范沾濤，劉寒，梁瑩，秦雙雙，韋范，李林軒，陸恒，吳廣秀，韋坤華*

1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室/廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心，廣西 南寧 530023；

2.中國藥科大學 江蘇省中藥評價與轉化重點實驗室，江蘇 南京 211198

在植物組織培養(yǎng)領域中，培養(yǎng)基是培養(yǎng)物生長分化的物質基礎，其組成成分對培養(yǎng)物生長和次生代謝物的形成和積累有至關重要的影響[1]。培養(yǎng)基中大量元素和微量元素都是生物必需的營養(yǎng)成分，大量元素中的氮是蛋白質、酶、葉綠素、維生素、核酸、磷脂、生物堿等的組成部分，在生命活動中占有首要位置，又稱生命元素[2]。氮素對植物生命活動及作物產(chǎn)量、品質均有極其重要的影響[3]。硝酸銨是一種重要的氮源，被廣泛用作激發(fā)劑以刺激植物生長和發(fā)育，在受控條件下誘導次級代謝產(chǎn)物[4]，可顯著促進葉綠素合成和營養(yǎng)物質積累[5]。MS 培養(yǎng)基是目前廣泛應用的植物組織培養(yǎng)基，其重要組分硝酸銨在高溫、高壓、有可被氧化的物質（還原劑）存在及電火花下會發(fā)生爆炸，特別是在生產(chǎn)、貯存、運輸、使用過程中，如處理不當或不采取相應預防措施，有可能導致嚴重的爆炸事故，存在巨大安全隱患。近年來，國家對此類物品的監(jiān)管越來越嚴格，其市場流通受到限制，實驗室購買硝酸銨的難度很大，給科研和生產(chǎn)帶來不便，有必要尋找硝酸銨的替代品。硝態(tài)氮（NO3--N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）是植物吸收的主要氮源[6]，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素可能為植物生長提供氮源。因此，本研究以山豆根組培苗為供試材料，評價不同種類銨鹽物質對硝酸銨的替代效果。

1 材料

供試材料由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室離體庫提供，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室韋坤華研究員鑒定為山豆根的基原植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep。

LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；FA2004 型電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；YP202N 型電子天平（上海舍巖儀器有限公司）；SKIH-1214 型可調式垂直單向潔凈工作臺（上海天恒醫(yī)療器械有限公司）；JZ-II型接種器械滅菌器（濟南普朗特生物科技有限公司）；DL91150型數(shù)顯游標卡尺（寧波得力工具有限公司）；GZX-GF101-1S 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

硫酸銨（批號：20200116）、氯化鈣（批號：20200103）、硫酸鎂（批號：20201203）、碘化鉀（批號：20210325）、鉬酸鈉（批號：20200320）、硫酸亞鐵（批號：20191203）、乙二胺四乙酸二鈉（批號：20200303）、煙酸（批號：20201029）、煙酸硫銨素（批號：20201014）、鹽酸吡哆醇（批號：20201025）、甘氨酸（批號：20210311）均購自國藥集團化學試劑廠；氯化銨（批號：20210401）、碳酸氫銨（批號：20210104）、尿素（批號：20210115）、磷酸二氫鉀（批號：20191206）、硫酸錳（批號：20191108）、硫酸鋅（批號：20200112）、氯化鈷（批號：20201012）、硫酸銅（批號：20201025）、肌醇（批號：20200915）均購自天津市大茂化學試劑工廠；硝酸銨（批號：20170515）、硝酸鉀（批號：20170503）均購自西隴化工股份有限公司；蔗糖（批號：20210413）、硼酸（批號：20201022）均購自天津市科密歐化學試劑有限公司；6-芐氨基嘌呤（6-BA，批號：B0015K0803011）、吲哚乙酸（IAA，批號：B0012K0323022）、激動素（KT，批號：B0017K0414012）、萘乙酸（NAA，批號：B0018K0321017）、瓊脂（批號：B0018K0628001）均購自北京康倍斯科技有限公司。

2 方法

2.1 不同培養(yǎng)基對叢生芽繼代增殖的影響

從原叢生芽繼代培養(yǎng)基上，取1 簇（含3 個芽）叢生芽接入以下5 種叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種5 簇，每種培養(yǎng)基接種9 瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強度為1500～2000 lx的培養(yǎng)室內培養(yǎng)；40 d 后統(tǒng)計其長葉枝條數(shù)（增殖的長葉枝條）、增殖芽苗數(shù)和鮮質量。

