韓曉玲，楊云，韋秋，蔡銘琪，毛浩萍

天津中醫(yī)藥大學 方劑學教育部重點實驗室，天津 301617

骨組織生命活動周期包括成骨細胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收，這一過程被稱為骨重塑。在骨重塑過程中，骨吸收水平大于骨形成水平時會使骨質(zhì)減少從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松（osteoporosis，OP）。OP 是最常見的骨重塑疾病之一，其特點是骨量降低，骨折風險升高。研究顯示，OP在發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折之前大多是隱秘不被發(fā)覺的，因此被稱為“沉默的殺手”[1]。

目前臨床治療OP的藥物，主要包括抑制破骨細胞吸收藥物如雌激素、降鈣素類及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等，以及促進骨形成藥物如特立帕肽等。然而上述療法或藥物在發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松藥效的同時還帶來骨肉瘤等風險，從而限制了其使用。干細胞移植治療雖然為OP 防治開辟了新方向[2]，但在臨床實際應(yīng)用中仍不成熟[3]，其有效性仍存有爭議。因此中醫(yī)藥治療OP成為新的研究方向。

2-乙?；锘ㄌ擒帐莵碓从谌馍惾刂械囊环N苯乙醇苷類物質(zhì)（圖1）[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，肉蓯蓉具有較好的抗OP作用，促進骨質(zhì)疏松性骨折愈合[5-8]。2-乙?；锘ㄌ擒兆鳛槿馍惾刂写硇曰衔铮蛔C明具有抗炎作用[9]，而炎癥無論在破骨細胞形成還是OP的病理生理發(fā)展過程中均扮演著極其重要的角色。本研究采用原代培養(yǎng)的單個核細胞，檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏蝹€核細胞向破骨細胞分化及其對骨吸收功能的影響，以期闡明2-乙?；锘ㄌ擒帐侨馍惾匕l(fā)揮抗OP作用的有效物質(zhì)及其可能的作用機制。

圖1 2-乙?；锘ㄌ擒盏幕瘜W結(jié)構(gòu)

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級4 周齡C57BL/6J 雌性小鼠10 只，購于北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號為SCXK（京）2016-0002，動物實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，倫理編號為TCM-LAEC2021156。

1.2 試藥

對照品2-乙?；锘ㄌ擒眨ㄅ枺篠A8050，純度≥98%）、RIPA裂解液（批號：20180615）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批號：20210930）、三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBS，批號：20181011）、曲拉通（批號：301G056）、紅細胞裂解液（批號：20220908）均購于北京索萊寶生物科技有限公司；青霉素及鏈霉素雙抗（批號：1950172）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號：0062819）均購于Biological Industries公司；胎牛血清（批號：04257，Ausbian公司）；Ficoll細胞分離液（批號：10272519，GE公司）；巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF，批號：W220014128017-21060719310003-018）、核轉(zhuǎn)錄因子-кB 受體活化因子配體（RANKL，批號：W220014945000-210624173210036-001）均購于美國R&D 公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（批號：04124，Sigma 公司）；TRAP 活性檢測試劑盒（批號：042821220519）、BCA 蛋白檢測試劑盒（批號：20210102）、DAPI溶液（批號：C1006）均購于碧云天生物技術(shù)有限公司；α-MEM培養(yǎng)基（批號：2105319）、Alex-Fluor 568 標記Factin（批號：HY1126）均購于賽默飛世爾科技公司；細胞增殖活性檢測試劑盒（CCK8，批號：22145325，Biosharp 公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）抗體（批號：GR3352902-4）、原癌基因c-Fos抗體（批號：GR3212874-1）均購于Abcam 公司；β肌動蛋白（β-actin）抗體（批號：UM4001，天津優(yōu)抗生物技術(shù)有限公司）；整合素β3（ITGβ3）抗體（批號：HN0810，Novus Biologicals公司）；辣根酶標記山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（批號：127917，北京中杉金橋生物技術(shù)公司）。

1.3 儀器

SPARK 型多功能酶標儀（TECAN 公司)；TS2-S-SM 型倒置顯微鏡（Nikon公司）；552BR066646型電泳槽、221BR 52209型半干轉(zhuǎn)、734BR4251型超靈敏多功能成像儀均購自Bio-Rad 公司；KB-900 型脫色搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 小鼠單個核細胞分離培養(yǎng)

