藜蘆醇存在水溶性低、穩(wěn)定性差、不能穿過高選擇性的血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)、生物利用度低等問題,嚴重阻礙了其應用。為了解決上述問題,研究人員做出了很多努力,其中研發(fā)納米給藥系統(tǒng)是較為有效的手段之一。脂質(zhì)體是目前應用最廣泛的納米給藥系統(tǒng),較其他納米給藥系統(tǒng)具有更好的生物相容性,在靶向遞藥、緩釋控釋及減小藥物毒性等方面均具備獨特優(yōu)勢。研究人員將白藜蘆醇包載在脂質(zhì)體的雙分子層閉合囊泡狀結(jié)構中,應用于阿爾茨海默病、帕金森病等腦部疾病的治療,相比于游離的白藜蘆醇,脂質(zhì)體使白藜蘆醇的生物利用度大幅提高[3]。此外,將合適的配體修飾在脂質(zhì)體表面,可以增加脂質(zhì)體的主動靶向性,實現(xiàn)藥物的精準遞送[4]。Angiopep-2(Ang)是Angiopeps家族中的一種人工肽,可以通過低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP)受體介導跨越BBB,常應用于修飾腦靶向遞藥系統(tǒng),增強BBB穿透率[5]。

        脂質(zhì)體的制備主要有乙醇注入法、硫酸銨梯度法、逆向蒸發(fā)法及薄膜分散法等,需根據(jù)藥物的性質(zhì)不同選擇合適的制備方法。薄膜分散法適用于脂溶性藥物脂質(zhì)體的制備,且操作簡單,白藜蘆醇是脂溶性藥物,宜采用薄膜分散法制備[6]?;诖?,本研究采用薄膜分散法制備Ang修飾的白藜蘆醇脂質(zhì)體(Ang modified resveratrol liposomes,Ang-Lip/ Res),通過Box-Behnken設計-響應面法優(yōu)化制劑處方工藝,并進一步對Ang-Lip/Res的神經(jīng)細胞毒性、體外靶向性、體外BBB滲透能力進行考察,以期為白藜蘆醇制劑研發(fā)提供參考。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        FA1004型電子天平,上海越平科學儀器有限公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;KQ3200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司,超聲功率150 W,工作頻率40 kHz;JY92-2D型超聲波細胞破碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;85-1型磁力攪拌器,鞏義市予華儀器有限責任公司;2010型液相色譜儀,UV檢測器,島津色譜工作站;Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),月旭科技股份有限公司;葡聚糖凝膠Sephadex G-50柱,上海華藍化學科技有限公司;WJ-80B-II型CO2細胞培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;T1-S型倒置熒光顯微鏡,日本Nikon公司;HBS-1096A型酶標儀,南京德鐵實驗設備有限公司。

        1.2 材料

        白藜蘆醇,大連美侖生物技術有限公司,批號J1101A,質(zhì)量分數(shù)≥97%;pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),北京索萊寶科技有限公司,批號1022Q021;二硬脂?;字R掖及?聚乙二醇-靶向多肽Ang(DSPE-PEG2000-Ang),遼寧中醫(yī)藥大學藥劑實驗室合成,質(zhì)量分數(shù)≥95%;蛋黃卵磷脂(egg yolk phosphatidylcholine,EPC),日本NOF公司,批號120015,質(zhì)量分數(shù)>98%;膽固醇,大連美侖生物技術有限公司,批號F0119A;磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB),大連美侖生物科技有限公司,批號MB1808-1;純凈水,杭州娃哈哈集團有限公司;香豆素,大連美侖生物科技有限公司,批號MB4815;白藜蘆醇分析對照品,成都普菲德生物科技有限公司,批號19042607,質(zhì)量分數(shù)≥99%;0.25%胰蛋白酶,美國Gibco公司,批號2186964;青霉素/鏈霉素溶液,大連美倫生物科技有限公司,批號MA0110-Aug-13G;甲醇為色譜純。

        小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3,中科院上海細胞庫;小鼠神經(jīng)瘤母細胞N2a,中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 Ang-Lip/Res的制備

