李方迪，李由然，張梁，丁重陽(yáng)，顧正華，石貴陽(yáng)，徐沙*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

番茄紅素，一種四萜類化合物，被廣泛應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥等行業(yè)，因其卓越的抗氧化性被熟知。臨床研究證明，番茄紅素在預(yù)防心血管疾病、前列腺癌、乳腺癌等方面都有顯著功效[1]，可以降低心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)，降低血壓，并防止低密度脂蛋白膽固醇的氧化[2]。一般來(lái)說(shuō)，番茄紅素不能由人體自身合成，只能從外界獲取，因此具有極高的商業(yè)價(jià)值。過(guò)去番茄紅素的生產(chǎn)方式多為植物提取，近些年來(lái)環(huán)保高產(chǎn)的微生物發(fā)酵法逐漸成為主流。微生物發(fā)酵不僅可以解決植物種植占用大量土地的問(wèn)題，還可以解決化學(xué)合成不環(huán)保的弊端，更重要的是，發(fā)酵產(chǎn)生的番茄紅素是天然產(chǎn)物，其異構(gòu)性和活性與從自然界中提取的活性成分一致[3]，因此，番茄紅素生產(chǎn)的前景廣闊。

常用于番茄紅素生產(chǎn)的細(xì)胞工廠有大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、釀酒酵母、解脂亞洛酵母等。大腸桿菌由于其生長(zhǎng)快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、基因操作工具成熟等優(yōu)點(diǎn)，是最早開(kāi)發(fā)的番茄紅素生產(chǎn)底盤細(xì)胞。重組大腸桿菌通過(guò)引入番茄紅素合成途徑和發(fā)酵條件優(yōu)化，生產(chǎn)出2.7 g/L番茄紅素，是迄今為止使用基因工程大腸桿菌報(bào)告的番茄紅素產(chǎn)量最高水平[4]。然而仍然存在一些爭(zhēng)議，大腸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中釋放一些內(nèi)毒素，從而引起食品安全問(wèn)題，與其相對(duì)的，酵母因其較高的食品安全性脫穎而出，經(jīng)過(guò)代謝改造，番茄紅素在解脂亞洛酵母中可以積累到175 mg/g DCW[5]。LI等[6]研究表明，甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑的代謝產(chǎn)物，包括番茄紅素在菌體中的積累會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，脂質(zhì)體(lipid droplets，LDs)的積累可以緩解產(chǎn)物毒性，同時(shí)由于番茄紅素的結(jié)構(gòu)易溶于脂，增大LDs含量有利于提高其在胞內(nèi)的積累。三酰甘油(triacylglycerol，TAG)是在真核細(xì)胞中含量最高的儲(chǔ)能物質(zhì)，在脂肪酸消耗期間可保證膜脂的供給，且其毒性相對(duì)游離脂肪酸較低[7]，這給胞內(nèi)脂肪酸提供了儲(chǔ)存方式。增加胞內(nèi)脂質(zhì)含量有多種方法，如過(guò)表達(dá)脂肪酸(fatty acid，F(xiàn)A)及TAG合成途徑相關(guān)基因[8-9]，釀酒酵母自身存在MVA途徑、丙烷脫氫(propane dehydrogenation，PDH)途徑與TAG途徑(圖1)，分別是番茄紅素合成的前體代謝途徑、乙酰輔酶A(coenzyme A，CoA)胞內(nèi)合成途經(jīng)與三酰甘油TAG合成的途徑。TAG途徑以乙酰CoA為前體物質(zhì)，經(jīng)由限速酶Acc1羧化生成丙二酰輔酶A，進(jìn)而轉(zhuǎn)化生成脂肪酰輔酶A，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，由關(guān)鍵酶Pap1催化生成甘油二酯(diacylglycerol，DAG)，最后由Dga1進(jìn)一步?；蒚AG。三酰甘油是釀酒酵母中LDs的主要組成成分，Ldp1會(huì)附著于脂滴表面，顯著增大脂滴的體積。乙酰輔酶A供應(yīng)和產(chǎn)物形成途徑中能量耦合和氧化還原輔因子平衡的整體分析對(duì)于高效細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)至關(guān)重要[10]。陳符江等[11]異源表達(dá)來(lái)自腸道沙門氏菌的胞質(zhì)乙酰輔酶A合成酶acs1，并設(shè)計(jì)L641P氨基酸取代來(lái)防止乙酰化，從而解除了Acs1受到乙酰輔酶A乙?；嚢彼釟埢囊种疲@些修飾顯著增加了線粒體外Acs1的活性，胞內(nèi)乙酰輔酶A含量提高了2.19倍。此外，CHEN等[12]通過(guò)敲除ypl062w位點(diǎn)，使胞內(nèi)的乙酰輔酶A增加了1倍。TRIKKA等[13]在釀酒酵母中敲除了exg1位點(diǎn)，將類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了接近8倍。聚腺苷酸聚合酶(Pap1)催化向幾乎所有mRNA添加poly(A)尾的反應(yīng)[14]，MEINKE等證明，poly(A)尾的添加促進(jìn)了mRNA從核轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)的過(guò)程，結(jié)合于poly(A)尾的蛋白質(zhì)與mRNA 5′端之間的相互作用可提高翻譯效率。