5 種叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基：1）對照培養(yǎng)基為MS+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；2）MS2 為MS（20.63 mmol·L-1氯化銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；3）MS3為MS（20.63 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；4）MS4為MS（20.63 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT；5）MS5 為MS（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+5.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1IAA+0.3 mg·L-1KT。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對照培養(yǎng)基MS中銨鹽（硝酸銨）的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊脂，pH為5.8～6.0。

2.2 不同培養(yǎng)基對叢生芽壯苗的影響

從原叢生芽壯苗培養(yǎng)基上，取2～3 cm 的莖段接入以下5種叢生芽壯苗培養(yǎng)基中，每瓶接種6株，每種培養(yǎng)基接種9 瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強度為1500～2000 lx 的培養(yǎng)室內培養(yǎng)；40 d 后統(tǒng)計其枝條數(shù)（增殖的枝條數(shù)）、株高（植株主莖最大高度）、莖粗（植株最下端莖部直徑）、葉數(shù)（增殖的葉數(shù)）和鮮質量。

5 種叢生芽壯苗培養(yǎng)基：1）對照培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1IAA；2）MS2為MS（20.63 mmol·L-1氯化銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；3）MS3 為MS（20.63 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；4）MS4 為MS（20.63 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA；5）MS5 為MS 培養(yǎng)基（20.63 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+1.0 mg·L-1IAA。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對照培養(yǎng)基MS 中銨鹽（硝酸銨）的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊 脂，pH 為5.8～6.0。

2.3 不同培養(yǎng)基對生根誘導的影響

從原叢生芽壯苗培養(yǎng)基上，取2～3 cm 的頂尖莖段接入以下5 種生根培養(yǎng)基中，每瓶接種6 株，每種培養(yǎng)基接種9瓶，接種后置于溫度為（25±2）℃、光照16 h/24 h、光照強度為1500～2000 lx 的培養(yǎng)室內培養(yǎng)；60 d 后統(tǒng)計其葉數(shù)（增殖的葉數(shù)）、株高（植株主莖最大高度）、平均根長、平均根系直徑、平均根干質量和生根率。平均根長、平均根系直徑、平均根干質量和生根率按公式（1）～（4）計算。

5 種生根培養(yǎng)基：1）對照培養(yǎng)基為1/2 MS+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；2）MS2 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1氯化銨 代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；3）MS3 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1碳酸氫銨代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；4）MS4 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1硫酸銨代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA；5）MS5 為1/2 MS（10.32 mmol·L-1尿素代替硝酸銨）+1.5 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IAA。氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素的用量根據(jù)對照培養(yǎng)基1/2 MS 里銨鹽（硝酸銨）里的氮量加入。所有培養(yǎng)基中均含30 g·L-1蔗糖和4.5 g·L-1瓊脂，pH為5.8～6.0。

2.4 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016 處理數(shù)據(jù)，用SPSS 26.0進行方差分析。數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素（one-way ANOVA）和最小顯著差異（LSD）法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 不同培養(yǎng)基對叢生芽繼代增殖的影響

由表1 和圖1 可知，山豆根叢生芽在MS2、MS3、MS4 和MS5 培養(yǎng)基均能繼代增殖。在MS4和MS5 培養(yǎng)基上生長的叢生芽在接種20 d 后開始發(fā)黃，長勢不好，長葉枝條數(shù)、增殖芽苗數(shù)和鮮質量都顯著低于對照組。山豆根叢生芽在MS2和MS3 培養(yǎng)基上生長旺盛，長葉枝條數(shù)和增殖芽苗數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。結果表明，硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根叢生芽繼代增殖培養(yǎng)，氯化銨或碳酸氫銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽繼代增殖培養(yǎng)。