        采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res,精密稱取適量DSPE-PEG2000-Ang、DSPE-PEG2000、白藜蘆醇、卵磷脂和膽固醇于50 mL圓底燒瓶中,加入甲醇超聲溶解,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇,此時圓底燒瓶內(nèi)壁形成一層均勻的薄膜;加入5 mL PBS,超聲振蕩使薄膜溶解;將混合液轉(zhuǎn)移至10 mL EP管中,冰浴下超聲波細胞粉碎機超聲10 min(單次超聲時長10 s,超聲間隔5 s),最后用0.22 μm聚碳酸酯膜擠壓2次,即得Ang-Lip/Res。

        采用同樣的方法制備不加DSPE-PEG2000-Ang的白藜蘆醇脂質(zhì)體(Res-Lip),不加白藜蘆醇的空白脂質(zhì)體(B-Lip)。

        2.2 白藜蘆醇含量測定的方法學建立

        2.2.1 空白溶液的制備 精密吸取1 mL的B-Lip和適量甲醇置于10 mL棕色量瓶中,超聲破乳,定容至刻度,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取1 mL的Ang-Lip/Res和適量甲醇置于10 mL棕色量瓶中,超聲破乳,定容至刻度,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對照品10 mg,以甲醇為溶劑,配成1.0 mg/mL的白藜蘆醇對照品母液。稀釋母液制成質(zhì)量濃度為0.01、0.10、0.19、0.28、0.37、0.46 mg/mL的系列對照品溶液,低溫避光保存,備用。

        2.2.4 色譜條件 色譜柱為Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫28 ℃;檢測波長306 nm;體積流量1.0 mL/min;流動相為甲醇-水(55∶45);進樣量10 μL。

        2.2.5 專屬性考察 精密吸取10 μL的白藜蘆醇對照品溶液(0.10 mg/mL)、供試品溶液和空白溶液,注入液相色譜儀。結(jié)果如圖1所示,白藜蘆醇色譜峰在5.9 min左右出現(xiàn),空白溶液無干擾,說明此色譜條件可用于該脂質(zhì)體中白藜蘆醇的含量測定,該方法專屬性良好。

        圖1 白藜蘆醇對照品溶液(A)、Ang-Lip/Res供試品溶液(B)、空白溶液(C)的HPLC圖

        2.2.6 線性關系考察 按“2.2.4”項色譜條件對“2.2.3”項中系列白藜蘆醇對照品溶液進樣分析,以系列白藜蘆醇對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(),對應的峰面積為縱坐標(),繪制標準曲線,進行線性回歸,得線性回歸方程=22 337+701.72,2=0.999 1。結(jié)果表明,白藜蘆醇在0.01~0.46 mg/mL線性關系良好。

        2.2.7 精密度試驗 取“2.2.3”項下白藜蘆醇對照品溶液,同1 d內(nèi)連續(xù)進樣6次,計算日內(nèi)精密度;連續(xù)進樣5 d,計算日間精密度。結(jié)果,日內(nèi)精密度RSD為0.44%,日間精密度RSD為0.57%,證明儀器精密度良好。

        2.2.8 重復性試驗 按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,按照“2.2.4”項色譜條件進行HPLC分析。結(jié)果白藜蘆醇峰面積的RSD為1.01%,結(jié)果表明該方法重復性良好。

        2.2.9 穩(wěn)定性試驗 按“2.1”項下方法制備Ang- Lip/Res,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,分別在制備后0、2、4、8、12、24 h時進樣測定,結(jié)果,白藜蘆醇峰面積的RSD為0.93%,結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.2.10 加樣回收率試驗 精密吸取1 mL B-Lip,1 mL白藜蘆醇對照品溶液于10 mL棕色量瓶中,加甲醇超聲破乳、定容,制成供試品溶液,平行6份,進樣分析。結(jié)果,白藜蘆醇的平均加樣回收率為102.25%,RSD為0.39%,表明該方法符合要求。

