沈治強，邢本，丁振東，楊靜文，胡雪芹，張洪斌

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院，安徽 合肥，230601)

泛酸，也被稱為維生素B5，D構型的右旋泛酸為其活性成分，是動物體內(nèi)合成乙酰輔酶A的重要前體物質(zhì)，也是大多數(shù)天然食物中存在的必需微量營養(yǎng)素[1]，被廣泛應用于食品、藥品、飼料添加劑，其主要的產(chǎn)品形式為D-泛酸鈣，以及D-泛醇、D-泛硫乙胺等衍生產(chǎn)品。合成D-泛酸的關鍵在于拆分DL-泛解酸內(nèi)酯獲得高光學純度的D-泛解酸內(nèi)酯。傳統(tǒng)的方法是使用昂貴的手性試劑如奎寧、番木鱉堿、麻黃素等有機生物堿拆分[2]，但是該工藝帶來了嚴重的環(huán)境污染，并且拆分成本高。隨著人們對綠色環(huán)保生產(chǎn)的追求及生物酶法的興起，生物酶法拆分手性藥物中間體越來越受到關注。

通過酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯包括氧化還原酶法[3-4]和選擇性水解酶法[5-10]，另外還有用羥腈裂解酶不對稱加成法合成相對應的氰醇[11-13]等方法。而研究較多的是選擇性水解酶法，選擇性水解酶法是利用D-泛解酸內(nèi)酯水解酶選擇性地將DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯水解成D-泛解酸，D-泛解酸在酸性條件下加熱得到D-泛解酸內(nèi)酯，從而實現(xiàn)DL-泛解酸內(nèi)酯的拆分。該方法不需要水解徹底，未水解部分經(jīng)過消旋化處理可再次使用，只需所用的酶或微生物的立體專一性好，就能得到高光學純度的D-泛解酸內(nèi)酯，相較于其他酶法拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，該方法是最具有應用價值的路線。SAKAMOTO等于1994年首次報道了用D-泛解酸內(nèi)酯水解酶拆分泛解酸內(nèi)酯的方法，并報道了該酶一般來源Fusarium、Cylindrocarpon和Gibberella[14-15]。研究篩選到一株產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株，經(jīng)鑒定為串珠鐮孢霉菌(Fusariummoniliforme)SW-902，D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活力為0.92 U/g干菌體[5-7]。馬佳鵬[8]通過篩選得到一株具有D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性的菌株Fusariumavenaceum3.4594，酶活力為0.489 U/mL。鄭莉莉[9]篩選得到一株具有D-泛解酸內(nèi)酯水解酶菌株，經(jīng)鑒定為尖鐮孢菌，并經(jīng)過紫外誘變選育得到一株高活性菌株CZ-437，酶活力為5.7 U/L。王開放等[10]利用D380樹脂固定化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶，固定化酶的比酶活力為(11.5±0.12) U/g。

目前利用產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的菌株催化拆分DL-泛解酸內(nèi)酯所面臨的問題是原始來源菌酶活力較低，在工業(yè)上很難得到大規(guī)模應用。本實驗室篩選得到一株具有D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性的菌株，經(jīng)鑒定屬于鐮孢霉菌(Fusarium)，但是該菌株水解活力低，酶活力為1.42 U/mL，不利于大規(guī)模生產(chǎn)應用。為了提高其工業(yè)應用價值，本研究利用常溫室壓等離子(atmospheric room temperature plasma，ARTP)和UV-LiCl技術對產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶原始菌株進行多輪次遞進誘變，并結合平板變色圈大小初篩，搖瓶測酶活力復篩，以期獲得一株高產(chǎn)、穩(wěn)定、適應性好的菌株，來提高生產(chǎn)效率以及降低生產(chǎn)成本，并對突變菌株進行發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料試劑與儀器

1.1.1 菌株來源與培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉4,玉米漿干粉3.32,甘油13.32,棉籽蛋白胨13.32,豆粕粉6.68,消泡劑0.5,pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿干粉1.32,甘油6.6,棉籽蛋白胨5.28,豆粕粉6.6,消泡劑0.12,pH 7.5。

