姜竹茂，桑曉涵,2，潘蕓蕓，陳增鑫，王佳媚，位正鵬，楊青，王金梅

1(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺，264005)2(海南大學 食品科學與工程學院，海南 海口，570228) 3(榮成泰祥食品股份有限公司，國家馬鮫魚加工技術分中心，山東 榮成，264309)

鲅魚，又稱馬鮫魚或者竹鮫，屬鯖科，馬鮫屬，體形狹長，頭及體背部呈藍黑色，背部略有藍黑色圓斑點，腹部呈白色，背鰭與臀鰭后有角刺，多分布于北太平洋西部，而中國鲅魚多產(chǎn)自東海、黃海和渤海[1]。鲅魚屬于海魚，捕撈后不易存活，通常進行冷藏處理后以冷凍狀態(tài)銷售。魚體解凍后很容易因微生物生長繁殖而發(fā)生腐敗變質[2]，非冷凍狀態(tài)的鲅魚需要有效控制微生物生長，同時有效保持產(chǎn)品的原有品質。

等離子體是處于高度電離狀態(tài)的混合物，含有帶電粒子、活性粒子和自由基等多種活性成分。近幾年，低溫等離子體在水產(chǎn)品和肉類食品的保鮮應用研究日漸增多。低溫等離子體能夠有效抑制草魚中微生物生長，同時對其品質無明顯負面影響；太平洋白蝦經(jīng)低溫等離子體處理后在4 ℃下能夠保存15 d，且冷藏期間蛋白質與脂質氧化不明顯；且低溫等離子體對豬肉、雞肉有良好的殺菌保鮮作用[3-8]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理條件不同，對產(chǎn)品品質影響也不同[9]。

當?shù)蜏氐入x子體激發(fā)氣體中含有氧氣和氮氣時，處理過程中產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，能夠與魚肉中的脂質和蛋白質發(fā)生反應，造成不同程度的氧化損傷。脂質氧化由不飽和脂肪酸與活性自由基反應引發(fā)，形成不同的小片段成分，表現(xiàn)為不同程度的氧化現(xiàn)象。自由基介導的蛋白質氧化導致多肽鏈發(fā)生氧化斷裂、蛋白質側鏈氨基酸發(fā)生氧化修飾以及蛋白質-蛋白質發(fā)生交聯(lián)。為了研究低溫等離子體處理對魚肉中脂質和蛋白質氧化的影響，本文以不同激發(fā)因素條件處理的鲅魚肉為研究對象，分析處理后魚肉中硫代巴比妥酸反應物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)、羰基含量、巰基含量以及蛋白表面疏水性變化，探究各處理因素對魚肉中脂質和蛋白質氧化的影響，進而了解低溫等離子體處理對鲅魚品質的影響，為鲅魚的非熱加工技術提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鲅魚，采購于?？诿捞m區(qū)海鮮市場。

三氯乙酸，西隴股份有限公司；硫代巴比妥酸、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250，國藥集團化學試劑有限公司；PBS，賽國生物科技；牛血清白蛋白、2-硝基苯甲酸(2-nitrobenzoic acid，DNTB)、鹽酸胍，北京索萊寶科技有限公司；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine，DN-PH)，羅恩試劑；乙酸乙酯、尿素，廣州化學試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BK130/36低溫等離子體，美國Phoenix公司；MAP-H360復合氣調保鮮包裝機，蘇州森瑞保鮮設備有限公司；PL303電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；IW-86L338超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司；722G紫外可見光光度計，北京普析通用儀器有限公司；TGL-16MS型臺式高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；HH-2恒溫水浴鍋，常州金壇實驗儀器；DGG-9123A電熱鼓風干燥箱，上海森信實驗儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗方案設計

鲅魚去掉魚頭、魚骨及魚尾，用清水清洗，洗凈后分切成大小基本一致的魚塊(10 g左右)，將魚塊放在塑料包裝盒中，充氣密封后采用介質阻擋放電系統(tǒng)低溫等離子體處理。

(1)充空氣密封包裝，低溫等離子體在40、50、60、70、80 kV，處理3 min，介質阻隔板厚度為2 mm，處理后立即打開包裝，取樣測定。

(2)充空氣密封包裝，低溫等離子體在70 kV，處理0、1、2、3、4、5 min，介質阻隔板厚度為2 mm，處理后立即打開包裝，取樣測定。

(3)分別充空氣、CO2∶O2∶N2= 80%∶10%∶10%(體積比，下同)、CO2∶O2∶N2= 50%∶10%∶40%包裝，低溫等離子體在70 kV，處理3 min，介質阻隔板厚度為2 mm，處理后立即打開包裝，取樣檢測。