實驗小鼠麻醉后脫頸處死，75%乙醇浸泡10 min。迅速分離出小鼠雙側(cè)脛骨與股骨浸泡在含10%雙抗的PBS液中。徹底分離肌肉組織后，用1 mL 注射器吹出骨髓組織，充分吹散后收集細胞液。使用75 μm細胞濾器將單個細胞收集至50 mL 無菌離心管中。隨后使用Ficoll細胞分離液分離單個核細胞，將細胞于250×g離心10 min 后使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，清洗細胞2遍，得到單個核細胞。

2.2 破骨前體細胞和破骨細胞誘導(dǎo)

單個核細胞用提前預(yù)熱的含25 ng·mL-1M-CSF的完全培養(yǎng)基（α-MEM+10%胎牛血清+1%雙抗）中重懸，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)過夜，非貼壁細胞即為破骨前體細胞。

收集破骨前體細胞，在M-CSF（25 ng·mL-1）和RANKL（50 ng·mL-1）條件下連續(xù)培養(yǎng)7 d，即為破骨細胞。

2.3 CCK8 法檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏ζ乒乔绑w細胞活性的影響

單個核細胞培養(yǎng)在含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)基中，密度為3×105個/孔。48 h后按照實驗設(shè)計分為對照組（含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)液）和不同濃度2-乙酰基毛蕊花糖苷給藥組（25 ng·mL-1M-CSF 中分別加0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒盏耐耆囵B(yǎng)液）干預(yù)7 d，每3 d 換1次培養(yǎng)液。最后1 d 加入含10% CCK8 溶液的完全培養(yǎng)液，37 ℃孵育2 h 后在450 nm 處檢測吸光度（A）值，按公式（1）計算細胞活力。

式中A給藥組表示具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度值；A空白組表示具有培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，沒有細胞的孔的吸光度值；A對照組表示具有細胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，沒有藥物溶液的孔的吸光度值。

2.4 TRAP染色及TRAP活性檢測

為研究2-乙?；锘ㄌ擒諏ζ乒羌毎只挠绊?，采用25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL聯(lián)合誘導(dǎo)破骨前體細胞向破骨細胞分化。實驗分為對照組（含25 ng·mL-1M-CSF 的完全培養(yǎng)液）、模型組（含25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL的完全培養(yǎng)液）、不同濃度2-乙酰基毛蕊花糖苷給藥組（25 ng·mL-1M-CSF 和50 ng·mL-1RANKL 中分別含0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒盏耐耆囵B(yǎng)液），干預(yù)7 d，每3 d換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)為成熟的破骨細胞。隨后用TRAP活性檢測試劑盒檢測各組細胞上清液中TRAP活性。用PBS潤洗細胞2次，于4%多聚甲醛中固定15 min，利用TRAP染色試劑盒進行TRAP染色。使用倒置顯微鏡拍攝染色圖像。

2.5 F-actin環(huán)染色

按2.4 項下方法分組，將破骨前體細胞誘導(dǎo)為成熟的破骨細胞后，棄去上清液。4%多聚甲醛固定細胞15 min，采用含0.1%曲拉通的PBS 對細胞透化。PBS 潤洗細胞并加入Alex-Fluor 568 標記的Factin 染料，37 ℃孵育40 min。再次洗滌細胞后，DAPI復(fù)染10 min。洗滌細胞后在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，采集圖像后采用Image Pro 6.0分析圖像。

2.6 骨陷窩形成實驗

將破骨前體細胞接種于放有骨切片的培養(yǎng)板中，按2.4 項下方法分組培養(yǎng)細胞，7 d 后采用次氯酸鈉溶液除去涂層板上的細胞。倒置顯微鏡下觀察骨吸收程度，獲得骨吸收圖像并用Image Pro 6.0分析圖像。

2.7 蛋白印跡法（Western blot，WB）分析

6 孔板中培養(yǎng)破骨細胞，吸棄細胞上清液，采用預(yù)冷的PBS 潤洗1 次。按60 μL/孔加入RIPA 和PMSF（100∶1），在冰上裂解總蛋白15 min。將懸浮液在4 ℃，15 000×g離心10 min，上清液收集至新的離心管中即為總蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度。加入適量的上樣緩沖液，在100 ℃煮沸5 min。接著使用8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測目標蛋白的表達（總蛋白40 μg/孔），60 V 電泳30 min、120 V電泳60 min，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，用TBST 稀釋（1∶1000）兔多克隆抗體ITGβ3、c-Fos、TRAP 在4 ℃孵育過夜。次日，將膜在TBST 中清洗3 次（5 min/次），接著與相應(yīng)的二抗（1∶10 000）在室溫條件下孵育2 h。最后加化學發(fā)光底液顯影檢測，采用Image Pro 6.0分析圖像。