初篩培養(yǎng)基(g/L)：玉米漿干粉1.32,甘油6.6,棉籽蛋白胨5.28,瓊脂20,DL-泛解酸內(nèi)酯15,溴百里酚藍0.1,pH 7.6。

菌種為本實驗室篩選得到并保存，經(jīng)菌種鑒定屬于鐮孢霉菌屬。

1.1.2 試劑與設備

試劑：棉籽蛋白胨、豆粕粉、玉米漿干粉，南京茂捷微生物科技有限公司；酵母浸粉，OXOID公司；DL-泛解酸內(nèi)酯，河南省新鄉(xiāng)六通實業(yè)有限公司；Tris，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；消泡劑，濟南翔邦化工有限公司；溴百里酚藍，天津市致遠化學試劑有限公司；LiCl、乙腈(分析純)，國藥集團。

Lab Alliance高效液相色譜系統(tǒng)，美國科學儀器公司；Alphasil VC-C18色譜柱，華普科儀科技有限公司；ZWYR-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智誠分析儀器制造有限公司；PHSJ-4F雷磁pH計,上海儀電科學儀器有限公司；WZZ-2S 2SS旋光儀，上海申光儀器儀表有限公司；常溫室壓等離子發(fā)射裝置，中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶方法

將4 ℃保存的斜面菌種，轉接至新鮮固體種子培養(yǎng)基上，27 ℃活化培養(yǎng)2 d，將活化后的菌落取一環(huán)轉入50 mL種子培養(yǎng)基，27 ℃、300 r/min，培養(yǎng)24 h，再將種子液以7.5%(體積分數(shù))的接種量轉接至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，27 ℃、300 r/min，培養(yǎng)36 h，發(fā)酵結束，抽濾并用去離子水洗滌，得到濕菌絲體。

1.2.2 孢子液的制備

取若干環(huán)生長3～4 d的固體培養(yǎng)基上的菌落，打入無菌生理鹽水中，充分振蕩，然后用一層無菌擦鏡紙過濾掉菌絲體，制成孢子濃度在105個/mL單孢子懸浮液。

1.2.3 誘變處理

ARTP誘變：取2 mL孢子懸液至無菌培養(yǎng)皿中，放置于常溫室壓等離子裝置探頭下，工作參數(shù)參考文獻[16]，工作氣體He，電壓12 kV，頻率100 kHz，室溫。處理時間分別為40、80、120、160、200、240、280 s。

UV-LiCl誘變：取2 mL孢子懸液至無菌培養(yǎng)皿中，在紫外燈下照射，照射距離為30 cm、功率為30 W，照射時間分別為20、40、60、80、100、120、140 s。

將誘變處理后的孢子液稀釋100倍，取0.3 mL涂布與初篩培養(yǎng)基(UV-LiCl誘變涂布于含6 g/L LiCl的初篩培養(yǎng)基)，27 ℃培養(yǎng)3～4 d，對照組的孢子懸浮液以同樣方法操作，待長出菌落，致死率按公式(1)計算：

(1)

1.2.4 初篩

在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入DL-泛解酸內(nèi)酯和pH指示劑，具有D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活力的菌株在培養(yǎng)基上生長，會水解培養(yǎng)基中的D-泛解酸內(nèi)酯成D-泛解酸，導致菌落周圍pH下降，產(chǎn)生變色圈，變色圈和菌落直徑比值越大，酶活力可能越高[9]。將誘變處理后的孢子液涂布于初篩培養(yǎng)基，于27 ℃培養(yǎng)3～4 d，挑取變色圈/菌落直徑較大的菌落復篩。

1.2.5 復篩

將初篩挑取的變色圈/菌落直徑較大的菌株按照1.2.1步驟發(fā)酵培養(yǎng)，測其酶活力。

酶活力測定：取1 mL發(fā)酵液離心并用去離子水洗滌得到濕菌體，加入到2.5 mL 0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),含6%DL-泛解酸內(nèi)酯，30 ℃、150 r/min反應1 h，離心過濾除去菌體，采用液相色譜檢測反應液。

酶活力定義：30 ℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解1 μmolD-(-)-泛解酸內(nèi)酯成D-(+)-泛解酸所需要的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