注：Acs1-醋酸鹽-輔酶A連接酶1;Acc1-乙酰輔酶A羧化酶;Pah1-磷脂酸磷酸酶;Dga1-二酰基甘油O-?；D(zhuǎn)移酶;Ldp1-脂質(zhì)體定位蛋白; CrtE-香葉基香葉基二磷酸合酶; CrtB-八氫番茄紅素合酶; CrtI-八氫番茄紅素去飽和酶圖1 釀酒酵母胞質(zhì)中胞質(zhì)乙酰輔酶A合成途徑、番茄紅素合成途徑及脂質(zhì)代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of lycopene，acetyl coenzyme A and lipids in S. cerevisiae

本文以釀酒酵母YPH499為底盤細(xì)胞，過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵基因dga1、pah1[15]，以及與脂滴形成關(guān)聯(lián)緊密的ldp1基因[16]。TAG途徑與MVA途徑均主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，而該途徑的前體乙酰輔酶A主要存在于線粒體中，這就導(dǎo)致前體供應(yīng)成為一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。本文將來(lái)自三孢布拉霉的acs1基因敲入釀酒酵母內(nèi)，這是一個(gè)定位于胞質(zhì)內(nèi)的丙酮酸脫氫酶，研究表明敲入該基因可使胞質(zhì)乙酰CoA的含量增加50%以上[10]；同時(shí)敲除ypl062w位點(diǎn)，該位點(diǎn)的缺失可提高所有萜類的產(chǎn)量[12]。本文中涉及到多個(gè)基因過(guò)表達(dá)，在較高的轉(zhuǎn)錄需求下，強(qiáng)化pap1基因(多核苷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)是必要的，這一點(diǎn)在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也得到了證實(shí)。選取本實(shí)驗(yàn)室的YthmgⅠ為出發(fā)菌株，該菌株在YPH499的基礎(chǔ)上敲除了gal80，同時(shí)過(guò)表達(dá)了thmg1基因。經(jīng)過(guò)代謝改造，番茄紅素在重組菌內(nèi)的單位產(chǎn)量顯著提高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物

本文使用的所有菌株詳見(jiàn)表2，質(zhì)粒見(jiàn)表3，引物詳見(jiàn)表4。

1.1.2 培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)大腸桿菌所用培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；培養(yǎng)釀酒酵母所用培養(yǎng)基為DYPD(g/L)：酵母粉20，蛋白胨40，葡萄糖20；誘導(dǎo)ura3抗性標(biāo)記丟失所用培養(yǎng)基為5-FOA-YNB(yeast nitrogen base)：體積分?jǐn)?shù)1%的五氟乳清酸母液，體積分?jǐn)?shù)1%的氨基酸補(bǔ)足母液，葡萄糖20 g/L，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基7 g/L；固體培養(yǎng)基另添加18 g/L瓊脂粉。

