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        HPLC指紋圖譜和UPLC-Q-TOF-MS方法對芪冬頤心口服液中成分研究

        2022-12-27 12:32:52韓美欣張晨陽佟紅娜吳海峰許旭東孫桂波
        中草藥 2022年24期
        關(guān)鍵詞:中藥

        韓美欣,張晨陽,佟紅娜,吳海峰,許旭東,于 淼,孫桂波, 3, 4

        HPLC指紋圖譜和UPLC-Q-TOF-MS方法對芪冬頤心口服液中成分研究

        韓美欣1,張晨陽2,佟紅娜2,吳海峰2,許旭東2,于 淼1*,孫桂波2, 3, 4*

        1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心,黑龍江 哈爾濱 150076 2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193 3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基于經(jīng)典名方的新藥發(fā)現(xiàn)重點實驗室,北京 100193 4. 國家藥品監(jiān)督管理局 “藥物警戒研究與評價重點實驗室”,北京 100193

        建立芪冬頤心口服液的HPLC指紋圖譜,結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS方法對其成分進行歸屬,為芪冬頤心口服液質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。建立10批次芪冬頤心口服液指紋圖譜,采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)”進行相似度評價,方法學(xué)考察精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性,同時應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS方法對其成分進行鑒別和歸屬。10批次芪冬頤心口服液指紋圖譜中有7個共有峰,指紋圖譜相似度大于0.99。同時應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS方法,正離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出25個成分,負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出17個成分,正、負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)共同鑒定出9個成分,并對每個共有峰進行單味藥材歸屬。HPLC指紋圖譜結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS方法準確可靠,重復(fù)性和穩(wěn)定性較好,可為芪冬頤心口服液的質(zhì)量控制提供參考。

        芪冬頤心口服液;指紋圖譜;UPLC-Q-TOF-MS;毛蕊異黃酮;甲基麥冬黃烷酮A;甘露三糖;地黃苷D

        芪冬頤心口服液是源于我國名老中醫(yī)專家任繼學(xué)先生的經(jīng)驗用方,具有益氣養(yǎng)心、止悸安神的功效[1],臨床上用于治療病毒性心肌炎、呼吸感染引起的心肌損傷,也可用于治療氣陰兩虛所致的心悸、胸悶、胸痛、氣短乏力、失眠多夢、自汗、盜汗、心煩、病毒性心肌炎、冠心病心絞痛等,其主要由黃芪、麥冬、人參、茯苓、地黃、燙龜甲、煅紫石英、桂枝、淫羊藿、金銀花、丹參、郁金、炒枳殼,經(jīng)水提、醇沉等工藝制作而成[2-13]。中藥化學(xué)成分復(fù)雜,質(zhì)量控制是其研究的難點,檢測其中一種成分不能代表整體藥效。中藥指紋圖譜能全面、定量反映中藥所包含的化學(xué)信息,成為中藥質(zhì)量控制最常見的有效手段[14]。

        目前,尚未有關(guān)建立芪冬頤心口服液指紋圖譜的研究報道。由于中藥復(fù)方多途徑、多靶點協(xié)同作用的藥效特點,使中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究成為解決中藥復(fù)方化學(xué)成分眾多的一大難點[15-16]。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是指中藥針對某一病癥發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)總和,它是研究中藥藥效和作用機制的關(guān)鍵,也是中藥質(zhì)量控制的基礎(chǔ)[17]。因此本研究通過HPLC建立了芪冬頤心口服液的指紋圖譜,并對其進行相似度評價;同時結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS方法進行成分歸屬,正離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出25個成分,負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出17個成分,正、負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)共同鑒定出9個成分,并對化合物來源進行歸屬,3個來源于黃芪、2個來源于人參、7個來源地黃、2個來源于枳殼、5個來源于麥冬、2個來源于淫羊藿、5個來源于茯苓、2個來源于桂枝、1個來源于郁金、3個來源于丹參、1個來源于金銀花,為完善芪冬頤心口服液的質(zhì)量標準和實現(xiàn)后續(xù)相關(guān)制劑的深度質(zhì)量控制提供依據(jù)。