濕重定義:取1 mL發(fā)酵液離心并用去離子水洗滌，稱質(zhì)量。

高效液相檢測條件為：色譜柱為Alphasil VC-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(水)=25∶75，檢測波長215 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL。

突變菌株與對照菌株相比較，相對酶活力≤90%的為負突變株，相對酶活力≥110%的為正突變株，相對酶活力在90%～110%的視為中性突變株，并分別計算正突變率、負突變率和中性突變率。

1.2.6 高活性菌株遺傳穩(wěn)定性

將篩選到的高活性突變株4 ℃斜面保存，每隔1周轉接活化1次，按照1.2.1步驟培養(yǎng)，測D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活力。

1.2.7 突變株與原始菌株催化高濃度DL-泛解酸內(nèi)酯比較

欲提高突變菌株的工業(yè)應用價值，不僅要提高單位酶活力，也要提高其在高底物濃度下的水解能力以及對映體選擇性。隨著反應時間進行，該菌株催化的DL-泛解酸內(nèi)酯水解反應的產(chǎn)物達到一定積累量，會抑制水解反應進行，使反應達到平衡。雖然提高底物濃度可以提高D-泛解酸的生成量，但是底物水解率會降低，導致大量底物未被利用，綜合考慮底物利用率及產(chǎn)物生成量，底物濃度為200 g/L時最佳。因此以20%的DL-泛解酸內(nèi)酯為催化底物，分別加入1 g篩選得到的高活性菌株和原始菌株的濕菌體，30 ℃反應9 h，反應結束后，將反應液離心過膜，用旋光儀檢測其旋光度，液相檢測其水解率，以及將D-泛解酸內(nèi)酯分離純化后測其光學純度，水解率和光學純度按公式(2)(3)計算：

(2)

(3)

式中：ρ0，反應前DL-泛解酸內(nèi)酯濃度，g/L；ρ1，反應后DL-泛解酸內(nèi)酯濃度，g/L。

1.2.8 突變株發(fā)酵產(chǎn)酶條件優(yōu)化

相較于原始菌，突變株的基因組可能發(fā)生變化，原始菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶條件不一定是突變株的最佳條件，因此對篩選到的高活性突變株，從發(fā)酵溫度(15～35 ℃)、發(fā)酵初始pH(6.0～9.0)、接種量(1.5%～16.5%)、發(fā)酵時間(12～96 h)幾個方面優(yōu)化其發(fā)酵條件探究其對產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響，每組做3個平行。

2 結果與分析

2.1 ARTP誘變最佳處理時間確定

如圖1所示，隨著處理時間增加，致死率逐漸增加，120 s時達到93.86%，280 s完全致死。當誘變時間短時，中性突變率較高；隨著致死率增加，突變概率逐漸增加，但是負突變率也對應增加。在處理時間為80 s時正突變率最高為28%，致死率為82.89%，這與文獻[17]中報道的致死率在80%左右更有利于篩選得到高產(chǎn)菌株相符合。

圖1 ARTP誘變時間對鐮孢霉菌致死率和突變率的影響Fig.1 Effects of ARTP mutagenesis time on the sterilization and mutation rate of Fusarium

2.2 UV-LiCl誘變最佳處理時間確定

將經(jīng)紫外不同照射時間的孢子液涂布于含有6 g/L LiCl的初篩培養(yǎng)基上，誘變效果如圖2所示。當照射時間為60 s時致死率達到83.17%，140 s時完全致死。隨著照射時間的增加正突變率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在80 s時最大為20%，此時的致死率為88.78%。

圖2 UV-LiCl誘變時間對鐮孢霉菌致死率和突變率的影響Fig.2 Effects of UV-LiCl mutagenesis time on sterilization and mutation rate of Fusarium

2.3 初篩

在初篩培養(yǎng)基中加入底物DL-泛解酸內(nèi)酯，相當于在篩選過程中給菌株一個脅迫作用，但是在培養(yǎng)基中加入DL-泛解酸內(nèi)酯會抑制菌株生長。在初篩培養(yǎng)基中加入不同濃度DL-泛解酸內(nèi)酯，27 ℃培養(yǎng)3 d，待菌落長出后計數(shù)，未添加DL-泛解酸內(nèi)酯的作為對照，每組做3個平行，生長率按公式(4)計算：