1.1.3 母液配制

五氟乳清酸溶液：取1 g五氟乳清酸固體粉末于50 mL EP管內(nèi)，加入10 mL二甲基亞砜于55 ℃隔水融化，過(guò)膜分裝，于-20 ℃避光保存；

氨基酸補(bǔ)足母液(μg/mL)：亮氨酸100，賴氨酸100，色氨酸80，尿嘧啶30，組氨酸30；

抗生素母液：氨芐青霉素、卡那霉素、硫酸諾爾斯菌素、潮霉素母液濃度分別按照100、100、100、500 mg/mL配制，添加于培養(yǎng)基時(shí)均按照0.1%的體積比。

1.1.4 酶與試劑盒

本實(shí)驗(yàn)所用酶與試劑盒見(jiàn)表1。菌株、質(zhì)粒和引物見(jiàn)表2～表4。

表1 工具酶與試劑盒Table 1 Tool enzymes and kits

表2 菌株Table 2 Strains

表3 質(zhì)粒Table 3 Plasmids

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌表達(dá)盒的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)選取來(lái)自三孢布拉霉(Blakesleatrispora)的acs1L641P，來(lái)自產(chǎn)脂酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的ldp1以及來(lái)自釀酒酵母YPH499的pah1、dga1、pap1。前二者經(jīng)密碼子優(yōu)化后送由上海生工公司合成，后者以YPH499基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

以GAL1,10pr-acs1L641P-ADH1ter表達(dá)盒構(gòu)建為例：(1)提取YPH499基因組，以其為模板PCR擴(kuò)增得到GAL1、10pr、ADH1ter以及靶點(diǎn)ypl062w連帶其左右同源臂；(2)通過(guò)融合延伸PCR將GAL1、10pr、acs1L641P、ADH1ter連接在一起，而后利用TA連接的方法將上述融合片段連接19T(simple)載體，菌落PCR驗(yàn)證；(3)利用TA連接將靶點(diǎn)ypl062w連帶其左右同源臂連接載體Vector 19T(simple)，反向PCR擴(kuò)增連帶左右同源臂的載體片段；(4)挑取步驟(2)驗(yàn)證正確的菌落接入液體培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并酶切純化得到目的片段，將該片段與步驟(3)擴(kuò)增出的載體過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌落PCR驗(yàn)證。

以同樣方法構(gòu)建其他表達(dá)盒。

1.2.2 Sg質(zhì)粒的構(gòu)建

利用網(wǎng)站E-Crisp設(shè)計(jì)sgRNA并將其設(shè)計(jì)入引物中(表4)，以實(shí)驗(yàn)室保藏質(zhì)粒302、149為模板分別擴(kuò)增出啟動(dòng)子與發(fā)卡結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)片段，然后重疊延伸PCR將兩片段融合，酶切后連接BTS’質(zhì)粒。

表4 引物Table 4 Primers

續(xù)表4

1.2.3 篩選及重復(fù)轉(zhuǎn)化

本研究利用的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)是一個(gè)雙質(zhì)粒系統(tǒng)，Cas9蛋白和sgRNA分別由2個(gè)游離質(zhì)粒在釀酒酵母菌株中表達(dá)以進(jìn)行相應(yīng)基因座的敲除整合。以YthmgⅠ為底盤細(xì)胞，利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將Cas質(zhì)粒、sg質(zhì)粒與線性化重組片段轉(zhuǎn)入細(xì)胞，利用同源重組的機(jī)制完成整合，利用抗生素硫酸諾爾斯菌素與潮霉素進(jìn)行重組菌株篩選，將完成轉(zhuǎn)化的菌液涂布至諾爾斯-潮霉素雙抗DYPD平板上，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，經(jīng)菌落PCR初步篩選，再通過(guò)基因組測(cè)序驗(yàn)證后獲得整合表達(dá)菌株。

