胡慧琳，戴靖，劉彩琴*，陸胤，謝廣發(fā)，毛青鐘，鄭連寶

1(浙江樹人學院 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310015)2(會稽山紹興酒股份有限公司，浙江 紹興，312000)3(德清縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 湖州，313200)

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)是黃酒自然浸米工藝中存在的乳酸菌[1]，在長期的生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，相同工藝、相同底物發(fā)酵濃度釀成的紹興黃酒，因浸米時間不同(傳統(tǒng)攤飯法釀酒，浸米時間長達16～26 d，機械化黃酒生產(chǎn)時浸米時間縮短至2～5 d)，其貯藏期不一致，浸米時間長釀得的酒，入壇后能夠久藏不壞，反之則不易久藏，有人認為與浸米過程中微生物及代謝產(chǎn)物息息相關[2]。黃酒浸米過程中乳酸菌屬為優(yōu)勢細菌，其豐度含量占60.67%，其中乳桿菌屬含量占乳酸菌的90%，而植物乳桿菌占57.4%，短乳桿菌占21.1%，浸米后期，植物乳桿菌占比達90%，而短乳桿菌幾乎不存在[3-4]。短乳桿菌的消失是否與植物乳桿菌有關，目前研究報道較少。

另一方面，植物乳桿菌和短乳桿菌的代謝產(chǎn)物對黃酒的品質(zhì)和風味有較大影響。一類代謝產(chǎn)物是有機酸類，這類物質(zhì)與黃酒的回味、柔和性、濃厚感和愉悅感有關[4-5]；另一類代謝產(chǎn)物是生物胺，有研究表明：生物胺含量過高會引起人體血管、動脈和微血管的擴大，導致高血壓、頭疼，腹部痙攣、腹瀉和嘔吐等不良反應[6-7]，酒類飲品中生物胺含量過高是飲后“上頭”的主要原因之一[8]。短乳桿菌所產(chǎn)生的酸有明顯的惡臭味，使人產(chǎn)生不愉快的感覺，而植物乳桿菌所產(chǎn)的酸味比較清爽[5]；同時植物乳桿菌代謝產(chǎn)生生物胺較低[5,9]。由此看來，黃酒發(fā)酵過程中應盡量控制短乳桿菌，而在不引入外源抑制劑，憑借共生系統(tǒng)中的一些微生物或者代謝產(chǎn)物來抑制其生長或破壞其完整的細胞，可提升黃酒品質(zhì)。

為此，本研究以從黃酒浸米水中分離得到2株植物乳桿菌，即R1和R2，為實驗菌株，探討植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌生長情況、細胞內(nèi)外無機磷和ATP的影響，為后續(xù)黃酒加工工藝優(yōu)化和黃酒品質(zhì)提升提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

短乳桿菌(Lactobacillusbrevis) AS1.12，浙江省微生物研究所；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)R1(CCTCC M 2019007)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)R2(CCTCC M 2019008)，武漢大學工業(yè)微生物保藏中心。

1.1.2 試劑

MRS培養(yǎng)基、瓊脂粉，杭州微生物試劑有限公司；CaCO3，成都市科龍化工試劑廠。

乙酸乙酯，上海凌峰化學試劑有限公司；無水乙醇，天津市永大化學試劑有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ATP含量測定盒、磷(Pi)測試盒(磷鉬酸法)，南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器

分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；YM30Z滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；酶標儀，美國熱電Multiskanmk 3；恒溫培養(yǎng)振蕩器，濟南歐萊博技術(shù)有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌斜面培養(yǎng)基[10]：含0.3%(質(zhì)量分數(shù))CaCO3的MRS(deMan,Rogosa and Sharpe)固體培養(yǎng)基。

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌活化培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基。

植物乳桿菌R1、植物乳桿菌R2、短乳桿菌保藏培養(yǎng)基：含2%瓊脂粉的MRS固體培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液制備

參照崔天琦等[11]的方法略有改動。將植物乳桿菌單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵液以8 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液。將上清液與乙酸乙酯以1∶1體積比混合，置室溫下以180 r/min在搖床上振蕩2 h；后將混合溶液倒入干燥的分液漏斗中靜置，待分層明顯后取出上層有機相及乳化層于無菌錐形瓶中，將得到的有機相在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去乙酸乙酯，得植物乳桿菌發(fā)酵粗提液。