(4)充空氣密封包裝，低溫等離子體在70 kV，處理3 min，介質阻隔板厚度為2、4、6、8、10 mm，處理后立即打開包裝，取樣測定。

1.3.2 TBARS的測定

參照GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》操作，稱取2 g樣品放入50 mL離心管中。移取20 mL三氨乙酸混合液，均質，加塞密封后置于恒溫振蕩器上30 min，溫度保持在50 ℃，取出后冷卻至室溫。6 000 r/min離心15 min，棄去初濾液，準確取上述濾液和標準系列溶液各5 mL分別置于試管中。另取5 mL三氯乙酸混合液作為樣品空白對照組，分別加入5 mL硫代巴比妥酸水溶液，加塞混勻后置于90 ℃水浴鍋內反應30 min，待冷卻至室溫后，以樣品空白調節(jié)零點，于532 nm處測定樣品溶液和標準系列溶液的吸光度值。

1.3.3 肌漿蛋白與肌原纖維蛋白提取

1.3.4 蛋白質含量的測定

參考林智[11]的方法，用考馬斯亮蘭G-250試劑測定。測定595 nm處吸光值，3組平行，取平均值，繪制出標準曲線。

1.3.5 羰基含量的測定

參照孫慧琳等[12]的方法，分別取1 mL肌原纖維蛋白質溶液(肌漿蛋白溶液)于5 mL離心管內，加入1 mL DN-PH溶液(10 mmol/L)，對照組則加入1 mL 2 mol/L鹽酸，在暗室處靜置1 h。加入1 mL質量分數(shù)為20%三氯乙酸溶液，在13 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀，用體積比為1∶1的乙酸乙酯-乙醇等量混合液充分洗滌后，離心3～4次至沉淀無顏色，去除殘留的試劑。隨后取3 mL 6 mol/L鹽酸胍溶液加入沉淀中，38 ℃下水浴15 min后，13 000 r/min離心5 min，取出上清液在370 nm下測定溶液吸光度。

1.3.6 巰基含量的測定

參照孫慧琳等[12]的方法，分別提取1 mL上述操作保留的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的上清液，將其緩慢加入4 mL 8.0 mol/L 的尿素溶液中，混勻。從中取出2 mL混合液，并滴加0.01 mL DNTB溶液，均勻后靜置10 min。在412 nm處測定其吸光值，空白對照組中不添加DNTB。

1.3.7 蛋白表面疏水性測定

實驗參照陳曉楠等[13]的方法，并適當修改，取2 mL肌原纖維蛋白提取液和肌漿蛋白提取液，分別加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍溶液，對照組則將2 mL PBS緩沖液加等量的溴酚藍溶液。靜置9 min后，4 000 r/min離心15 min。測定在595 nm下的吸光值。

五是訓練組織不經(jīng)常。網(wǎng)絡安全行業(yè)自出現(xiàn)伊始，就帶著鮮明的個性化、地下化印記。近年來更是發(fā)展迅猛，已然形成巨大產(chǎn)業(yè)規(guī)模。但是網(wǎng)絡安全培訓卻始終缺乏標準化、可復制的培養(yǎng)模式，特別是具備優(yōu)秀組訓能力的師資力量更是一師難求。各級網(wǎng)絡民兵自組建以來，按民兵專業(yè)分隊有關要求落實了集中編組聯(lián)訓。但從訓練的組織情況看，共同訓練完成較好，專業(yè)訓練難以深入，基本停留在講授安全知識、觀看教學錄像、理論交流發(fā)言的老套路，沒有打通從理論到實踐的路徑，缺少模擬實戰(zhàn)化網(wǎng)絡環(huán)境的技戰(zhàn)術攻防訓練，專業(yè)技術能力主要依靠個人在工作崗位上的自學自訓，民兵網(wǎng)軍的專業(yè)訓練還沒有真正落地。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復的平均值，采用Microsoft Excel 2017進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 20.0 軟件進行方差分析和Duncan’s多重分析， 顯著性水平P< 0.05，采用Origin 8.5進行做圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件對鲅魚中TBARS值的影響

鲅魚中含有豐富的不飽和脂肪酸，容易發(fā)生氧化，而低溫等離子體處理過程中產(chǎn)生的臭氧和·OH被廣泛認為是破壞不飽和脂肪酸中雙鍵的主要物質[14]。脂質氧化最常見的中間產(chǎn)物丙二醛用TBARS值來分析[15]。根據(jù)國內外研究，高脂魚類其TBARS值<5 mg/kg時比較適宜于食用，當TBARS值達到8 mg/kg時不能再被加工或者食用[16]。