由于轉(zhuǎn)化完成后的質(zhì)粒依然在底盤細(xì)胞內(nèi)殘留，這會(huì)影響再次轉(zhuǎn)化，故在進(jìn)行下一步操作前丟棄原有質(zhì)粒是必要的。本研究根據(jù)ura3標(biāo)記篩選原理，將無(wú)抗培養(yǎng)傳代后的改造菌株涂布至5-FOA-YNB平板進(jìn)行篩選，倒置于30 ℃培養(yǎng)箱至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落接種于DYPD液體培養(yǎng)基搖培以待再次轉(zhuǎn)化。

1.2.4 重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

挑取轉(zhuǎn)化完成的平板上的菌落接至DYPD培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，即OD值0.6～0.8，以10%的接種量接至含15 mL培養(yǎng)基的25 mL小搖瓶中，30 ℃，200 r/min搖培至96 h。定時(shí)取樣對(duì)重組菌生長(zhǎng)趨勢(shì)及合成番茄紅素水平進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 生長(zhǎng)趨勢(shì)測(cè)定及番茄紅素提取

取1.5 mL菌液備用。其中1 mL菌液離心棄上清液，ddH2O洗滌2次后烘至恒重，稱量計(jì)算干重。另0.5 mL菌液同樣離心洗滌，添加菌體等體積的玻璃珠與1 mL三氯甲烷；振蕩破碎3 min，冰浴1 min，重復(fù)2～3次，4 ℃低溫離心后錫紙包裹，于4 ℃冰箱內(nèi)靜置過(guò)夜萃取。隔天吸取萃取液至新EP管中，氮?dú)獯蹈?，精確添加1 mL正己烷復(fù)溶，用酶標(biāo)儀測(cè)定番茄紅素產(chǎn)量。

1.2.6 番茄紅素測(cè)定

本研究使用酶標(biāo)儀進(jìn)行番茄紅素測(cè)定，測(cè)定波長(zhǎng)為472 nm，每個(gè)樣品取4個(gè)平行。番茄紅素標(biāo)品用于定量分析，精確稱取1.5 mg番茄紅素標(biāo)品用正己烷定量于15 mL棕色容量瓶，充分溶解，加入體積分?jǐn)?shù)1%的2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)作為抗氧化劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩ｎA(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明番茄紅素樣品在0～20 mg/L線性最好，故選取該范圍制作標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品測(cè)定。

1.2.7 胞外代謝物的檢測(cè)

發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇的濃度利用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。以Bio-RadHPX-87H為色譜柱，5%的稀硫酸作為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，柱溫50 ℃，示差檢測(cè)器。

1.2.8 熒光顯微鏡檢

番茄紅素主要積累于釀酒酵母胞內(nèi)的脂閥上，會(huì)于熒光顯微鏡綠色激發(fā)光下發(fā)出熒光。將轉(zhuǎn)化番茄紅素表達(dá)盒的重組菌株涂布諾爾斯-潮霉素雙抗平板，30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)4 d后挑取紅色單菌落制片，置熒光顯微鏡100×物鏡下，分別于明場(chǎng)下與綠色激發(fā)光下觀察其圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝改造表達(dá)盒的構(gòu)建

構(gòu)建脂質(zhì)途徑改造表達(dá)盒如圖2-a所示，前體及轉(zhuǎn)錄途徑相關(guān)表達(dá)盒如圖2-b所示。本研究以YthmgⅠ[17]為出發(fā)菌株，對(duì)gal10位點(diǎn)敲入ldp1同時(shí)敲除gal10，得到重組菌株LFD5，單獨(dú)敲除gal10得到LFD6；在gal7位點(diǎn)敲入pap1同時(shí)敲除gal7，得到LFD7，單敲除gal7得到LFD8；在exg1位點(diǎn)敲入GAL1，10pr-pah1-ADH1ter同時(shí)敲除exg1，得到LFD9；敲入ADH1ter-dga1-GAL1，10pr-pah1-ADH1ter同時(shí)敲除exg1，得到LFD10；單敲除exg1得到LFD11；在gal1位點(diǎn)敲入acc1同時(shí)敲除gal1，得到LFD13；單敲除gal1得到LFD14。

a-GAL啟動(dòng)子控制TAG途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)；b-GAL啟動(dòng)子控制關(guān)鍵基因pap1和acs1L641P的表達(dá)圖2 代謝改造途徑表達(dá)盒Fig.2 Metabolic engineering pathway expression box