        2.2.11 最低檢測限和最低定量限 按“2.2.3”項方法制備白藜蘆醇對照品溶液,進樣檢測,當信噪比(/)=3時,對應的白藜蘆醇質(zhì)量濃度為檢測限;當/=10時,對應的白藜蘆醇質(zhì)量濃度為定量限。結(jié)果,白藜蘆醇檢測限為0.3 μg/mL,定量限為1.5 μg/mL。

        2.3 包封率測定

        2.3.1 過柱前脂質(zhì)體藥物含量 精密吸取1 mL Ang-Lip/Res,用PBS定容至5 mL,加等量甲醇超聲破乳混勻,過0.45 μm微孔濾膜,備用。

        2.3.2 過柱后脂質(zhì)體藥物含量 使用Sephadex G-50凝膠柱洗脫1 mL Ang-Lip/Res,將洗脫液用PBS定容至5 mL,加等量甲醇超聲破乳混勻,過0.45 μm微孔濾膜,備用。

        2.3.3 包封率的測定 將上述溶液進樣分析,根據(jù)回歸方程得白藜蘆醇的含量,計算包封率。

        包封率=過柱后脂質(zhì)體藥物含量/過柱前脂質(zhì)體藥物含量

        2.4 處方優(yōu)化

        在文獻調(diào)研及前期預試驗的基礎上,確定以磷脂的質(zhì)量濃度(1)、磷脂與藥物的質(zhì)量比(2)、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(3)這3個因素為考察對象,其中各因素的取值范圍:12.2~6.6 mg/mL,26∶1~16∶1,33∶1~8∶1;以Ang-Lip/Res包封率()為響應值進行考察。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面分析,建立擬合數(shù)學模型,描繪三維效應面圖,從效應面的較優(yōu)區(qū)域選取最優(yōu)處方。試驗因素水平設計及結(jié)果見表1,試驗方差分析結(jié)果見表2。

        利用Design-Expert 8.0.6.1軟件,根據(jù)表2所得試驗數(shù)據(jù)分別將影響因素與包封率進行多元2次項擬合,得到擬合方程為=51.551 10-8.217 051-2.474 102+36.102 803+0.104 5512+1.140 9113+1.542 0023-0.125 0012-0.270 2022-6.116 8032,2=0.964 6,<0.05。說明該模型能較好地反映出響應值的變化,可用于篩選Ang-Lip/ Res的最優(yōu)處方。

        表1 Box-Benhnken試驗設計及結(jié)果

        表2 回歸模型及方差分析

        對上述擬合模型進行顯著性檢驗。由表2可以看出,所建模型具有極高的顯著性(<0.01),而失擬項>0.05,表明失擬不顯著。模型的相關系數(shù)2=0.964 6,表明該模型與實際試驗擬合程度良好,用該模型分析和預測Ang-Lip/Res的制備工藝是合適的。通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對各因素之間的交互作用進行效應面分析,繪制因變量的等高線圖與3D響應面圖(圖2)。

        通過Design-Expert 8.0.6.1軟件進行分析優(yōu)化,結(jié)合脂質(zhì)體性狀要求,制備經(jīng)驗及脂質(zhì)體制備的實際情況最終確定Ang-Lip/Res的最優(yōu)處方為14.4 mg/mL,211∶1,35.5∶1,DSPE-PEG20003.5 mg,DSPE-PEG2000-Ang 2 mg,超聲功率500 W,處方量5 mL。

        2.5 最優(yōu)處方確定和驗證

        根據(jù)優(yōu)化所得最佳處方,按相同條件制備3批Ang-Lip/Res進行驗證,結(jié)果3批Ang-Lip/Res的包封率分別為92.17%、93.02%、94.65%,平均包封率為(93.28±1.35)%,包封率的實測值與Box- Behnken響應面法預測值96.35%相近,表明所建立的數(shù)學模型具有良好的預測性,所選處方穩(wěn)定性與重現(xiàn)性良好。

        2.6 脂質(zhì)體的生物活性初步評價

        2.6.1 細胞的培養(yǎng) 將bEnd.3細胞和N2a細胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37 ℃、5% CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶+1 mmol/L EDTA為消化液進行消化和傳代。

