曾杉，陳錦霞，林碧珊，陳偉彥，張汝瑩

國(guó)藥集團(tuán) 廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 佛山 528305

大棗Ziziphus jujubaMill.是鼠李科棗屬植物棗的果實(shí)，臨床上可作為營(yíng)養(yǎng)品食用，又可入藥，對(duì)人體具有補(bǔ)中益氣的功效［1］。我國(guó)大棗的主要產(chǎn)地為山東、河北、山西、河南、甘肅、新疆等地區(qū)。大棗在中藥復(fù)方中入藥的歷史十分悠久，在《傷寒論》《本草綱目》《千金翼方》等多部古籍中均有其藥用記載?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大棗在抗腫瘤、改善心腦血管循環(huán)、增強(qiáng)免疫力和造血功能等方面都有顯著的藥效作用［2-3］。大棗主要化學(xué)成分為核苷酸類(lèi)及其衍生物、皂苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)等，其中包括環(huán)磷腺苷（cAMP）、尿嘧啶、鳥(niǎo)苷、蘆丁、槲皮素、葡萄糖和鼠李糖等多種成分。cAMP 是大棗的主要水溶性成分之一，在成熟果實(shí)中含量最高，作為生理生化過(guò)程反向調(diào)節(jié)的第二信使，在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮重要作用［4-6］。標(biāo)準(zhǔn)湯劑是中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝和質(zhì)量的基準(zhǔn)樣品［7］。本研究參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》煎煮方式［8］，制備了15 批大棗飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，考察大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、cAMP 含量及轉(zhuǎn)移率、特征圖譜三大指標(biāo)，旨在建立大棗配方顆粒產(chǎn)品質(zhì)量的科學(xué)控制方法。

1 材料

1.1 儀器

H-class 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；MS105DU 型十萬(wàn)分之一天平、2002 型萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗儀（昆山儀器儀表有限公司）；Sunergy UV 型超純水儀（默克公司）；2 L 電控溫煎藥壺（深圳一枚王有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品cAMP（批號(hào)：140709-201404，純度：99.8%）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-201610，純度：91.6%）、鳥(niǎo)苷（批號(hào)：111977-201501，純度：93.6%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

大棗樣品分別從河南、山東、山西、甘肅、河北等主產(chǎn)地購(gòu)得，經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實(shí)，按《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》）2020 年版標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)全部合格，參考《中國(guó)藥典》2020 年版大棗項(xiàng)下炮制方法制成飲片，除去雜質(zhì)，洗凈，曬干，破開(kāi)2～4 瓣。樣品信息見(jiàn)表1。

表1 大棗樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率測(cè)定

取大棗飲片100 g，置于2 L 電控溫煎藥壺中，加水煎煮2 次。第1 次加入水800 g，浸泡30 min，文火煎煮60 min，煎液經(jīng)350 目濾布趁熱濾過(guò)，擠壓濾布至無(wú)明顯濾液滲出。第2 次加入水600 g，文火煎煮55 min，煎液用350目趁熱濾過(guò)，合并2次濾液后冷卻，將合并后的濾液減壓濃縮至約200 g浸膏，在磁力攪拌下，浸膏加水稀釋至固體質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%，再分裝至10 mL棕色西林瓶中，每瓶分裝體積為5 mL，半加塞，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，得大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，稱(chēng)質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算出膏率。

2.2 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP的含量測(cè)定

本研究參考了《美國(guó)草藥典》2021 年版［9］中收載的大棗果實(shí)標(biāo)準(zhǔn)中cAMP 含量測(cè)定色譜條件和供試品溶液制備方法，并進(jìn)行了專(zhuān)屬性、線(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等方法學(xué)考察，證明了該方法能準(zhǔn)確用于測(cè)定大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP 的含量。

2.2.1 色譜條件 Eclipse C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；以甲醇-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀（8∶92）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取cAMP對(duì)照品約10 mg，精密稱(chēng)定，置200 mL 量瓶中，加40%甲醇至刻度，搖勻，制成cAMP 質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品約0.2 g，精密稱(chēng)定，置20 mL 具塞量瓶中，加入40%甲醇適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，用40%甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 專(zhuān)屬性考察 取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S10）、對(duì)照品溶液和空白溶劑同時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，表明cAMP色譜峰專(zhuān)屬性好，不受空白溶劑干擾。