圖1 不同培養(yǎng)基上繼代的山豆根叢生芽

表1 不同培養(yǎng)基對山豆根叢生芽繼代增殖的影響（,n=5）

表1 不同培養(yǎng)基對山豆根叢生芽繼代增殖的影響（,n=5）

注：同列不同小寫字母表示P＜0.05；表2～3同。

3.2 不同培養(yǎng)基對叢生芽壯苗的影響

由表2 和圖2 可知，MS2、MS3、MS4 和MS5培養(yǎng)基對山豆根枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質量有不同影響。在MS4 和MS5 培養(yǎng)基上生長的山豆根長勢不好，枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質量都顯著低于對照組。在MS3 培養(yǎng)基上生長的山豆根枝條數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，然而葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質量都顯著低于對照組。在MS2 培養(yǎng)基上生長的山豆根枝條數(shù)、葉數(shù)、株高、莖粗和鮮質量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。結果表明，碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根叢生芽壯苗的培養(yǎng)，氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽壯苗的培養(yǎng)。

圖2 不同培養(yǎng)基上山豆根叢生芽壯苗情況

表2 不同培養(yǎng)基對山豆根叢生芽壯苗的影響（,n=5）

表2 不同培養(yǎng)基對山豆根叢生芽壯苗的影響（,n=5）

3.3 不同培養(yǎng)基對生根誘導的影響

由表3 和圖3 可知，在MS2 培養(yǎng)基上生長的山豆根生根率最高，其次為對照培養(yǎng)基上生長的山豆根；在MS4 培養(yǎng)基上生長的山豆根平均根系直徑最大；對照培養(yǎng)基上生長的山豆根的葉數(shù)、株高和平均根長最好。在MS2、MS3、MS4 和MS5培養(yǎng)基上生長的山豆根根干質量顯著低于對照組。在MS2、MS3、MS4 和MS5 培養(yǎng)基上生長的山豆根長勢差，長出來的根少，葉數(shù)、株高和平均根長都顯著低于對照組。因此，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合誘導山豆根生根。

圖3 不同培養(yǎng)基上山豆根生根情況

表3 不同培養(yǎng)基對山豆根生根誘導的影響（,n=5）

表3 不同培養(yǎng)基對山豆根生根誘導的影響（,n=5）

4 討論

氮素是植物的最基本營養(yǎng)元素，并且是自然陸地生態(tài)系統(tǒng)的主要限制性元素，在植物生長過程中的各種生理代謝活動中發(fā)揮了十分重要的作用[7-9]。氮元素的施用在植物生態(tài)系統(tǒng)過程中會引起多種元素耦合關系效應，對多重化學元素的平衡關系有重要作用[10-12]。是植物吸收氮素的2 種離子形態(tài)，大量研究表明，NO3-有利于陽離子運輸，NH4+則抑制陽離子運輸[13-14]。與單純的硝態(tài)氮相比，硝酸銨的施用可增加作物的干物質積累和蛋白質含量[15]。銨態(tài)氮在不同環(huán)境脅迫條件下，不同作物品種會引發(fā)不盡相同的一系列調節(jié)作用[16-17]。氮素是影響植物生長和次生代謝產(chǎn)物積累的重要因素[18]。在MS 培養(yǎng)基中，氮源是重要的組成成分，硝酸銨是培養(yǎng)基中氮元素的主要來源，硝酸銨在MS 培養(yǎng)基中占大量元素質量的36.4%[19]。硝酸銨是危險管制試劑，純品硝酸銨在市場上禁止流通，這嚴重影響著組培產(chǎn)業(yè)的生存和正常生產(chǎn)，尋找硝酸銨有效替代品非常必要。有研究報道，以尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適于蘋果、草莓和葡萄組培苗的生長，以硫酸銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基中，蘋果、草莓和葡萄組培苗生長正常，這3 種植物葉片平展，葉色嫩綠，植物幼嫩組織含水量高，植株生長旺盛[20]。賈思振等[21]研究發(fā)現(xiàn)，用硫酸銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適于火焰南天竹再生。在本研究中，氯化銨、碳酸氫銨、硫酸銨或尿素代替硝酸銨的改良培養(yǎng)基對山豆根組培苗有著不同的影響。硫酸銨或尿素代替硝酸銨的培養(yǎng)基不適合山豆根組培苗的生長。碳酸氫銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽的繼代增殖。氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基適合山豆根叢生芽的繼代增殖和叢生芽壯苗培養(yǎng)。氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基對山豆根誘導生根有很大影響，原因有待進一步研究。氯化銨試劑相對安全、易獲取，在缺少硝酸銨的情況下，可將氯化銨代替硝酸銨的培養(yǎng)基用于山豆根叢生芽的繼代增殖和叢生芽壯苗培養(yǎng)。