        2.6.2 脂質(zhì)體對bEnd.3細胞和N2a細胞存活率的影響 采用SRB染色法對細胞存活率進行考察。以2.0×104個/孔的密度和1.8×104個/孔的密度將bEnd.3細胞和N2a細胞接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,根據(jù)預實驗結(jié)果加入不同濃度的白藜蘆醇、B-Lip、Res-Lip、Ang-Lip/Res,以DMEM培養(yǎng)基為空白對照,每個濃度設置5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用10%三氯乙酸固定,蒸餾水洗,SRB染色,晾干,1%冰醋酸洗,加入Tris緩沖液振搖30 min,540 nm處測量樣品吸光度()值。細胞存活率=A/0(式中A為給藥組的值,0為空白對照組的值),各組細胞存活率測定結(jié)果見表3。數(shù)據(jù)顯示,在0~50 μmol/L,B-Lip、Res-Lip和Ang-Lip/Res組細胞存活率在90%以上,白藜蘆醇組細胞存活率比脂質(zhì)體組低,表明將藥物制成脂質(zhì)體可減弱藥物毒性;在0~50.0 μmol/L制劑膜材對細胞無明顯毒性,給藥制劑組不會損傷神經(jīng)細胞活力,可用于進一步的實驗研究。

        圖2 各因素(X1, X2, X3)與響應值包封率的三維效應面圖和等高線圖

        2.6.3 脂質(zhì)體體外攝取情況考察

        (1)熒光探針脂質(zhì)體的制備:由于白藜蘆醇不具有熒光性,因此本實驗選用具有熒光性的香豆素作為熒光探針來評價脂質(zhì)體的體外細胞攝取情況。精密稱取處方量的EPC、膽固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-Ang及香豆素于圓底燒瓶中,按“2.4”項所述最優(yōu)處方的方法制備B-Lip、香豆素脂質(zhì)體(coumarin liposome,Cou-Lip)及Angiopep-2修飾的香豆素脂質(zhì)體(Ang-Lip/Cou)。

        (2)熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體攝取情況:將bEnd.3細胞以1.5×105個/孔接種于48孔板中培養(yǎng)24 h。將B-Lip、Cou-Lip和Ang-Lip/Cou加到細胞板中(各孔中香豆素的終濃度均為3 μmol/L。以B-Lip作為對照,每組3個復孔),繼續(xù)孵育1 h,DAPI室溫避光染色15 min,利用熒光顯微鏡觀察熒光強度并拍照,結(jié)果如圖3所示,可見,與Cou-Lip組(熒光強度309 207.00±11 792.04)相比,Ang-Lip/Cou組(熒光強度345 500.66±9 812.65)熒光強度具有顯著性(<0.05)。結(jié)果顯示,對照組細胞未見香豆素攝取,給藥組具有明顯香豆素攝取,攝取效果為B-Lip<Cou-Lip<Ang-Lip/Cou,表明通過Ang修飾脂質(zhì)體可顯著增加細胞對藥物的攝取。

        表3 不同濃度制劑的細胞毒性

        圖3 不同脂質(zhì)體對bEnd.3細胞的攝取

        (3)流式細胞儀考察脂質(zhì)體攝取情況:細胞模型的建立同上述方法,bEnd.3細胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 h后,用冷PBS洗3次,消化后用0.3 mL PBS復懸,采用流式細胞儀測定與細胞結(jié)合的香豆素的熒光強度如圖4所示,可見,B-Lip組的熒光強度為19.13±1.53,與Cou-Lip組(熒光強度406.00±33.41)相比,Ang-Lip/Cou組(熒光強度451.33±9.29)熒光強度具有顯著性(<0.05)。流式細胞儀的測定結(jié)果與熒光顯微鏡觀察結(jié)果相一致,進一步驗證Ang-Lip/Cou在bEnd.3細胞中表現(xiàn)出更好的穿透性,使藥物更容易蓄積。

