葉婷，余維巍，張存泰

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，武漢 430030；

2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院老年醫(yī)學科

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種以肺部氣流受限為主要特征的慢性、不可逆呼吸系統(tǒng)疾病，其臨床發(fā)病率及病死率比較高，嚴重影響患者的生活質量［1］。既往研究顯示，白細胞介素1β（IL-1β）與COPD急性加重頻率、中性粒細胞計數(shù)和C反應蛋白（CRP）水平均呈正相關關系［2］。IL-1β水平升高與COPD患者NLRP3炎癥小體激活以及中性粒細胞的活性密切相關，提示IL-1β與COPD患者的炎癥反應有關［3］。本課題組前期也發(fā)現(xiàn)，COPD患者支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β水平增高，IL-1β與其肺功能呈負相關關系、與急性加重頻率呈正相關關系。然而，目前關于IL-1β與COPD發(fā)生的臨床前期研究均以失敗告終［4］。因此，有必要深入研究IL-1β在COPD發(fā)生中的分子調控機制，發(fā)展恰當?shù)陌邢蛑委熓侄?。隨著高通量測序技術日漸成熟，已有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者的部分長鏈非編碼RNA（lncRNA）出現(xiàn)差異表達［5］，其中l(wèi)ncRNA MEG3被報道參與了COPD的疾病進展過程［6］。2020年5月—2021年11月，本研究觀察了沉默lncRNA MEG3對COPD小鼠肺組織、BALF中IL-1β表達及肺功能的影響，探討lncRNA MEG3是否通過IL-1β參與COPD小鼠的肺損傷?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料實驗動物：SPF級野生型雄性C57BL/6J小鼠32只，10～12周齡，體質量（24±2）g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心提供，許可證號：WYTJH（e）2019-0044。主要試劑：lncRNA MEG3 siRNA及陰性對照siRNA（NC siRNA）均購自上海吉瑪基因股份有限公司，分別溶解于不含RNA的無菌水中，取適量于室溫下孵育30 min，形成siRNA-Li?pofectamine和NC-Lipofectamine復合體（10 g/L）；小鼠IL-1β PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scien?tific公司，IL-1β抗體購自中國武漢賽維爾生物科技有限公司，IL-1β ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；大前門香煙（焦油10 mg、煙堿0.8 mg、CO 12 mg）購自上海卷煙廠。

1.2 COPD小鼠模型構建與分組處理將32只野生型C57BL/6J小鼠隨機分成control組、COPD組、COPD+NC組、COPD+siMEG3組，每組8只。除con?trol組小鼠外，均采用香煙煙霧煙熏的方法建立COPD模型，方法如下：將小鼠置于自制煙熏有機玻璃艙（40 cm×30 cm×16 cm）中，全身暴露在3支香煙的煙霧中，3次/天，每次間隔30 min，共持續(xù)12周。COPD+NC組、COPD+siMEG3組 同 時 尾 靜 脈 注 射siRNA-Lipofectamine、NC-Lipofectamine復 合 體2.5 mg/kg，control組、COPD組注射等量生理鹽水，1次/周，共注射12次。

1.3 標本獲取各組小鼠最后一次煙熏后，經4%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定，經下腔靜脈采血，靜置后低溫離心獲得血清，-70℃保存，同時取動脈血0.2 mL用于血氣分析。立即暴露氣管和雙肺，在氣管上段作一橫行切口，并夾閉左側主支氣管，用注射器經氣管切口向右肺緩慢注入4 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），并進行回收（回收率85%～95%），獲得BALF，重復3次；將第1次的BALF離心后取上清，-70℃保存，取其沉淀與后兩次BALF混勻并離心，棄上清，再將沉淀用1 mL PBS洗滌3次，轉移至1.5 mL EP管中。取出左肺，將4%多聚甲醛溶液1 mL經左主支氣管注入左肺，并將其浸泡于4%多聚甲醛溶液24 h。

1.4 肺組織病理觀察取各組左肺下葉組織，常規(guī)進行脫水、石蠟包埋、切片，HE染色后顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.5 動脈血氧合相關指標檢測取各組小鼠動脈血0.2 mL進行血氣分析，檢測氧分壓（PaO2）、二氧化碳分壓（PaCO2）和pH，并計算氧合指數(shù)。