1.2.2 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌抑菌活性的檢測

1.2.2.1 牛津杯法

參考都立輝等[12]的方法。以短乳桿菌作為指示菌，取適量植物乳桿菌發(fā)酵粗提液進行2倍稀釋，取樣200 μL進行抑菌實驗，抑菌活性按公式(1)計算：

(1)

式中：n，對短乳桿菌有抑菌效果的最大稀釋倍數(shù)；V，牛津杯內(nèi)的加樣體積，μL。

1.2.2.2 平板計數(shù)法

用接種環(huán)挑取短乳桿菌單菌落于MRS液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將50 mL短乳桿菌發(fā)酵液在4 ℃、3 000 r/min離心5 min，用無菌鹽水洗滌2次并重懸于10 mL鹽水中，采用10倍等比稀釋法將短乳桿菌菌懸液梯度稀釋至10-1、10-3、10-5。用0.9%生理鹽水將R1、R2的發(fā)酵粗提液稀釋至質(zhì)量分數(shù)為25%。取10-1、10-3、10-5的短乳桿菌菌懸液200 μL，與等體積、質(zhì)量分數(shù)為25%的R1、R2發(fā)酵粗提液混合，后均勻涂布于培養(yǎng)基表面，以生理鹽水為對照組。將平板倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

1.2.3 短乳桿菌生長曲線的測定

將對數(shù)生長期的短乳桿菌和經(jīng)0.20 μm濾膜除去雜菌、活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發(fā)酵粗提液按1∶2的體積比加入96孔板中，37 ℃孵育12 h，每隔1 h記錄600 nm處的吸光度，以吸光度為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標，繪制生長曲線。對照組中加入與上述體積對應的短乳桿菌和生理鹽水，每組設3個平行。

1.2.4 短乳桿菌細胞裂解率的測定

參照楊鵬斌等[13]的方法略作修改。取培養(yǎng)24 h短乳桿菌發(fā)酵液50 mL，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，將沉淀用0.03 mol/L、pH 6.5的K3PO4緩沖液洗滌2次，沉淀重懸于10 mL K3PO4緩沖液。將50 μL短乳桿菌懸液和100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發(fā)酵粗提液加入96孔板，37 ℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h測定650 nm處的吸光度，以加入等比例蒸餾水為對照。設置3個平行，試驗數(shù)據(jù)用平均值表示，細胞裂解率按公式(2)計算：

(2)

式中：A0，0 h的吸光度；At，1～12 h的吸光度。

1.2.5 短乳桿菌細胞內(nèi)、外無機磷濃度的測定

參考周偉等[14]方法。將對數(shù)生長期的短乳桿菌以6 000 r/min離心10 min，取沉淀，用2.5 mmol/L HEPES并且含有10 mmol/L的葡萄糖的緩沖液(pH 7.0)反復洗滌2次，制成108CFU/L的菌懸液，備用。

吸取上述菌懸液每份2 mL，加入100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發(fā)酵粗提液，每隔15 min終止反應。0 ℃、10 000 r/min離心7 min，取上清液，用磷測試盒在660 nm處測定短乳桿菌胞外無機磷的濃度。

短乳桿菌用1 mL的5%(體積分數(shù))三氯乙酸充分懸浮菌體沉淀，-20 ℃下冷凍過夜。解凍后，95 ℃條件下溫育10 min，10 000 r/min離心15 min，取上清液，用磷測試盒在660 nm處測定短乳桿菌胞內(nèi)無機磷的濃度。

1.2.6 短乳桿菌細胞內(nèi)、外ATP濃度的測定

取108CFU/L的短乳桿菌菌懸液每份2 mL，加入100 μL活性為160 AU/mL的植物乳桿菌發(fā)酵粗提液，每隔15 min終止反應，0 ℃、10 000 r/min離心7 min；取上清液，按ATP含量試劑盒說明書在636 nm處測定細胞外ATP的濃度[15]；同時，用細胞破碎儀將沉淀破碎后離心，上清液用于測定細胞內(nèi)ATP的含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有的實驗數(shù)據(jù)均為3個重復的平均值，數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 2018分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌的抑菌活性