從圖1-a可知，隨著處理電壓從40 kV升高到80 kV時，鲅魚肉中TBARS值顯著(P<0.05)增加，從0.694 mg/kg增加到0.986 mg/kg，這與斯興開等[4]研究草魚的TBARS值會隨著低溫等離子體處理電壓的增大而增大結果一致。本研究中采用空氣作為低溫等離子體激發(fā)氣體，產(chǎn)生具有高氧化活性的基團，促進魚肉中脂肪酸氧化。同時，低溫等離子體激發(fā)電壓越高，形成的氧化活性粒子種類和數(shù)量越多，對鲅魚肉中脂質氧化的促進作用越明顯。

隨著低溫等離子體處理時間延長，處理后鲅魚肉的TBARS值顯著(P<0.05)增加(圖1-b)，當處理時間達5 min時，TBARS值為1.208 mg/kg。低溫等離子體處理時間越長其產(chǎn)生的具有氧化作用的活性基團越多，可導致魚肉中更多的不飽和脂肪酸降解，生成更多丙二醛。類似結果在低溫等離子體處理大西洋鯡魚的研究中有報道[7]。

如圖1-c所示，CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包裝組的TBARS值比空氣包裝組減少了0.097 mg/kg，降低O2含量、提高CO2濃度，能夠減少低溫等離子體中含氧活性自由基、粒子和基團的生成，減少對脂質氧化作用[17]。當激發(fā)氣體中含有N2和O2時，低溫等離子體處理過程中能夠生成氮氧基團(ROS和RNS)，其中NOX基團具有較高氧化活性，能夠與不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，因此，CO2∶O2∶N2=50%∶10%∶40%包裝組鲅魚肉的TBARS值高于同處理條件的CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包裝組。類似研究發(fā)現(xiàn)增加包裝氣體中的CO2濃度可以有效地延長牛肉的貨架期[18]。

a-處理電壓；b-處理時間；c-氣體成分；d-阻隔板厚度；組分1：CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%，組分2：CO2∶O2∶N2=50%∶10%∶40%(下同)圖1 不同低溫等離子體處理條件對鲅魚TBARS值的影響Fig.1 Effect of different cold plasma treatment conditions on TBARS value of Spanish mackerel

不同阻隔板厚度對低溫等離子體處理后鲅魚肉中脂質氧化的影響如圖1-d所示，隨著阻隔板厚度增加，鲅魚肉的TBARS值呈降低趨勢。由于本研究采用的低溫等離子體激發(fā)系統(tǒng)為雙層介質阻擋系統(tǒng)，介質阻隔板厚度直接影響激發(fā)電極與處理樣品間的距離，因此，阻隔板厚度能夠影響低溫等離子體的處理效果。當阻隔板厚度從2 mm增加至4 mm時，鲅魚肉的TBARS值降低了0.403 mg/kg，表明在此范圍內阻隔板厚度能夠影響低溫等離子體對鲅魚肉的脂質氧化。當阻隔板厚度從4 mm增加至10 mm時，鲅魚肉中TBARS值降低0.209 mg/kg，表明阻隔板厚度達到一定值后，對低溫等離子體的氧化作用無顯著影響。本研究中經(jīng)低溫等離子處理后魚肉的TBARS值均小于5 mg/kg，表明魚肉仍在可接受范圍內。

2.2 不同處理條件對鲅魚中羰基含量的影響

氧化變性主要通過3個途徑：一是其中的賴氨酸和脯氨酸等會氧化生成羰基及其化合物；二是烷氧自由基與烷基過氧化物的酰胺化途徑；三是賴氨酸可以與還原糖反應生成羰基衍生物。羰基含量增加與蛋白質氧化程度呈正相關[19]。低溫等離子體中的活性成分種類多而復雜，與蛋白質的氧化作用也復雜，為了全面了解低溫等離子體對魚肉中蛋白質成分的作用，分別檢測肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的氧化程度。