圖1 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑專(zhuān)屬性考察色譜圖

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取配制成1.073、5.365、10.730、21.460、42.920、85.840 μg·mL-1的cAMP 對(duì)照品溶液各1 μL 進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）峰面積，cAMP 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，線(xiàn)性回歸方程：Y=0.704 6X-0.040 7（r=1.000 0），表明質(zhì) 量濃度 為1.073～85.840 μg·mL-1時(shí)cAMP與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取同一批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S10），連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果cAMP峰面積RSD為0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S10），分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定cAMP峰面積RSD為0.3%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S10），按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)定cAMP含量RSD為0.8%，表明重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S10）約0.2 g，精密稱(chēng)定，平行稱(chēng)取6 份，分別按1∶1 加入cAMP 對(duì)照品后，按2.2.3項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，測(cè)定cAMP含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。cAMP 平均加樣回收率為99.7%，RSD 為0.4%，表明該方法回收率良好。

表2 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜方法測(cè)定

2.3.1 特征圖譜方法的建立 本研究參照《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》［10］，采用超高效液相色譜法（UPLC）建立了大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜方法，并對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了考察，結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)掃描，分別比較了210、230、254、300 nm 4 個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，基線(xiàn)平穩(wěn)且干擾較小，可以檢測(cè)到更多色譜峰且分離度較好，因此，綜合考慮選254 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。另外通過(guò)對(duì)比考察甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸和乙腈-0.1%磷酸水溶液3 種不同流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸水溶液的峰個(gè)數(shù)、峰形和分離效果更好，綜合考慮選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為特征圖譜流動(dòng)相。同時(shí)比較了水、50%甲醇、甲醇3 種不同提取溶劑的差異。選擇提取溶劑為水時(shí)，提取峰個(gè)數(shù)最多，峰分離效果最優(yōu)，最終確定特征圖譜的色譜條件和供試品制備方法。

2.3.2 特征圖譜色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，0%B；3～12 min，0%～10%B；12～25 min，10%～20%B；25～30 min，20%～95%B）；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：1 μL；理論板數(shù)按cAMP峰計(jì)應(yīng)不低于10 000。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 分別取cAMP、鳥(niǎo)苷、蘆丁對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加40%甲醇制成質(zhì)量濃度均為50 μg·mL-1的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品約0.4 g，精密稱(chēng)定，置10 mL 具塞量瓶中，加水適量，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，用水定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.3.5 對(duì)照品指認(rèn)考察 分別取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S7）、cAMP、鳥(niǎo)苷、蘆丁對(duì)照品溶液同時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果分別指認(rèn)了峰5、峰6和峰11分別為鳥(niǎo)苷、cAMP和蘆丁。

圖3 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照品指認(rèn)色譜圖

2.3.6 精密度試驗(yàn) 取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S7）連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP 的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，結(jié)果見(jiàn)表3～4，表明儀器精密度良好。

表3 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜精密度試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間

表4 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜精密度試驗(yàn)相對(duì)峰面積

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液（編號(hào)：S7），分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，結(jié)果見(jiàn)表5～6，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表5 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)保留時(shí)間

表6 大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜穩(wěn)定性試驗(yàn)的相對(duì)峰面積

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份供試品進(jìn)樣測(cè)定，以峰6為S峰，各特征峰與參照峰cAMP的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

2.4.1 出膏率結(jié)果 根據(jù)15批大棗飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑平均出膏率為47.94%，按照大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均值的70%～130% 計(jì)算其波動(dòng)范圍為33.56%～62.32%，按照大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率計(jì)算其波動(dòng)范圍為36.90%～55.73%。出膏率均值的70%～130%和波動(dòng)范圍相差不大。為嚴(yán)格控制大生產(chǎn)中的大棗配方顆粒的出膏率，保證大棗配方顆粒的質(zhì)量均一穩(wěn)定，結(jié)合15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率波動(dòng)范圍，取15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均值的70%～130%，即33.56%～62.32%。15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率為36.90%～55.73%也在此范圍內(nèi)，表明不同產(chǎn)地的大棗出膏率均一穩(wěn)定。