含有短乳桿菌的培養(yǎng)基中，按牛津杯法加入植物乳桿菌R1和R2發(fā)酵粗提液的孔周圍沒有菌生長，形成明顯的抑菌圈，說明短乳桿菌的生長完全被抑制(圖1)，而對照孔周圍沒有抑菌圈。將表1數(shù)據(jù)帶入公式(1)計算得植物乳桿菌R1和R2發(fā)酵粗提液菌對短乳桿菌的抑菌活性分別為160和320 AU/mL。

1-R1粗提液；2-R2粗提液a-平板正面；b-平板反面圖1 植物乳桿菌粗提液對短乳桿菌的抑菌實驗Fig.1 Antibacterial activity of fermentation crude extract of L.plantarum on L.brevis

表1 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌的抑菌作用Table 1 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on L.brevis

平板計數(shù)法實驗結(jié)果見圖2。加入植物乳桿菌R1和R2發(fā)酵粗提液后，稀釋度為10-3和10-5的短乳桿菌不生長，稀釋度為10-1時，加入R1發(fā)酵粗提液的平板上有少量短乳桿菌生長，而R2發(fā)酵粗提液完全抑制了短乳桿菌的生長。

a-稀釋度為10-1;b-稀釋度為10-3;c-稀釋度為10-5圖2 植物乳桿菌R1和R2發(fā)酵粗提液對短乳桿菌生長的影響Fig.2 Effect of L.plantarum R1 and R2 crude fermentation extracts on the growth of L.brevis注：從左到右依次為：短乳桿菌、短乳桿菌+R1發(fā)酵粗提液、短乳桿菌+R2發(fā)酵粗提液

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌生長曲線的影響

將對數(shù)期的短乳桿菌與植物乳桿菌發(fā)酵粗提液以1∶2的體積比混合，37 ℃培養(yǎng)12 h，短乳桿菌的生長曲線見圖3。

圖3 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌生長曲線的影響Fig.3 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on growth curve of L.brevis

從圖3可見，對照組在培養(yǎng)0～2 h時吸光度變化不大，培養(yǎng)2～10 h，吸光度增加，尤其在4～6 h時增幅最大，10～12 h吸光度下降；而短乳桿菌與植物乳桿菌發(fā)酵粗提液混合組在0～12 h吸光度變化幅度很小。說明植物乳桿菌發(fā)酵粗提液抑制了短乳桿菌的生長。

2.3 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌裂解率的影響

從圖4可見，在0～12 h，加入植物乳桿菌發(fā)酵粗提液組隨時間延長，致短乳桿菌裂解率增加，至12 h時，植物乳桿菌R1和R2致短乳桿菌細胞裂解率分別達到18.9%和20.1%；而未添加植物乳桿菌發(fā)酵粗提液的短乳桿菌裂解率總體呈負值，說明在實驗的0～12 h，短乳桿菌菌體一直處于增長態(tài)勢?？梢娭参锶闂U菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌有裂解作用。這可能是浸米后期植物乳桿菌成優(yōu)勢菌，而短乳桿菌幾乎不存在的原因。

圖4 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌裂解率的影響Fig.4 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on lysis rate of L.brevis

2.4 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌細胞內(nèi)、外無機磷濃度的影響

由圖5可見，在植物乳桿菌發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌的90 min內(nèi)，短乳桿菌胞內(nèi)無機磷濃度隨時間增加而下降，胞外無機磷濃度隨時間增加而增高。植物乳桿菌R1發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內(nèi)無機磷濃度從0時的1.359 mmol/L下降到90 min的0.224 mmol/L；相應的，胞外無機磷濃度為從0.213 mmol/L上升到1.107 mmol/L。植物乳桿菌R2發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內(nèi)無機磷濃度從0時的2.056 mmol/L下降到90 min的0.455 mmol/L；相應的，胞外無機磷濃度從0.304 mmol/L上升到1.634 mmol/L。60 min后，短乳桿菌胞內(nèi)ATP濃度幾乎不再改變，胞外ATP濃度變化幅度不大。說明植物乳桿菌發(fā)酵粗提液破壞了短乳桿菌細胞膜的完整性。該實驗結(jié)果與周偉等[14]報道的植物乳桿菌素L-1對單核細胞增生李斯特氏菌的研究結(jié)果相似，也與劉文婷等[16]報道的乳酸菌細菌素Lac-B23對熒光假單胞菌的研究結(jié)果相似。

圖5 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌胞內(nèi)外無機磷濃度的影響Fig.5 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on intracellular and extracellular inorganic phosphorus concentration of L.brevis