        1 材料與儀器

        Acquity超高效液相色譜儀(配PDA檢測器)、SynaptTM G2 Q-TOF質(zhì)譜系統(tǒng)、電噴霧離子源(ESI)、MassLynx V4.1質(zhì)譜工作站(美國Waters公司);甲醇(色譜純,Sigma-Aldrich);甲酸(質(zhì)譜純,賽默飛世爾科技有限公司);娃哈哈純凈水;10批(190311、190521、190527、190713、190724、190316、190917、190928、191114、191119)芪冬頤心口服液制劑編號為S1~S10(通化白山藥業(yè)股份有限公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 芪冬頤心口服液HPLC指紋圖譜的建立

        2.1.1 樣品制備 將每個批次的芪冬頤心口服液用純凈水稀釋10倍,0.22 μm濾膜濾過。

        2.1.2 色譜分析條件 色譜柱為Waters SunFire- HPLC C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫:0~25 min,5%~20% A;25~40 min,20%~35% A;40~50 min,35%~40% A;50~55 min,40%~42% A;55~70 min,42%~45% A;70~100 min,45%~90% A;柱溫為35 ℃,體積流量1 mL/min,進樣量為4 μL,檢測波長為262 nm。

        2.1.3 精密度試驗 取“2.1.1”項下制備的樣品溶液(S1樣品)適量,按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。將6號色譜峰(出峰時間適中且峰型較好,下同)作為參照峰(S),計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD為0.12%~1.10%,相對峰面積的RSD為0.21%~3.98%,表明儀器精密度良好。

        2.1.4 重復(fù)性試驗 取S1樣品6份,按“2.1.1”項下制備的樣品溶液適量,再按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。將6號色譜峰作為參照峰(S),計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%~0.34%,相對峰面積的RSD為0.14%~4.15%,表明該方法重復(fù)性良好。

        2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.1”項下制備的樣品溶液(S1樣品)適量,于室溫放置0、2、5、10、30 h后,按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,記錄色譜圖。將6號色譜峰作為參照峰(S),計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD為0.14%~1.18%,相對峰面積的RSD為0.41%~3.64%,表明樣品溶液在室溫放置30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.1.6 指紋圖譜建立及相似度評價 分別取10批芪冬頤心口服液,按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液,然后按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。采用Empower軟件提取色譜圖,將10批次樣品的色譜圖用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(A版)》進行指紋圖譜的合成與處理并進行相似度評價。用S6樣品(批號190316)作為對照圖譜(R)。指紋圖譜見圖1,相似度見表1。從圖1芪冬頤心口服液HPLC指紋圖譜可以看出,10個批次的芪冬頤心口服液的化學(xué)成分總體來看較為穩(wěn)定,結(jié)合表1的相似度可知,10個批次的口服液相似度均在0.999及以上,表明10批口服液的化學(xué)成分具有很高的相似度。說明各個批次的芪冬頤心口服液質(zhì)量穩(wěn)定??梢赃M一步對其進行定性分析。

        圖1 10批芪冬頤心口服液指紋圖譜

        表1 10批芪冬頤心口服液相似度

        2.2 芪冬頤心口服液主要成分定性分析

        2.2.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為Waters Acquity-UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相為甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B),梯度洗脫:0~10 min,5%~35% A;10~40 min,35%~55% A;40~50 min,55%~60% A;50~63 min,60%~90% A;柱溫35 ℃,體積流量0.2 mL/min,進樣量為4 μL,采集時間63 min;采集波長200~400 nm。使用全掃描模式進行Q-TOF分析,電噴霧電離:正、負離子模式;毛細管電壓:3.0 kV(ES+)/2.3 kV(ES?);錐孔電壓:40 V;萃取錐孔電壓:3 V;離子源溫度:100 ℃;脫溶劑氣溫度:400 ℃(ES+)/400 ℃(ES?);反向錐孔氣體積流量:50 L/H;碰撞氣體積流量:0.5 mL/min;脫溶劑氣體積流量:600 L/H(ES+)/600 L/h(ES?);掃描時間:0.5 s;掃描時間間隔:0.02 s;質(zhì)荷比/50~1200,液相按1∶1分流進入質(zhì)譜。以娃哈哈純凈水作為背景對照,以芪冬頤心口服液樣品(批號190311)進樣。