        2.6.4 脂質(zhì)體跨BBB能力的研究

        (1)熒光顯微鏡測定:依照文獻方法[7]利用bEnd.3細胞和N2a細胞共培養(yǎng)建立體外血腦屏障模型。將bEnd.3細胞以5×105細胞/孔的密度接種在Transwell板的上室,N2a細胞以1×105個/孔接種在下室,培養(yǎng)24 h后,將B-Lip、Cou-Lip和Ang- Lip/Cou用培養(yǎng)基稀釋后加至bEnd.3細胞層繼續(xù)培養(yǎng)2 h(香豆素的終濃度均為3 μmol/L。以B-Lip作為對照),處理時用PBS洗3次,加4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗3次,DAPI染色15 min,再次用PBS洗3次,自然揮干,用熒光顯微鏡觀察并拍照,見圖5。如圖5所示,B-Lip組N2a細胞無香豆素攝取,Cou-Lip(熒光強度3 760.67±144.69)和Ang-Lip/Cou(熒光強度4 072.79±84.85)表現(xiàn)為明顯的香豆素攝取,且Ang-Lip/Cou組香豆素攝取效果最好,二者相比具有顯著性意義(<0.05),說明Ang的修飾增強了脂質(zhì)體體外BBB滲透率。

        圖4 熒光強度用流式細胞儀分析

        (2)流式細胞儀測定:體外BBB模型的建立同上述方法,bEnd.3細胞在含藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h后,PBS洗3次,0.25%胰酶消化收集細胞,PBS復懸,使用流式細胞儀檢測各組N2a細胞的熒光強度,評價靶向脂質(zhì)體透過血腦屏障的效率,如圖6所示,可見,B-Lip組的熒光強度為10.78±2.18,與Cou-Lip組(熒光強度172.00±4.36)相比,Ang-Lip/Cou組(熒光強度119.00±6.56)熒光強度具有顯著性(<0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果進一步確定Ang修飾后顯著提高脂質(zhì)體穿透BBB的轉(zhuǎn)運能力。

        圖5 通過顯微鏡觀察N2a細胞內(nèi)的熒光信號評估脂質(zhì)體在體外跨BBB的能力

        圖6 熒光強度用流式細胞儀分析

        3 討論

        BBB通過調(diào)節(jié)離子和大分子透過毛細血管壁擴散維持腦組織成分穩(wěn)定,保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)平衡,防止血液循環(huán)中的致病物質(zhì)進入大腦[7]。然而,BBB也會阻斷大部分藥物入腦,致使藥物難以在腦內(nèi)達到有效的治療濃度,給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療增大障礙[8]。

        長期以來,白藜蘆醇被廣泛報道具有較強的抗衰老[9]、神經(jīng)保護等生理活性[10-12]。但其尚存在水溶性差、難以跨越BBB、代謝迅速等問題,限制了其應用[13]。脂質(zhì)體是由磷脂和膽固醇合成的具有與細胞膜相似結(jié)構的納米遞藥系統(tǒng),它既能包載親水性藥物又能包載疏水性藥物,具有改善藥物溶解性,保持藥物活性,使藥物在血液中長效循環(huán)等優(yōu)勢[14]。此外,在脂質(zhì)體表面修飾合適配體,利用配體和受體特異性結(jié)合,可將脂質(zhì)體靶向遞送至受體過表達的病灶處,使脂質(zhì)體具有特異性靶向作用;在此基礎上,利用腦靶向基團識別腦血管內(nèi)皮細胞膜上內(nèi)源性受體即可實現(xiàn)脂質(zhì)體的主動腦靶向作用[15-16]。

        Ang是由19個氨基酸組成的能夠靶向低密度脂蛋白受體相關蛋白結(jié)構域的多肽,具有輔助納米載體穿透BBB的能力。研究表明,Ang修飾的納米載體,可以通過BBB上表達的LRP介導內(nèi)吞進入腦組織,且BBB穿透率比轉(zhuǎn)鐵蛋白,乳鐵蛋白高數(shù)十倍,大幅提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效果[17-19]。Ang修飾腦靶向給藥系統(tǒng)的制備方式有2種:①在已制備完成的納米給藥系統(tǒng)表面用Ang修飾;②將末端修飾的Ang共價連接到脂質(zhì)鏈或聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)鏈的末端與其他材料共同構建納米給藥系統(tǒng)。第1種方法較為靈活,但后處理步驟繁瑣。第2種方法操作簡便,有利于脂質(zhì)體的純化,且靶向肽裝載率更高[20]。因此,本研究利用DSPE-PEG2000-Ang與其他材料共同構建納米靶向遞藥系統(tǒng),制備Ang-Lip/Res。