1.6 肺濕重/干重測定取各組小鼠左肺上葉組織，稱其濕重后置于80℃烘箱中烘烤24 h，稱其干重，計算肺濕重/干重。

1.7 lncRNA MEG3與IL-1β的 靶 控 關 系 分 析JASPER數(shù)據庫預測lncRNA MEG3與IL-1β之間存在結合位點（OSID碼圖1A、B）。進行染色質免疫共沉淀實驗：收集1×108個氣道上皮細胞，使用3%的甲醛交聯(lián)細胞10 min，加入1.5 mmol/L Glycine終止交聯(lián)反應；依次裂解細胞膜和細胞核，使用超聲將細胞核中的DNA片段剪切到250 bp左右；將超聲后的DNA片段離心后取上清，加入鈣調蛋白2抗體5 μg孵育過夜；以對應種屬的IgG作為陰性對照，提取DNA進行熒光定量PCR檢測，證實lncRNA MEG3與IL-1β啟動子區(qū)域存在結合位點，提示二者存在靶控關系（OSID碼圖1C）。

1.8 肺 組 織 及BALF中l(wèi)ncRNA MEG3、IL-1β mRNA檢測采用實時熒光定量PCR法。取各組肺組織及BALF，TRIzol法提取總RNA，測定濃度后按照試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，采用SYBR-GreenⅠReal-time PCR Kit進行PCR反應。lncRNA MEG3引物序列：上游引物5'-ACCTCGTGTGGGGAAA?GATCA-3'，下 游引 物5'-CCATCGCCAAACCACTG?GA-3'；IL-1β引物序列：上游引物5'-CCGCAGCCTA?CATCATTC-3'，下游引物5'-CGCCATAAGCCCTCC?TA-3'；內參GAPDH引物序列：上游引物5'-AGGTC?GGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物5'-TG?TAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。采 用2-ΔΔCt法 計算目的基因相對表達量。

1.9 肺組織及BALF中IL-1β蛋白檢測取各組肺組織及BALF，參照IL-1β ELISA試劑盒說明書檢測肺組織及BALF中的IL-1β蛋白表達，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.10 統(tǒng)計學方法采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數(shù)據采用重復測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理情況比較control組小鼠肺組織完整，未見明顯的炎癥細胞浸潤，無明顯肺泡水腫及結構破壞，支氣管平滑肌層及管壁結構完整無明顯異常；COPD組及COPD+NC組小鼠肺泡結構紊亂，部分肺泡可見不規(guī)則擴大，肺泡、小氣道及肺血管可見大量炎癥細胞浸潤；COPD+siMEG3組小鼠肺泡結構較COPD組及COPD+NC組完整，肺泡、小氣道和肺血管少量炎癥細胞浸潤，支氣管平滑肌層及管壁結構偶見異常。見OSID碼圖2。

2.2 各組小鼠氧合指數(shù)和肺濕重/干重比較見表1。

表1 各組小鼠氧合指數(shù)和肺濕重/干重比較（±s）

表1 各組小鼠氧合指數(shù)和肺濕重/干重比較（±s）

注：與control組比較，*P<0.05；與COPD組、COPD+NC組比較，#P<0.05。

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2.3 各組小鼠肺組織、BALF中l(wèi)nc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白比較見表2。

表2 各組小鼠肺組織、BALF中l(wèi)nc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠肺組織、BALF中l(wèi)nc RNA MEG3及IL-1β mRNA、蛋白表達比較（±s）

