戚曉雪，徐瑩，汪東風

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

隨著工業(yè)發(fā)展，砷被越來越多地釋放到環(huán)境中，進入食物鏈和生物圈，對人類、動物和環(huán)境造成嚴重威脅[1-3]。砷酸鹽[arsenate，As(Ⅴ)]是海水中主要的砷化合物，能被浮游植物、藻類、甲殼動物、軟體動物等海洋生物吸收[4]，并通過多種方式進入食物鏈，影響食品安全。研究人員對昆山市農貿市場及超市所售食品隨機抽樣，211份檢測食品中，砷的檢出率是21.33%；其中發(fā)現(xiàn)3份海魚樣本砷超標，最高超過國家標準近3倍[5]。因而急需建立一種安全、高效、適用范圍廣的食品砷脫除方法，安全經濟的微生物脫除法已成為砷脫除的優(yōu)選方法之一。

一些關于酵母的研究顯示了它們在砷生物修復方面的潛力[6-8]。庫德畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)作為一種多抗性酵母，可以抵抗高鹽、高溫和低pH值[9-10]，已從果汁、漿果、茶啤酒和一些非洲發(fā)酵乳制品中被分離出來[11-14]。常被用來生產乳酸[10]、琥珀酸[15]和乙醇[16]等物質，在食品工業(yè)中有著廣泛的應用前景。前期對P.kudriavzeviiA16的研究表明，其對鎘、鋅等多種重金屬離子具有良好的抗性和脫除能力[17-18]，具有從食品中脫除有害物質的應用潛能。

非靶向代謝組學技術可以盡可能多地定性以及相對定量生物體系中的代謝物，最大程度來反映總代謝物信息，常用于代謝表型的區(qū)分和差異代謝物的發(fā)現(xiàn)[19]。代謝組學是更接近于表型的組學，能夠更直接、更準確地反映生物體的生理狀態(tài)。因此，非靶向代謝組學技術有利于更直觀地研究As(Ⅴ)脅迫下P.kudriavzeviiA16代謝物的變化。

本研究著眼于微生物脫砷技術在行業(yè)中廣闊的應用前景，以P.kudriavzeviiA16為研究對象，基于非靶向代謝組學方法探討As(Ⅴ)暴露24 h后P.kudriavzeviiA16細胞中代謝物的變化及可能的通路分析，該研究為如何提高生物體的砷脫除能力提供有益思路，并更好地應用于食品中砷的脫除。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

P.kudriavzeviiA16為本實驗室保藏菌株，分離自高溫白酒酒醅[20]。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

Na2HAsO4·7H2O(分析純)，湖北楚盛威化工有限公司；硝酸(優(yōu)級純)；高氯酸(優(yōu)級純)；砷標準液(GSB 04-1714—2004)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心。

1.2.2 主要儀器

QYC 211型恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海福瑪實驗設備有限公司；LD5-10型低速離心機，北京雷勃爾離心機有限公司；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Powerwave XS型酶標儀，美國BioTek儀器公司；EHD-24電熱消解儀，北京東航科儀儀器有限公司；8800電感耦合等離子體質譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 主要培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：20葡萄糖、20蛋白胨、10酵母浸粉。固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂。含砷培養(yǎng)基中砷的濃度根據(jù)實驗需要而定。

1.4 菌種活化

P.kudriavzeviiA16菌種先后進行固體活化及液體活化。首先將4 ℃保存的菌種接種到YPD斜面固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。從固體斜面上取少量菌體接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，在28 ℃恒溫振蕩(180 r/min)條件下培養(yǎng)24 h[20]。

1.5 As(Ⅴ)對P.kudriavzevii A16生長的影響和砷脫除率

取1 mL經過液體活化后的P.kudriavzeviiA16菌懸液接種于含不同質量濃度As(Ⅴ)(Na2HAsO4·7H2O 0、5、10、15、20 mg/L)的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。取酵母培養(yǎng)液稀釋10倍后600 nm處測定吸光值，即用OD600來描述酵母菌生長情況。酵母培養(yǎng)液5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入到消化管中，并加入4 mL濃硝酸與1 mL高氯酸，加熱使其充分消化，超純水適當稀釋后，使用電感耦合等離子體質譜儀測定總砷含量，砷脫除率R按照公式(1)計算[20]。