以LFD10為出發(fā)菌株，對(duì)gal10位點(diǎn)敲入ldp1同時(shí)敲除gal10，得到重組菌株LFD12。以LFD12為出發(fā)菌株，在ypl062w位點(diǎn)敲入GAL1，10pr-acs1L641P-ADH1ter同時(shí)敲除ypl062w，得到重組菌LFD15，單敲除ypl062w得到LFD16；分別以LFD12、LFD15為出發(fā)菌株，于gal7位點(diǎn)敲入pap1同時(shí)敲除gal7，得到重組菌LFD17、LFD18。

2.2 釀酒酵母脂質(zhì)體合成途徑的改造

將脂質(zhì)途徑改造重組菌LFD5、LFD6、LFD9、LFD10、LFD11、LFD12、LFD13、LFD14，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵96 h時(shí)的樣品進(jìn)行分析測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3 重組菌搖瓶發(fā)酵的番茄紅素產(chǎn)量Fig.3 Lycopene production in shake flask fermentation of recombinant strains注：LFD5：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；LFD6：as YthmgⅠ；Δgal10∷non-marker；LFD9：as YthmgⅠ；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1-ADH1ter；LFD10：as YthmgⅠ；Δexg1∷GAL1,10pr-pah1,dga1-ADH1ter；LFD11：as YthmgⅠ；Δexg1∷non-marker；LFD12：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1, dga1-ADH1ter；LFD13：as YthmgⅠ；Δgal1∷acc1；LFD14：as YthmgⅠ；Δgal1∷non-marker

就過(guò)表達(dá)單個(gè)基因而言，LFD5的產(chǎn)量最高，但仍不及出發(fā)菌株。雖然各基因單一表達(dá)時(shí)對(duì)番茄紅素產(chǎn)量提升的效果并不顯著，但組合表達(dá)后，重組菌LFD12(過(guò)表達(dá)dga1、pah1、ldp1)的產(chǎn)量大大提高，為45.76 mg/g DCW，是YthmgⅠ的1.5倍。選取產(chǎn)量較高的重組菌，利用熒光顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。菌體熒光亮度與番茄紅素單位細(xì)胞產(chǎn)量呈正相關(guān)，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)較為明亮的綠色小點(diǎn)。

圖4 熒光顯微鏡觀察重組菌于綠色激發(fā)光下(a)與明場(chǎng)下(b)的圖像Fig.4 Fluorescence microscopy images of recombinant strains under green excitation light (a) and bright field (b)

2.3 胞內(nèi)乙酰輔酶A合成酶及轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)基因的過(guò)表達(dá)

對(duì)重組菌LFD12(基于YthmgⅠ組合過(guò)表達(dá)脂質(zhì)相關(guān)基因)、LFD15(基于LFD12過(guò)表達(dá)乙酰CoA合成基因)、LFD18(基于LFD15加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄翻譯基因)敲入番茄紅素表達(dá)盒后進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯鯨FD18的產(chǎn)量最高，單位產(chǎn)量109.26 mg/g DCW，是出發(fā)菌株YthmgⅠ的3.36倍。

圖5 重組菌搖瓶發(fā)酵的番茄紅素產(chǎn)量Fig.5 Lycopene production in shake flask fermentation of recombinant strains注：LFD12：as YthmgⅠ；Δgal10∷ldp1；Δexg1∷GAL1, 10pr-pah1, dga1-ADH1ter；LFD15：as LFD12；Δypl062w∷GAL1, 10pr-acs1L641P-ADH1ter；LFD18：as LFD15；Δgal7∷pap1