注：與control組比較，*P<0.05；與COPD組、COPD+NC組比較，#P<0.05。

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3 討論

炎癥一直以來都是COPD發(fā)病機制的研究重點，吸煙是COPD慢性持續(xù)炎癥反應的主要誘因，但部分COPD患者戒煙后肺部炎癥反應卻持續(xù)進展，進一步探索炎癥反應的相關機制十分必要。既往研究證實，IL-1β明確參與了COPD的發(fā)生發(fā)展［7］。IL-1β信號傳導與香煙煙霧和感染引起的慢性炎癥、氣道重塑和肺氣腫有關，并且與幾乎所有已知的COPD相關介質和疾病過程相互作用或影響［8］。研究顯示，IL-1β是COPD發(fā)病過程中肺上皮—間質單位（EMTU）中上皮—成纖維細胞通訊紊亂的主要驅動因素［9］。COPD小鼠肺上皮細胞及巨噬細胞中IL-1β高表達，導致強烈的炎癥反應，并伴有肺氣腫和氣道重塑［10］；IL-1β與IL-1R1結合形成IL-1R1復合物，通過經典Toll白細胞介素受體（TIR）/骨髓分化初級反應基因88（MyD88）途徑激活信號傳導，該通路特異性地導致轉錄因子的核轉位，例如p38絲裂原相關蛋白激酶、c-Jun N-末端激酶、激活蛋白1和NF-κB，可促進多種炎癥細胞因子和生長因子的表達［11］。然而，IL-1β拮抗劑在臨床上卻未成功轉化為COPD的治療方案，究其原因如下：①未使用IL-1β特異性拮抗劑；②IL-1β拮抗劑的使用時機不清楚；③無法判斷IL-1β拮抗劑在肺組織中是否達到合適的血藥濃度；④COPD中存在不同的表型，尚缺乏針對不同表型的研究方案［12］。上述因素可能制約了IL-1β拮抗劑的臨床應用，同時目前亦缺乏對IL-1β相關信號通路的了解，可能無法從單一途徑來阻斷IL-1β的致炎作用，需要對IL-1β的上游信號通路進行進一步研究［4］。本研究進一步證實，吸煙所致COPD小鼠的肺組織及BALF中存在IL-1β mRNA及蛋白表達升高，可能參與了COPD小鼠的炎癥反應。

為了探索了IL-1β的上游信號通路，本研究通過RPIseq數(shù)據庫預測了lncRNA MEG3與IL-1β啟動子的潛在作用位點；通過染色質免疫共沉淀實驗驗證lncRNA MEG3與IL-1β啟動子上存在結合位點，提示lncRNA MEG3可能通過影響IL-1β啟動子來調節(jié)IL-1β的表達。本研究結果顯示，敲減lncRNA MEG3可以改善COPD小鼠的肺組織病理及肺功能，并且對IL-1β表達具有調控作用。既往研究顯示，lncRNA MEG3在COPD患者肺組織中表達上調，與第一秒用力呼氣量占所有呼氣量的比例呈負相關關系，敲減lncRNA MEG3可減輕香煙煙霧誘導的肺上皮細胞凋亡、炎癥反應及細胞毒性［13］。與本研究結果一致。lncRNA MEG3還可能通過調節(jié)p53、NF-кB的表達介導人支氣管上皮細胞凋亡和自噬等，我們進一步探索了lncRNA MEG3對下游炎癥因子IL-1β的調控效應，證實了lncRNA MEG3在COPD發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究顯示，在COPD患者的肺組織和經香煙煙霧提取物（CSE）處理的16HBE細胞中l(wèi)ncRNA MEG3表達上調。本研究結果顯示，與control組比較，COPD組肺濕重/干重升高，氧合指數(shù)降低，肺組織lncRNA MEG3表達升高且肺組織、BALF中IL-1β mRNA、蛋白均升高，提示COPD小鼠存在明顯肺損傷及l(fā)ncRNA MEG3、IL-1β表達升高；與COPD組比較，COPD+siMEG3組肺濕重/干重降低，氧合指數(shù)升高，肺組織lncRNA MEG3表達降低且肺組織、BALF中IL-1β mRNA、蛋白均降低，提示沉默lncRNA MEG3可通過降低IL-1β表達而減輕COPD小鼠的肺損傷。

綜上所述，COPD小鼠肺組織及BALF中l(wèi)ncRNA MEG3及IL-1β表達均升高，lncRNA MEG3可能通過結合IL-1β啟動子區(qū)上調IL-1β表達，從而促進氣道炎性損傷，加速COPD的病理進程；沉默lncRNA MEG3可通過降低IL-1β表達而減輕COPD小鼠的肺損傷，從而發(fā)揮肺保護作用。但是本研究在小鼠BALF中未檢測到lncRNA MEG3表達，提示lncRNA MEG3可能是通過組織水平調節(jié)IL-1β表達，lncRNA MEG3是否能夠調控IL-1β相關炎癥通路，以及具體的調控機制仍需進一步研究。