如圖2-a所示，隨著處理電壓升高，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的羰基含量都顯著增加(P<0.05)，二者變化趨勢保持一致。當處理電壓低于50 kV時， 肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中羰基含量隨著電壓升高而增加緩慢；當電壓超過50 kV時，2種蛋白質中羰基含量快速增加。當電壓增高至80 kV時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的羰基含量分別增加至5.215 和4.406 nmol/mg。OLATUNDE等[17]也發(fā)現(xiàn)低溫等離子體處理亞洲鱸魚的羰基含量顯著高于對照組。經(jīng)低溫等離子體處理后鲅魚肉中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白中羰基含量均隨著處理時間的延長而顯著(P<0.05)增加(圖2-b)。處理5 min后，鲅魚肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的羰基含量分別增加至5.422和5.069 nmol/mg。羰基的形成與肽骨架斷裂及一些活性氧攻擊氨基酸側鏈有關。低溫等離子體處理過程中產(chǎn)生的大量高能粒子以及ROS和RNS可以氧化氨基酸殘基側鏈，尤其是側鏈上有NH—或NH2基團的氨基酸，從而使蛋白質氧化，隨著低溫等離子體處理時間的延長，ROS與RNS含量上升，從而使蛋白質氧化程度上升[20]。

圖2-c所示不同氣體成分包裝鲅魚然后經(jīng)低溫等離子體處理后肌漿蛋白和肌原纖維蛋白質的羰基含量變化趨勢一致，CO2∶O2∶N2=80%∶10%∶10%包裝組羰基含量最低。氣調包裝組中的O2含量低于空氣組，CO2濃度高于空氣，在低溫等離子體處理過程中降低了含氧基團的生成，從而減弱了對蛋白質的氧化作用。

由圖2-d可知，隨著阻隔板厚度增加，鲅魚肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中羰基含量逐漸下降。當阻隔板厚度從2 mm增加至8 mm，蛋白質的羰基含量顯著下降(P<0.05)；當阻隔板厚度超過8 mm，蛋白的羰基含量基本穩(wěn)定，表明阻隔板厚度達到一定數(shù)值之后對低溫等離子體活性成分的影響逐漸減弱。

a-處理電壓；b-處理時間；c-氣體成分；d-阻隔板厚度圖2 不同低溫等離子體處理條件對鲅魚中羰基含量的影響Fig.2 Effect of different cold plasma treatment conditions on carbonyl content in Spanish mackerel

2.3 不同處理條件對鲅魚中活性巰基含量的影響

巰基含量通常被用作評價蛋白質氧化的另一個重要指標，蛋白質分子中氨基酸基團易被氧化致使巰基含量降低，因此，可以通過測定巰基含量來判斷蛋白質的氧化程度。巰基和二硫鍵是蛋白質中的重要功能基團，巰基含量變化與二硫鍵的斷裂會引起蛋白構象的改變。

由圖3-a可知，當電壓小于70 kV時，魚肉肌漿蛋白與肌原纖維蛋白中巰基含量緩慢降低，當電壓升高至80 kV時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的巰基含量分別下降至65.891 nmol/mg和55.114 nmol/mg。這與伏慧慧等[21]報道干腌牛肉中肌漿蛋白與肌原纖維蛋白巰基含量的變化趨勢一致。低溫等離子體的處理電壓越高，對氣體的激發(fā)能越大，能夠激發(fā)更多的氣體呈現(xiàn)等離子態(tài)，形成更多氧化活性的自由基，加劇與蛋白質發(fā)生的氧化反應。

由圖3-b可知，隨著低溫等離子體處理時間越長，鲅魚肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白均呈現(xiàn)顯著(P<0.05)下降。處理1 min時肌漿蛋白的巰基減少量最大，之后逐漸下降；肌原纖維蛋白的巰基含量在處理前2 min內下降較快，5 min時下降到79.112 nmol/mg。隨著處理時間延長，低溫等離子體產(chǎn)生的活性物質誘導蛋白質氧化作用增強，通過巰基分子內或者分子間交聯(lián)影響二硫鍵的生成，促使蛋白質結構被破壞而變性。巰基含量隨處理時間的延長而下降[22]，與本研究結果一致。

圖3-c所示，氣調包裝組鲅魚肉肌漿蛋白中活性巰基含量顯著(P<0.05)高于空氣包裝組，肌漿蛋白中活性巰基含量高于相同處理條件下肌原纖維蛋白。當鲅魚采用80% CO2包裝，低溫等離子體處理肌漿蛋白中活性巰基含量明顯升高。隨著阻隔板厚度增加，鲅魚肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中活性巰基含量逐漸上升并趨于穩(wěn)定(圖3-d)。當阻隔板厚度從2 mm增加至4 mm時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白中活性巰基含量增加顯著(P<0.05)，表明在此厚度范圍內阻隔板對魚肉中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的氧化具有顯著影響。當阻隔板從4 mm增加至10 mm時，肌原纖維蛋白與肌漿蛋白變化趨勢基本一致，都緩慢增加，表明介質阻隔板厚度超過4 mm對鲅魚中肌原纖維蛋白和肌漿蛋白中活性巰基含量增加作用減弱。

a-處理電壓；b-處理時間；c-氣體成分；d-阻隔板厚度圖3 不同低溫等離子體處理條件對鲅魚中活性巰基含量的影響Fig.3 Effects of different cold plasma treatment conditions on the active sulfhydryl content in Spanish mackerel