(4)

如表1所示，DL-泛解酸內(nèi)酯含量太低時起不到脅迫作用，含量太高篩選范圍小，因此選擇1.5%的添加量較合適，初篩培養(yǎng)基變色圈效果如圖3所示。

表1 DL-泛解酸內(nèi)酯添加量對鐮孢霉菌生長的影響Table 1 Effect of DL-pantolactone addition on the growth of Fusarium

圖3 初篩培養(yǎng)基篩選效果Fig.3 Screening effect of primary screening medium

2.4 復篩

利用ARTP及UV-LiCl技術經(jīng)過4輪誘變選育，以獲得高活性D-泛解酸內(nèi)酯水解酶突變株，其中在在進行第二輪ARTP誘變時，正突變率及負突變率較第一輪均有所下降，第三輪采用UV-LiCl誘變以提高鐮孢霉菌對ARTP的敏感度，結果如表2所示，第四輪ARTP的突變率，較前三輪均有所增加。每一輪篩選出的高活性菌株如圖4所示。以每輪誘變篩選到的遺傳較穩(wěn)定的高活性的菌株為出發(fā)菌株，再進行下一輪誘變(表2)。最終篩選得到一株高活性菌株4-80-6，其酶活力為3.51 U/mL。

表2 四輪誘變選育的過程Table 2 Process of four rounds of mutagenesis breeding

圖4 四輪誘變選育復篩菌株的酶活力Fig.4 Enzyme activity of re-screened strains selected by four rounds of mutagenesis

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性

經(jīng)過誘變選育的突變株可能會出現(xiàn)自我修復，導致遺傳不穩(wěn)定，因此對突變株4-80-6傳代培養(yǎng)8次，結果如表3所示。4-80-6菌株產(chǎn)酶活力比較穩(wěn)定，其平均酶活力為3.46 U/mL，說明該突變株遺傳穩(wěn)定，具有進一步研究的價值。

2.6 原始菌株與突變株4-80-6催化高濃度DL-泛解酸內(nèi)酯的比較

以20%DL-泛解酸內(nèi)酯為底物，比較突變株4-80-6與原始菌株的水解能力，結果如表4所示。在20%底物濃度下，突變株4-80-6水解率由原始菌株的11.6%提高到了17.7%。因為D-(-)-泛解酸內(nèi)酯水解成D-(+)-泛解酸，旋光性由左旋變成右旋，而L-(+)-泛解酸內(nèi)酯也是右旋的，反應越徹底，右旋的旋光值就越大。測定反應液的旋光值大小，可以觀察出菌體對底物的立體選擇性。突變株4-80-6反應液旋光度由原始菌的1.216提高到了2.785，說明突變菌株沒有改變其立體選擇性。產(chǎn)物的光學純度，由原始菌株的93.5%提高到了98.3%，表明該突變株對高濃度DL-泛解酸內(nèi)酯的水解能力和對映體選擇性較原始菌株均有所提高，該突變株為工業(yè)上催化拆分DL-泛解酸內(nèi)酯提供了更好的酶源。

表3 突變株4-80-6的遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutant strain 4-80-6

表4 原始菌與突變株4-80-6催化DL-泛解酸內(nèi)酯水解拆分的數(shù)據(jù)分析Table 4 Comparison of DL-pantolactone hydrolysis and resolution catalyzed by original strain and mutant strain 4-80-6

2.7 突變株4-80-6的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.7.1 發(fā)酵溫度對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響

如圖5所示，隨著發(fā)酵溫度增加，酶活力與發(fā)酵濕重均先增加后下降，在25 ℃時達到最佳，此時酶活力達到3.57 U/mL。而原始菌株的最佳培養(yǎng)溫度為27 ℃，說明突變株4-80-6較原始菌株更適合在低溫度下產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。

圖5 發(fā)酵溫度對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.2 發(fā)酵初始pH對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響