(1)

式中：ρ0，生物積累前YPD培養(yǎng)基中總砷的質量濃度，mg/L；ρt，生物積累后YPD培養(yǎng)基中總砷的質量濃度，mg/L。

1.6 代謝組學分析樣品的制備

液體活化后的P.kudriavzeviiA16接種到YPD培養(yǎng)基(空白對照組，BK組)；液體活化后的P.kudriavzeviiA16接種到含12 mg/L As(Ⅴ) YPD培養(yǎng)基(砷脅迫組，As組)；P.kudriavzeviiA16的接種量均為4×108個，28 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

采用離心法收集菌體(保證離心后各樣品菌體體積一致)，用預冷的PBS快速沖洗2～3次，每次清洗后4 ℃、5 000 r/min離心5 min；棄去上清液，菌體收集在2 mL離心管中，液氮速凍15 min，-80 ℃保存。P.kudriavzeviiA16代謝物的提取及后續(xù)分析均委托北京Novogene生物信息科技有限公司完成。主要實驗流程圖如圖1所示。

圖1 主要實驗流程圖Fig.1 Main experiment flow chart

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)對鑒定到的代謝物進行注釋。多元統(tǒng)計分析部分，使用代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件metaX對數(shù)據(jù)進行轉換，再進行主成分分析(principal component analysis，PCA)和偏最小二乘法判別分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA)，進而得到每個代謝物在PLS-DA模型中第一主成分的變量投影重要度(variable importance in projection,VIP)。單變量分析部分，基于t檢驗來計算各代謝物在兩組間統(tǒng)計學顯著性(P值)，并計算代謝物在兩組間的差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。差異代謝物的篩選設定閾值為VIP>1.0，F(xiàn)C>1.5或FC<0.667且P<0.05。

2 結果與分析

2.1 As(Ⅴ)對P.kudriavzevii A16生長及砷脫除率的影響

不同濃度As(Ⅴ)對P.kudriavzeviiA16毒性有較大差異，P.kudriavzeviiA16培養(yǎng)液OD600及砷脫除率如表1所示。

正常培養(yǎng)條件下，P.kudriavzeviiA16的OD600為0.606，而5 mg/L As(V)脅迫下P.kudriavzeviiA16的OD600降低到0.502，10 mg/L As(V)脅迫下P.kudriavzeviiA16的OD600僅有0.063。隨著砷質量濃度升高，生物量降低很多，這說明As(V)抑制了P.kudriavzeviiA16的生長。在As(V)的質量濃度為5 mg/L培養(yǎng)基中接種P.kudriavzeviiA16培養(yǎng)24 h后，該組砷的脫除率為61.84%。隨著As(V)質量濃度的增加，培養(yǎng)液OD600值逐漸降低，同時各組砷脫除率也逐漸降低。P.kudriavzeviiA16的砷脫除率與P.kudriavzeviiA16的生長密切相關。

表1 不同質量濃度As(Ⅴ)條件下P.kudriavzevii A16培養(yǎng)液OD600及砷脫除率Table 1 OD600 and arsenic removal rate of P.Kudriavzevii A16 culture under different concentrations of As(Ⅴ)

2.2 PCA

通過PCA圖可以觀察到不同處理組間的差異。如圖2所示，正負離子模式下As與BK組組內均平行性較好，組間均相隔較遠，分離明顯，這表明每個不同區(qū)域中的樣本具有特定的代謝譜。與BK組相比，在As(Ⅴ)脅迫下的As組，P.kudriavzeviiA16產生了生物響應，代謝產物發(fā)生了明顯的變化。

a-正離子模式；b-負離子模式圖2 主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis

2.3 PLS-DA

a-正離子模式；b-負離子模式圖3 PLS-DA得分散點圖Fig.3 PLS-DA dispersion point diagram

R2和Q2通常用來衡量模型是否過擬合。如圖4所示，正負離子模式下，As、BK組與POAs、As組，R2>Q2且Q2回歸線與Y軸截距<0，可知該模型未“過擬合”，穩(wěn)定性高。