2.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 分析軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以（xˉ±s）表示。多組定量選用單因素方差分析。采用GraphPrism 7進行作圖處理。

3 結(jié)果

3.1 2-乙酰基毛蕊花糖苷對破骨細胞分化的影響

M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)單個核細胞聚集融合形成具有多核形態(tài)的TRAP 染色陽性細胞（圖2），提示模型組中破骨細胞形成增多。給予0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒? d后，TRAP陽性染色多個核細胞數(shù)量減少，且細胞形態(tài)明顯變小。進一步采用TRAP 活性檢測試劑盒對各組細胞酶活性進行檢測，結(jié)果見圖3，與對照組相比，誘導(dǎo)分化模型組細胞TRAP 酶活性顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙酰基毛蕊花糖苷均能顯著抑制M-CSF 和RANKL 誘導(dǎo)的細胞內(nèi)TRAP 酶活性的增加（P＜0.05），提示2-乙?；锘ㄌ擒站哂幸种破乒羌毎纬傻淖饔?。

圖2 破骨細胞TRAP染色圖

圖3 破骨前體細胞TRAP活性（,n=5）

3.2 2-乙酰基毛蕊花糖苷對破骨前體細胞的影響

破骨前體細胞活性實驗結(jié)果見圖4，與對照組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙酰基毛蕊花糖苷對破骨前體細胞活性無顯著影響。提示2-乙?；锘ㄌ擒找种破乒羌毎纬刹⒎鞘怯捎谄湟种破乒乔绑w細胞活性產(chǎn)生的。

圖4 破骨前體細胞的細胞活力（,n=6）

3.3 2-乙?；锘ㄌ擒諏俏展δ艿挠绊?/h3>

通常破骨細胞只有形成閉合F-actin環(huán)才具有骨吸收功能，因此，繼續(xù)采用F-actin染色來檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏ζ乒羌毎俏展δ艿挠绊懀▓D5～6）。與對照相比，模型組F-actin環(huán)數(shù)量及面積顯著增加，而0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙酰基毛蕊花糖苷抑制M-CSF和RANKL 誘導(dǎo)的F-actin 環(huán)的形成。進一步采用骨吸收陷窩實驗確證2-乙?；锘ㄌ擒盏目构俏展δ埽l(fā)現(xiàn)模型組骨吸收陷窩數(shù)量增多，而0.1、1.0、10.0 μmol·L-1的2-乙酰基毛蕊花糖苷顯著減少破骨細胞骨吸收形成的骨陷窩面積。

圖5 破骨細胞的F-actin染色和骨吸收陷窩實驗結(jié)果（100×）

3.4 2-乙?；锘ㄌ擒諏ζ乒羌毎纬商禺愋灾笜说鞍譚RAP、ITGβ3、c-Fos蛋白表達的影響

WB 檢測2-乙?；锘ㄌ擒諏ζ乒羌毎纬商禺愋灾笜说鞍椎挠绊懀Y(jié)果見圖7～8。與對照組相比，模型組破骨細胞形成特異性指標蛋白TRAP、ITGβ3和c-Fos 表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，0.1、1.0、10.0 μmol·L-12-乙?；锘ㄌ擒崭深A(yù)后可顯著降低ITGβ3、TRAP、c-Fos蛋白的表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖6 2-乙?；锘ㄌ擒湛蛊乒羌毎俏展δ艿挠绊懀?n=3）

圖7 破骨細胞WB結(jié)果圖

4 討論

人的一生中，骨組織一直處于由破骨細胞和成骨細胞介導(dǎo)的骨吸收和骨形成的骨重建過程。隨著骨重建的發(fā)生，骨形成大于骨吸收，從而人體骨骼得以生長。隨著衰老的發(fā)生或體內(nèi)激素水平的變化，出現(xiàn)骨吸收與骨形成之間失衡狀態(tài)，破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收大于成骨細胞介導(dǎo)的骨形成，從而出現(xiàn)骨量減少，最終形成OP[10]。因此，抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收或促進成骨細胞介導(dǎo)的骨形成成為抗OP藥物研發(fā)的兩個重要方向。其中，破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收功能異常在骨重塑過程中起著關(guān)鍵作用。因此，從抑制破骨細胞形成及功能角度出發(fā)，研究具有抗破骨細胞形成的藥物對抗OP藥物的研發(fā)具有重要意義[10]。本研究發(fā)現(xiàn)2-乙酰基毛蕊花糖苷在對破骨前體細胞活性未見顯著影響的前提下，具有顯著抑制M-CSF 和RANKL 共同誘導(dǎo)的細胞TRAP 酶活性的增加，減少多個核細胞形成的作用，提示2-乙?；锘ㄌ擒站哂酗@著的抗破骨細胞形成作用。此外，骨陷窩實驗表明2-乙?；锘ㄌ擒者M一步抑制破骨細胞功能。臨床上絕經(jīng)期OP、牙周病、類風濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性骨髓瘤等骨代謝性疾病均與破骨細胞的過度活躍密切相關(guān)[11-13]，提示2-乙酰基毛蕊花糖苷可以作為上述破骨細胞過度活性相關(guān)疾病的潛在藥物進行深入研究。