2.4.2 轉(zhuǎn)移率結(jié)果 采用《美國(guó)草藥典》2021年版第三部收載的大棗果實(shí)標(biāo)準(zhǔn)［9］中cAMP含量測(cè)定方法完成了15批飲片的測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定大棗飲片質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.010%。結(jié)果顯示15批大棗飲片中，cAMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.010%～0.044%（表7），均符合規(guī)定。采用相同方法對(duì)15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行含量測(cè)定，并按公式（2）計(jì)算cAMP轉(zhuǎn)移率。結(jié)果顯示15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.013%～0.052%；cAMP 轉(zhuǎn)移率為48.06%～72.86%，平均轉(zhuǎn)移率為（59.82±17.95）%。為合理控制大生產(chǎn)中cAMP的轉(zhuǎn)移率，規(guī)定cAMP轉(zhuǎn)移率取均值的70%～130%較為合理，上述15批樣品全在該范圍內(nèi)，能較為客觀反映標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的轉(zhuǎn)移率特點(diǎn)。因此，大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP轉(zhuǎn)移率為48.06%～72.86%。

表7 15批大棗飲片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑cAMP含量和出膏率、轉(zhuǎn)移率

2.4.3 特征圖譜結(jié)果 測(cè)定15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征圖譜記錄色譜圖，采用“中藥色譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖4～5，最終確定11個(gè)穩(wěn)定的共有峰，11個(gè)共有峰峰面積占總峰面積比值達(dá)90%以上，符合中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求，計(jì)算15 批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均大于0.90，表明不同產(chǎn)地的大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑基礎(chǔ)化學(xué)成分具有較好的一致性。

圖4 15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜疊加圖

3 討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝

本研究參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》［8］和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》［11］，采用傳統(tǒng)煎煮方法制備大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑，根據(jù)方劑的性能確定煎煮時(shí)間，一般藥煮沸后再煎煮20～30 min，大棗屬于滋補(bǔ)類(lèi)藥物需用文火慢煎約1 min。每劑藥一般煎2 次，藥劑第二煎的時(shí)間略縮短。由于中藥飲片的質(zhì)地和吸水率相差較大，應(yīng)根據(jù)不同的飲片確定加水量，經(jīng)考察大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑的加水量浸過(guò)藥面2～5 cm 為宜，確定一煎加8 倍水，二煎加6 倍水。煎煮后經(jīng)350 目的濾布濾過(guò)，濾液迅速用水冷卻，防止成分受熱損失，合并2 次煎液后采用低溫減壓濃縮后凍干，制得大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。本研究考察了不同目數(shù)的濾布的濾過(guò)效果，最終選擇350 目濾布進(jìn)行固液分離；同時(shí)采用50 ℃低溫減壓進(jìn)行濃縮，保證標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的穩(wěn)定。

圖5 15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)照特征圖譜

3.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的應(yīng)用

本研究采用傳統(tǒng)水煎煮工藝制備了15批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑，結(jié)果出膏率為36.90%～55.73%，平均出膏率為（47.94±14.38）%。測(cè)定大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑中cAMP轉(zhuǎn)移率為48.06%～72.86%，平均轉(zhuǎn)移率為（59.82±17.95）%，測(cè)得的出膏率和轉(zhuǎn)移率均在標(biāo)準(zhǔn)湯劑《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中規(guī)定的70%～130%，具有較高的集中度，表明大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究符合技術(shù)要求。建立的大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜共確定11個(gè)特征峰，并通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)了鳥(niǎo)苷、cAMP和蘆丁3個(gè)已知成分。將多批結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）計(jì)算相似度，結(jié)果15 批大棗標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的特征圖譜相似度均高于0.90，表明不同產(chǎn)地的大棗飲片成分差異不大，質(zhì)量穩(wěn)定，上述結(jié)果可以作為大棗配方顆粒質(zhì)量控制依據(jù)，也能為其生產(chǎn)工藝提供質(zhì)量控制參數(shù)，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量。