        本研究采用薄膜分散法制備Ang-Lip/Res,通過Box-Behnken響應面法確定最優(yōu)處方,經(jīng)驗證脂質(zhì)體包封率在90%以上。本研究通過細胞毒實驗考察Ang-Lip/Res對神經(jīng)細胞存活率的影響,結(jié)果顯示低劑量Ang-Lip/Res具備生物安全性。此外,本研究進一步通過體外攝取實驗,驗證Ang修飾脂質(zhì)體在小鼠bEnd.3細胞中的攝取情況顯著高于未修飾脂質(zhì)體。Transwell實驗結(jié)果顯示Ang修飾脂質(zhì)體體外BBB滲透能力高于未修飾脂質(zhì)體。本制劑將為后續(xù)腦部疾病的治療與研究提供參考,為腦靶向制劑的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

        利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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        Preparation optimization andevaluationof Angiopep-2 modified resveratrol liposomes

        YU Yang, KONG Liang, LIU Wan-ying, LI Feng-rui, LI Xue-tao

        School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China

        To prepare and optimize the prescription of Angiopep-2 (Ang) modified resveratrol (Res) liposomes (Ang-Lip/ Res) and performbrain targeting study.The Ang-Lip/Res were prepared by thin film dispersion method, and the three factors [the egg yolk phosphatidylcholine (EPC) concentration, the mass ratio of EPC to cholesterol, and the mass ratio of to Res] affecting liposomes encapsulation rate were optimized using Box-Benhken response surface methodology, and the encapsulation rates of the liposomes were verified; The antiproliferation effect of liposomes on N2a and bEnd.3 cells was investigated by SRB assay. Flow cytometry and microscope were utilized for exploring the cellular uptake. Anmodel of the blood-brain barrier was constructed to compare the ability of resveratrol liposomes to cross the blood-brain barrier.The optimized preparation process and formulation were as follow: EPC concentration of 4.4 mg/mL, EPC to cholesterol mass ratio of 11:1, EPC to resveratrol mass ratio of 5.5:1. According to the optimal prescription, the encapsulation efficiency of Ang-Lip/Res prepared with EPC, cholesterol, DSPE-PEG2000and DSPE- PEG2000-Ang as membrane materials were (93.28 ± 1.35)%. The results of cytotoxicity assay showed that Ang-Lip/Res within 50 μmol/L concentration range was not significantly toxic to mouse neuronal cells N2a and bEnd.3 cells. Thecell uptake results showed that modification of Ang significantly increased uptake efficiency of Ang-Lip/Res by bEnd.3 cells compared to non-targeted Res-Lip and improved its BBB penetration.The Ang-Lip/Res is successfully prepared, which can be used for further research of prevention and treatment of brain diseases.

        resveratrol; Angiopep-2; liposomes; cellular uptake;targeting

        R283.6

        A

        0253 - 2670(2022)24 - 7706 - 08

        10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.008

        2022-06-27

        國家自然科學基金項目(81874347);遼寧中醫(yī)藥大學高層次引進人才科研啟動資金資助項目(2100221005);遼寧中醫(yī)藥大學2021年博士后啟動資金(21601A2100)

        于 洋(1994—),女,講師,研究方向為新型給藥系統(tǒng)。Tel: 15764399825 E-mail: yuqn0702@163.com

        李學濤(1979—),男,教授,博士生導師,研究方向為新型給藥系統(tǒng)。Tel: (0411)85890145 E-mail: lixuetao1979@163.com

        [責任編輯 鄭禮勝]

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