圖8 2-乙酰基毛蕊花糖苷對TRAP、ITGβ3、c-Fos蛋白表達的影響（,n=3）

破骨細胞由骨髓中單個核細胞在M-CSF 和RANKL 共同作用下，相互融合形成巨大的多核細胞，即成熟的破骨細胞。在破骨細胞分化過程中，細胞骨架F-actin 形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，以封閉下方區(qū)域并形成一個封閉的空間，其中通過吸收骨基質(zhì)和骨礦物質(zhì)產(chǎn)生吸收坑[14]。因此，骨陷窩的形成被認為是破骨細胞的典型標志[15]。因此，筆者研究2-乙?；锘ㄌ擒諏-actin 環(huán)的形成和骨吸收的影響，結(jié)果表明RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞產(chǎn)生更多的F-actin環(huán)和骨吸收坑，具有更強的骨吸收功能，這些特征可顯著被2-乙?；锘ㄌ擒找种啤３墒斓钠乒羌毎街诠趋辣砻?，高表達TRAP 行使骨吸收功能[16]。本研究結(jié)果顯示2-乙?；锘ㄌ擒诊@著抑制破骨細胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細胞TRAP 活性，抑制細胞內(nèi)TRAP 蛋白表達，表現(xiàn)出對破骨細胞活性較強的抑制作用。整合素蛋白家族是一組細胞表面的黏附分子，由α、β2條鏈（或亞單位）經(jīng)非共價鍵連接組成的異二聚體，與相鄰細胞上的特異性細胞外基質(zhì)蛋白或受體結(jié)合，參與調(diào)控包括增殖、存活、遷移及分化等多方面的細胞行為。ITGβ3是整合素家族中的一種亞單位，ITGβ3亞單位與αⅡb配對形成αⅡbβ3與纖維蛋白原和血管性血友病因子結(jié)合，在止血和血栓形成過程中介導(dǎo)血小板聚集[17]。ITGβ3亞單位還可與αⅤ結(jié)合形成αβ3，在破骨細胞中高度表達，參與破骨細胞形成[18]。因此，ITGβ3也被當成一個破骨細胞標志物而被廣泛應(yīng)用于破骨細胞形成相關(guān)研究中[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中ITGβ3蛋白表達增加，而2-乙酰基毛蕊花糖苷顯著抑制ITGβ3蛋白表達，與其抑制TRAP 蛋白及其酶活性結(jié)果一致。c-Fos 屬于Fos 轉(zhuǎn)錄因子家族，由位于染色體14 上的c-Fos 基因編碼。c-Fos 與c-Jun 異源二聚形成激活蛋白-1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖和分化中起重要作用的多個基因的轉(zhuǎn)錄，也參與了破骨細胞分化過程[20-21]。從本研究蛋白結(jié)果我們可以看出，2-乙酰基毛蕊花糖苷能調(diào)節(jié)c-Fos 蛋白含量，這可能是其抑制破骨細胞分化的潛在作用途徑。

隨著人口老齡化程度日益加重，我國OP 的防治形勢日益嚴峻。骨質(zhì)疏松癥及其嚴重骨折給個人、家庭和社會均帶來了沉重的負擔，為此抗OP藥物的研發(fā)變得尤為重要。近年來，雖然在抑制骨吸收、促進骨形成等方面抗OP 藥物日漸豐富，但是無論是藥物研發(fā)還是臨床抗OP 治療仍存在多方面問題。而中醫(yī)藥長期應(yīng)用于骨科相關(guān)疾病的臨床治療，在治療OP 等慢性疾病方面具有一定優(yōu)勢，本研究以肉蓯蓉中主要有效成分之一2-乙?；锘ㄌ擒諡檠芯繉ο?，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗破骨細胞形成及抗骨吸收的作用，為臨床OP治療藥物的進一步研發(fā)提供參考。