如圖6所示，隨著發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的增加，菌體濕重和酶活力均在pH為8.5時達到最佳，此時酶活力為4.01 U/mL，當pH升高到9.0時開始下降。而原始菌株的最適發(fā)酵初始pH為7.5，說明突變株4-80-6較原始菌株，更適合在偏堿性下產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶。

圖6 發(fā)酵初始pH對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響Fig.6 Effects of initial pH on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.3 接種量對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響

如圖7所示，隨著接種量的增加，酶活力和菌體濕重均在10.5%的接種量時達到最大，此時酶活力為4.12 U/mL，突變株4-80-6的最佳接種量由原始菌株的7.5%提高到了10.5%。

圖7 接種量對突變株4-80-6產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響Fig.7 Effects of inoculation volume on the production of D-lactonohydrolase by mutant strain 4-80-6

2.7.4 原始菌和突變株4-80-6的發(fā)酵時間曲線

按照上述優(yōu)化的條件發(fā)酵培養(yǎng)，每隔6 h測酶活力和濕重，以及測發(fā)酵液pH。如圖8所示，酶活力和發(fā)酵濕重隨著發(fā)酵時間增加均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，突變株4-80-6在48 h達到最佳，此時酶活力為4.33 U/mL，菌體濕重為0.075 g/mL。原始菌株在36 h達到最佳，此時酶活力為1.42 U/mL，菌體濕重為0.073 g/mL。突變株4-80-6達到最佳發(fā)酵時間由原始菌株的36 h延長到了48 h，說明該突變株較原始菌株生長緩慢些。

圖8 原始菌株與突變株4-80-6發(fā)酵時間曲線Fig.8 Fermentation time curve of original strain and mutant strain 4-80-6

如圖9所示，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液pH先下降后上升，突變株4-80-6在48 h下降到最低4.94，原始菌株在36 h下降到最低5.1。pH變化趨勢與菌株生長趨勢相符合，前期菌體生長消耗培養(yǎng)基成分使培養(yǎng)基pH下降，當菌體生長到一定程度，菌體開始出現(xiàn)裂解，菌體自身代謝物質(zhì)釋放使pH上升。

圖9 原始菌株與突變株4-80-6發(fā)酵液pH值變化曲線Fig.9 pH value curve of fermentation of original strain and mutant 4-80-6

3 結論

以產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的鐮孢霉菌為基礎，利用ARTP和UV-LiCl技術經(jīng)過4輪遞進誘變，并結合平板變色圈大小初篩，搖瓶測酶活力復篩，篩選得到1株優(yōu)勢菌株4-80-6，酶活力為3.46 U/mL，是原始菌株的2.43倍，8次傳代培養(yǎng)后，該菌株遺傳穩(wěn)定。以20%的DL-泛解酸內(nèi)酯為底物催化時，突變株4-80-6較原始菌株，水解率提高了47.41%，光學純度由93.5%提高到了98.3%。通過對突變株4-80-6發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，酶活力達到4.33 U/mL，比優(yōu)化前(3.46 U/mL)提高了25.14%。

本研究在多輪ARTP誘變中穿插一輪UV-LiCl誘變，其目的為了防止鐮孢霉菌對ARTP產(chǎn)生耐受性，提高其對ARTP的敏感度，增加突變概率。從突變率和致死率的結果可知，當致死率較低時，突變概率小，產(chǎn)生的大多都是中性突變；致死率較高時，突變概率增加，負突變率會相應增加，并且致死率太高篩選范圍較小。本研究中無論是ARTP誘變還是UV-LiCl誘變，均是在致死率為80%～90%時，正突變率最高，這與文獻[17]報道的致死率在80%左右更有利于篩選到優(yōu)勢菌株一致。篩選到的突變株4-80-6，不僅酶活力較原始菌株有所提高，在20%底物濃度下水解率也高于原始菌株，同時所得到的產(chǎn)物D-泛解酸內(nèi)酯的光學純度也有所提高，以及通過發(fā)酵條件優(yōu)化，進一步提高了其酶活力，為工業(yè)上拆分DL-泛解酸內(nèi)酯提供了更好的酶源。

致謝

感謝中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院黃青研究員提供常溫室壓等離子設備與技術支持。