        2.2.2 譜峰定性分析 取“2.1.1”項下制備的樣品溶液(S1樣品)適量,按“2.2.1”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣,記錄正離子模式總離子流圖與負離子模式總離子流圖(為了避免純水溶劑對色譜圖形成干擾,在相同條件下測了純水的譜圖作為空白以扣除背景),見圖2、3。通過正、負離子模式質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析及與文獻比對[18-19],相互佐證共同確定成分9個,包括來自黃芪的毛蕊異黃酮,來自麥冬的甲基麥冬黃烷酮A、來自地黃的甘露三糖、地黃苷D等,結(jié)果見表2~3。

        2.2.3 主要成分鑒定 黃酮類化合物,以毛蕊異黃酮為例,負離子模式準分子離子峰為/283.060 5 [M-H]-,脫去1分子CH3形成碎片離子268.037 3 [M-H-CH3]-,再脫去1分子HCO形成碎片離子239.034 3 [M-H-CH3-HCO]-,再脫去1分子CO形成碎片離子211.039 0 [M-H-CH3-HCO-CO]-,再脫去1分子CH3形成碎片離子195.044 9 [M-H-2CH3-HCO-CO]-,結(jié)合文獻報道[20],黃芪中含有毛蕊異黃酮,其/為283.060 6,根據(jù)裂解碎片信息判斷該化合物可能為毛蕊異黃酮。

        圖2 芪冬頤心口服液正離子模式總離子流圖

        圖3 芪冬頤心口服液負離子模式總離子流圖

        3 討論

        3.1 色譜條件的優(yōu)化

        芪冬頤心口服液為中藥復(fù)方,成分復(fù)雜,采用等梯度洗脫的色譜條件難以分離各種成分,因此采用梯度洗脫的方法。前期分別考察了不同流動相及比例(甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液)、柱溫(35、45、55 ℃)對芪冬頤心口服液色譜圖的影響,通過對比色譜圖的整體峰形、分離度及響應(yīng)度,優(yōu)選以甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相,柱溫為35 ℃的檢測條件。

        3.2 波長的優(yōu)化

        芪冬頤心口服液指紋圖譜檢測采用全波長掃描紫外檢測器,經(jīng)過全波長掃描后發(fā)現(xiàn)在262 nm處的峰數(shù)量相對較多,檢測靈敏度較高且分離度較好,故選擇262 nm作為指紋圖譜研究的檢測波長。

        3.3 結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS定性化學(xué)成分與該制劑功效關(guān)系

        芪冬頤心口服液全方含13味中藥材,經(jīng)水提、醇沉等工藝制作成復(fù)方中藥口服液,具有益氣養(yǎng)心、安神止悸的功效,可用于治療肝腎不足、氣陰兩虛所致的心悸、胸悶、胸痛、氣短乏力、失眠多夢、自汗、盜汗、心煩;病毒性心肌炎、冠心病心絞痛等證候。

        表2 UPLC-Q-TOF-MS正離子鑒別芪冬頤心口服液中的化學(xué)成分

        *代表正、負離子模式下共同鑒定的成分

        *represents components identified in both positive and negative ion modes

        其中黃芪味甘,性微溫,主入脾肺二經(jīng),具有補氣升陽、固表止汗、生津養(yǎng)血等功效;人參性平,歸脾、肺、心經(jīng),具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺和安神等功效,二者均為補氣主藥,黃芪和人參的有效成分:黃芪多糖和人參多糖配伍應(yīng)用可增強機體活力增強免疫功能;黃芪皂苷(黃芪甲苷)和人參皂苷(人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1等)配伍應(yīng)用可增強抗腦缺血再灌注損傷[21-23]。麥冬味甘、微苦,性微寒,歸心、肺、胃經(jīng),有養(yǎng)陰生津、潤肺清心之功效,其主要活性物質(zhì)為甾體皂苷 [如25()- ruscogenin-1--β--xylopyranoside-3--α--rhamno- pyranoside] 在降低血糖濃度、抵抗心肌性缺血、保護局灶性腦缺血損傷等方面具有顯著療效,高異黃酮類化合物(如6-醛基異麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮A等)在抗炎、鎮(zhèn)咳、保肝、免疫調(diào)節(jié)等方面具有顯著療效[24]。