2.4 不同處理條件對鲅魚中蛋白表面疏水性含量的影響

溴酚藍和蛋白質變性后暴露出的氨基酸殘基的結合量可表示蛋白表面疏水性，蛋白質內部疏水基團暴露程度，與溴酚藍的結合量和表面疏水性呈正相關[23]。如圖4-a所示，當處理電壓低于70 kV時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性二者之間無明顯差異。當電壓升高至80 kV時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著增加(P<0.05)至12.911和10.552 μg。隨著處理電壓的增加，蛋白質被氧化致使一些疏水性的脂肪族與芳香族氨基酸側鏈集團暴露增加，導致蛋白質解折疊，引起表面疏水性增加[19]。劉娟等[24]發(fā)現(xiàn)白斑狗魚肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的表面疏水性也有相似變化。

當處理時間不超過3 min時，鲅魚肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性無顯著差異；當處理時間超過3 min后，2種蛋白的疏水性顯著升高(P<0.05)(圖4-b)。低溫等離子體中活性成分種類較多，由于部分具有氧化活性的粒子半衰期非常短，短時間處理過程中與蛋白質的作用效果有限，誘導蛋白質變性程度低。隨著處理時間的延長，有更多活性成分與蛋白質發(fā)生作用，破壞更多結構，導致蛋白質內部氨基酸殘基暴露量增加，蛋白質變性程度增加。

由圖4-c可知，低溫等離子體處理氣調包裝鲅魚肌漿蛋白與肌原纖維蛋白的表面疏水性降低趨勢一致。空氣中氧氣含量>10%，低溫等離子體處理過程中產(chǎn)生的活性氧自由基含量高，促進了魚肉中蛋白質氧化反應。低溫等離子體激發(fā)介質成分中O2含量高，能夠明顯增加脂質和蛋白質氧化程度。這與任思婕等[25]的研究結果一致，O2含量越高，脂質與蛋白質的氧化程度越高。

鲅魚中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性隨著阻隔板厚度增加而逐漸降低(圖4-d)。當阻隔板厚度從2 mm 增加到4 mm時，蛋白表面疏水性顯著下降(P<0.05)，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性分別下降了3.607和3.472 μg。當阻隔板厚度從4 mm增加到 10 mm時，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的表面疏水性都緩慢降低。隨著阻隔板厚度的增加，低溫等離子體對鲅魚中脂質與蛋白質氧化的影響越來越弱，當超過8 mm后，鲅魚肉中脂質和蛋白質的氧化程度均沒有明顯改變。

a-處理電壓；b-處理時間；c-氣體成分；d-阻隔板厚度圖4 不同低溫等離子體處理條件對鲅魚中蛋白表面疏水性含量的影響Fig.4 Effect of different cold plasma treatment on hydrophobicity content of protein surface in Spanish mackerel

低溫等離子體處理過程中產(chǎn)生大量的活性粒子，促進了脂質氧化過程中的自由基鏈式反應，導致脂質氧化，同時，·OH攻擊打開的氨基酸側鏈或者肽鍵氧化，生成羰基及羰基衍生物。與羰基含量變化相反，巰基含量會隨著氧化程度的加劇而下降，當?shù)鞍踪|發(fā)生氧化，內部的疏水性氨基酸暴露出來，巰基交聯(lián)形成二硫鍵，導致巰基含量下降。隨著氧化程度越深，蛋白質內部疏水基團暴露增多，蛋白質表面的疏水性越大。

3 結論與討論

低溫等離子體處理在一定程度上增加了鲅魚樣品的TBARS值，即加速了魚肉中脂質氧化。隨著處理電壓和時間增加，被處理魚肉樣品中羰基含量明顯升高，表明處理后鲅魚肉蛋白質氧化變性程度增加。延長低溫等離子體處理時間、升高處理電壓、增加氧氣濃度、在一定范圍內減少阻隔板厚度均能增加羰基含量和蛋白質表面疏水性，減少巰基含量，促進鲅魚的蛋白質氧化。低溫等離子體處理會加劇鲅魚中脂質和蛋白質的氧化，因此，應用過程中應嚴格控制處理條件，將氧化程度控制在可接受范圍內。