分別對(duì)LFD12、LFD15、LFD18進(jìn)行熒光鏡檢，結(jié)果如圖6所示，LFD18的熒光最為明亮，這與番茄紅素產(chǎn)量相符。

圖6 熒光顯微鏡觀察重組菌于綠色激發(fā)光下(a)與明場(chǎng)下(b)的圖像Fig.6 Fluorescence microscopy images of recombinant strains under green excitation light (a) and bright field (b)

為了進(jìn)一步探究過(guò)表達(dá)pap1的效果，分別對(duì)YthmgⅠ、LFD7(基于YthmgⅠ過(guò)表達(dá)pap1)、LFD18(基于LFD15過(guò)表達(dá)pap1)敲入番茄紅素表達(dá)盒后進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，定期取樣至96 h進(jìn)行分析測(cè)定，繪制曲線圖，結(jié)果如圖7所示。可看出，通過(guò)代謝改造敲入的基因越多，過(guò)表達(dá)pap1對(duì)產(chǎn)量的提升越為顯著。

a-番茄紅素產(chǎn)量；b-菌株生長(zhǎng)曲線圖7 使用不同出發(fā)菌株過(guò)表達(dá)pap1的效果Fig.7 Typical profiles observed for lycopene production and cell growth注：LFD7: as YthmgⅠ; Δgal7∷pap1; LFD18: as YthmgⅠ; Δexg1∷GAL1,10pr-dga1, pah1-ADH1ter; Δgal10∷ldp1; Δypl062w∷GAL10pr-acs1L641P-ADH1ter; Δgal7∷pap1

2.4 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

本研究使用上海迪必爾5 L發(fā)酵罐，發(fā)酵菌株為L(zhǎng)FD18，發(fā)酵條件為：溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速500 r/min；使用的培養(yǎng)基為DYPD，從發(fā)酵45 h開(kāi)始以20 g/h的速度恒速流加補(bǔ)充葡萄糖；發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為96 h。對(duì)番茄紅素產(chǎn)量、菌體生長(zhǎng)情況以及胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示。

a-LFD18在發(fā)酵罐中補(bǔ)料發(fā)酵96h；b-LFD18的生長(zhǎng)曲線和番茄紅素產(chǎn)量；c-LFD18發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、乙酸酯和甘油的濃度圖8 葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵LFD18的番茄紅素產(chǎn)量、菌體量及副產(chǎn)物測(cè)定Fig.8 Determination of lycopene yield, biomass and by-products of LFD18 during glucose fed-batch fermentation

番茄紅素產(chǎn)量最終達(dá)到191.77 mg/L，單位產(chǎn)量為30.44 mg/g DCW。葡萄糖在0～23 h被快速耗盡，同時(shí)產(chǎn)生一定量乙醇；葡萄糖耗盡后，乙醇作為碳源被消耗，菌體生長(zhǎng)減緩，番茄紅素快速積累，同時(shí)生成乙酸。自45 h恒速流加葡萄糖后，乙醇重新開(kāi)始積累，菌體繼續(xù)緩慢生長(zhǎng)，至60 h后達(dá)到穩(wěn)定。發(fā)酵總過(guò)程隨著菌體生長(zhǎng)出現(xiàn)一定的甘油積累，累積速度與菌體生長(zhǎng)呈現(xiàn)不完全的正相關(guān)，且在發(fā)酵過(guò)程中幾乎不被消耗。