        表3 UPLC-Q-TOF-MS負離子鑒別芪冬頤心口服液中的化學(xué)成分

        4 小結(jié)

        指紋圖譜技術(shù)是目前國際上公認的天然藥物質(zhì)量控制的有效方式之一,突破以單一指標或幾個化學(xué)成分評價藥品質(zhì)量的限制,可以較為全面的反應(yīng)中藥所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量[25]。本實驗通過HPLC建立芪冬頤心口服液指紋圖譜,結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS方法進行成分歸屬,正離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出25個成分,負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)鑒定出17個成分,正、負離子質(zhì)譜數(shù)據(jù)共同鑒定出9個成分,并對化合物來源進行歸屬,3個來源于黃芪、2個來源于人參、7個來源地黃、2個來源于枳殼、5個來源于麥冬、2個來源于淫羊藿、5個來源于茯苓、2個來源于桂枝、1個來源于郁金、3個來源于丹參、1個來源于金銀花。本實驗為闡明芪冬頤心口服液的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制指標的選擇提供參考。

        利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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        Qualitative analysis of ingredients in Qidong Yixin Oral Liquid based on HPLC fingerprint and UPLC-Q-TOF-MS method

        HAN Mei-xin1, ZHANG Chen-yang2, TONG Hong-na2, WU Hai-feng2, XU Xu-dong2, YU Miao1, SUN Gui-bo2, 3, 4

        1. Drug Engineering and Technology Research Center, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China 2. Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China 3. Key Laboratory of New Drug Discovery Based on Classic Chinese Medicine Prescription, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100193, China 4. Key Laboratory for Research and Evaluation of Pharmacovigilance, NMPA, Beijing 100193, China

        The HPLC fingerprint of Qidong Yixin Oral Liquid (芪冬頤心口服液) was established, and its components were assigned by UPLC-Q-TOF-MS method, providing theoretical basis for quality control of Qidong Yixin Oral Liquid.The fingerprint of 10 batches of Qidong Yixin Oral Liquid was established, and the(Version A) was used to evaluate the accuracy, repeatability and stability of the methodology. At the same time, the UPLC-Q-TOF-MS method was used to identify and classify its components.There were 7 common peaks in the fingerprint of 10 batches of Qidong Yixin Oral Liquid, and the similarity of fingerprint of 10 batches of Qidong Yixin Oral Liquid was greater than 0.99. At the same time, UPLC-Q-TOF-MS method was used to identify 25 components from positive ion mass spectrometry data, 17 components from negative ion mass spectrometry data, and 9 components from positive and negative ion mass spectrometry data, and each common peak was classified as a single medicinal material.HPLC fingerprint combined with UPLC-Q-TOF-MS method is accurate, reliable, reproducible and stable, which can provide reference for quality control of Qidong Yixin Oral Liquid.

        Qidong Yixin Oral Liquid; fingerprint; UPLC-Q-TOF-MS; calycosin; methylophiopogonanone A; manninotriose; rehmannioside D

        R284.1

        A

        0253 - 2670(2022)24 - 7679 - 07

        10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.005

        2022-03-05

        吉林省科技發(fā)展計劃項目(20200708039YY);中央支持地方改革發(fā)展基金資助項目(2020YQ12);黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(YQ2020H024)

        韓美欣(1997—),女,碩士研究生。E-mail: 920580862@qq.com

        于 淼,男,研究員,博士生導(dǎo)師,從事中藥開發(fā)與應(yīng)用。E-mail: yumiao913@163.com

        孫桂波,女,教授,博士生導(dǎo)師,從事中藥及復(fù)方藥效基礎(chǔ)及分子機制研究。E-mail:sunguibo@126.com

        [責任編輯 王文倩]

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