2.5 植物乳桿菌R1發(fā)酵粗提液對短乳桿菌細胞內(nèi)、外ATP濃度的影響

由圖6可見，在植物乳桿菌發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌的90 min時間內(nèi)，短乳桿菌胞內(nèi)ATP濃度隨時間增加而下降，胞外ATP濃度隨時間增加而增高。

圖6 植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌細胞內(nèi)外ATP濃度的影響Fig.6 Effect of L.plantarum fermentation crude extract on intracellular and extracellular ATP concentration of L.brevis

植物乳桿菌R1發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內(nèi)ATP濃度從0時的21.18 μmol/g Hb下降到90 min的4.82 μmol/g Hb；相應的，胞外ATP濃度從0上升到20.23 μmol/g Hb。植物乳桿菌R2發(fā)酵粗提液作用于短乳桿菌時，短乳桿菌胞內(nèi)ATP濃度從0時的26.18 μmol/g Hb下降到90 min的4.62 μmol/g Hb；相應的，胞外ATP濃度從0 μmol/g Hb上升到23.40 μmol/g Hb。說明植物乳桿菌發(fā)酵粗提液對短乳桿菌細胞膜有破壞作用。而細胞內(nèi)ATP降低，對細胞內(nèi)依賴于ATP的反應造成了影響，從而抑制微生物生長繁殖[15]。劉文婷等[16]、趙瑞香等[17]和ZHAO等[18]研究結(jié)果也顯示細胞內(nèi)ATP下降，胞外ATP濃度上升。

3 討論

植物乳桿菌和短乳桿菌是黃酒發(fā)酵過程中常見的微生物，兩者代謝產(chǎn)生的有機酸種類及含量差異較大，植物乳桿菌代謝產(chǎn)生乳酸、蘋果酸和不揮發(fā)酸的能力均優(yōu)于短乳桿菌，而短乳桿菌產(chǎn)的乙酸、庚酸、正丁酸和異戊酸分別是植物乳桿菌的4、5、6、3倍左右；現(xiàn)有研究表明，乳酸口感柔和有濃厚感，可以緩沖和平衡黃酒對口腔的刺激作用，乳酸和琥珀酸是導致黃酒回味的主要物質(zhì)；乙酸刺激感強并有揮發(fā)性，適口性較差，而異丁酸、庚酸和異戊酸帶有不愉悅的惡臭味[4-5]。從提高黃酒品質(zhì)的角度來看，黃酒發(fā)酵過程中短乳桿菌含量越少越好，但是短乳桿菌是自然發(fā)酵情況下存在的微生物，不引入外源抑制劑，憑借共生系統(tǒng)中的一些微生物或者代謝產(chǎn)物能抑制其生長或破壞其完整的細胞，是比較恰當?shù)奶幚矸椒ā?/p>

本實驗研究結(jié)果表明，植物乳桿菌代謝產(chǎn)物能抑制短乳桿菌的生長，會造成短乳桿菌的裂解，導致其細胞內(nèi)無機磷和ATP的泄露。本實驗結(jié)果為降低黃酒浸米過程中短乳桿菌提供了一條解決途徑。

此前有報道，某些植物乳桿菌的代謝產(chǎn)物能抑制鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌、單核細胞增生李斯特菌、白色念珠菌等[19-20]，也有些植物乳桿菌代謝產(chǎn)物能抑制黑曲霉、棒狀青霉、擴展青霉等真菌[21-22]；發(fā)揮抑菌功能的主要物質(zhì)有抑菌肽(常被稱為細菌素)和有機酸(如乙酸、丙酸、丁酸、苯乳酸等)[23-25]。關于其抑菌機制，常見的有細胞膜損傷機制和細胞壁損傷機制之說；代謝產(chǎn)物通過改變細胞膜的結(jié)構(gòu)或損傷細胞膜，可導致膜透性發(fā)生改變或形成孔洞，細胞發(fā)生裂解，胞內(nèi)容物如ATP、無機磷、Na+、K+等小分子物質(zhì)大量流出；而能作用于細胞壁的物質(zhì)，是依靠肽內(nèi)酶切，致目標細菌細胞壁裂解[26-28]。從本實驗結(jié)果來看，植物乳桿菌R1和R2的發(fā)酵粗提液對短乳桿菌的細胞膜有影響，從而致其生長受阻。