3 結(jié)論與討論

TAG途徑與MVA途徑共用乙酰CoA作為前體，而2個(gè)途徑的產(chǎn)物積累時(shí)間不盡相同：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的番茄紅素表達(dá)盒由GAL啟動(dòng)子啟動(dòng)，其產(chǎn)物積累會(huì)發(fā)生在葡萄糖濃度降低時(shí)；而菌體中脂質(zhì)積累在氮源耗盡且碳源充足時(shí)較為顯著[18]，可以實(shí)現(xiàn)2條代謝途徑的有序分流，亦可避免短時(shí)間內(nèi)代謝通量過(guò)大耗盡乙酰CoA庫(kù)，有利于維持菌體內(nèi)部代謝的動(dòng)態(tài)平衡。本實(shí)驗(yàn)利用GAL啟動(dòng)子組合過(guò)表達(dá)脂質(zhì)途徑相關(guān)基因后，番茄紅素產(chǎn)量提升至45.76 mg/g DCW，是原菌株產(chǎn)量的1.7倍，說(shuō)明提高菌體內(nèi)脂質(zhì)含量有利于番茄紅素積累。觀察顯微鏡像可見(jiàn)，菌體熒光強(qiáng)度與脂質(zhì)改造過(guò)表達(dá)基因數(shù)目正相關(guān)。

MA等[15]在釀酒酵母中同時(shí)過(guò)表達(dá)TAG途徑的關(guān)鍵基因pah1、dga1、acc1后胞內(nèi)TAG含量增加了59%，番茄紅素產(chǎn)量提升了110%；此外還敲除了fld1，該策略顯著增加了番茄紅素積累，但是縮短了釀酒酵母的壽命。ZHU等[16]研究表明，ldp1在釀酒酵母中過(guò)量表達(dá)時(shí)，Ldp1定位于脂滴表面促進(jìn)了巨大脂滴形成，這表明Ldp1在酵母脂滴動(dòng)力學(xué)方面有著重要作用。SHI等[19]通過(guò)在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)來(lái)自腸道沙門氏菌的乙醛脫氫酶基因ald6、乙酰輔酶A合成酶基因acs以及乙醇脫氫酶基因adh211，顯著增加了代謝通量，番茄紅素產(chǎn)量相較改造前提高了12%。SHIBA等[20]組合表達(dá)來(lái)自三孢布拉霉的ald6和acs1L641P將乙酸合成乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化率提高了3倍，使得紫穗槐二烯的產(chǎn)量提高了4倍。本實(shí)驗(yàn)在脂滴改造的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加強(qiáng)乙酰CoA的表達(dá)，番茄紅素產(chǎn)量相較過(guò)表達(dá)acs1L641P前并無(wú)提高，而在脂質(zhì)改造及乙酰CoA改造的基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因pap1后番茄紅素產(chǎn)量提高了2.6倍，單位產(chǎn)量達(dá)到109.26 mg/g DCW，鏡檢可見(jiàn)菌體熒光明顯增強(qiáng)，說(shuō)明基因過(guò)表達(dá)應(yīng)輔以轉(zhuǎn)錄強(qiáng)化，保證對(duì)應(yīng)基因的高效表達(dá)。

SHI等[19]使用7 L發(fā)酵罐，分別使用葡萄糖與乙醇作為碳源，通過(guò)兩階段補(bǔ)料方法對(duì)代謝改造釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，番茄紅素總產(chǎn)量達(dá)到3.28 g/L，相較搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量310 mg/L提高了11倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合脂質(zhì)工程與代謝工程，構(gòu)建了番茄紅素高產(chǎn)釀酒酵母菌株，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量為360.66 mg/L；通過(guò)發(fā)酵罐恒速流加葡萄糖培養(yǎng)96 h，產(chǎn)量為191.77 mg/L，相較搖瓶反而有所降低。菌體在發(fā)酵后期退化較為嚴(yán)重，猜測(cè)一是由于發(fā)酵后期葡萄糖流加速度過(guò)大導(dǎo)致乙醇大量積累，抑制了菌體生長(zhǎng)；二是YPH499菌株本身較容易退化，不適宜大體系發(fā)酵培養(yǎng)。后續(xù)可以再實(shí)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、分批補(bǔ)料優(yōu)化等策略，進(jìn)一步提高重組菌的番茄紅素產(chǎn)量。