a-正離子模式；b-負離子模式圖4 PLS-DA排序驗證圖Fig.4 PLS-DA sorting verification diagram

2.4 差異代謝物熱圖分析

不同樣品中代謝物的積累模式差異可以通過聚類熱圖進行分析，圖5顯示了正、負離子模式下As組與BK組的顯著性差異代謝物層次聚類結果。說明兩組樣本中差異代謝物可明顯區(qū)分，并且As(Ⅴ)脅迫P.kudriavzeviiA16下的代謝物與正常培養(yǎng)組BK組相比發(fā)生了顯著變化。

2.5 差異代謝物的篩選與鑒定

搜庫結果(mzCloud Results, mzVault Results,MassList Results)設定為full match，選擇差異代謝物TOP 35進行列表，如表2和表3所示。

a-正離子模式；b-負離子模式；As1、As2、As3為As組中平行樣品；BK1、BK2、BK3為BK組中平行樣品圖5 差異代謝物聚類分析圖Fig.5 Cluster analysis of differential metabolites注：縱向是樣品的聚類，橫向是代謝物的聚類，聚類枝越短代表相似性越高

表2 正離子模式下As組與BK組差異代謝物Table 2 The significantly differential metabolites in the As group and BK group in positive ion modes

續(xù)表2

表3 負離子模式下As組與BK組差異代謝物Table 3 The significantly differential metabolites in the As group and BK group in negative ion modes

續(xù)表3

通過火山圖可以直觀顯示代謝物在兩組樣品中含量的差異，以及差異的統(tǒng)計學顯著性?；鹕綀D中每個點代表一個代謝物，顯著上調的代謝物用紅色點表示，顯著下調的代謝物用綠色點表示，圓點的大小代表VIP值，如圖6所示。

a-正離子模式；b-負離子模式圖6 差異代謝物火山圖Fig.6 Volcanic map of differential metabolites

正離子模式下，在As、BK兩組樣本之間共檢測到差異代謝物317種，其中，有169種顯著上調表達，其中包括鳥嘌呤、3’-磷酸腺苷、L-半胱氨酸、肌苷等，有148種代謝物顯著下調表達，包括DL-谷氨酰胺、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)、D-(+)-脯氨酸、精胺等；負離子模式下，在As、BK兩組樣本之間檢測到差異代謝物329種，其中，有171種顯著上調表達，其中包括膽汁酸、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)、磷酸烯醇式丙酮酸等，有158種代謝物顯著下調表達，包括D-(-)-谷氨酰胺、檸檬酸、3-羥基丁酸、L-谷胱甘肽、琥珀酸、α, α-海藻糖等。

2.6 差異代謝物KEGG富集通路

將不同比較組中所有的差異代謝物匹配KEGG的數(shù)據(jù)庫從而獲得代謝物參與的通路信息。對注釋完的結果進行富集分析，獲得差異代謝物富集較多的通路。如圖7所示，正離子模式下，As組與BK組差異代謝物主要注釋和富集在谷胱甘肽代謝通路，氨酰tRNA生物合成代謝通路，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、氰基氨基酸代謝通路等；負離子模式下As與BK差異代謝物主要注釋和富集在檸檬酸循環(huán)，乙醛酸和二羧酸代謝通路，丙酮酸代謝通路，谷胱甘肽代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路等。

a-正離子模式；b-負離子模式圖7 KEGG富集通路氣泡圖Fig.7 KEGG enrichment pathway bubble map

3 討論

本研究采用先進的非靶向代謝組學技術對正常培養(yǎng)與砷酸鹽脅迫條件下P.kudriavzeviiA16的代謝物進行比對，并篩選出關鍵的差異代謝物，研究As(Ⅴ)脅迫下P.kudriavzeviiA16的代謝物變化。

磷酸烯醇式丙酮酸等代謝物在P.kudriavzeviiA16中的下調表達，說明As(Ⅴ)可能促進了P.kudriavzeviiA16的糖酵解反應；脂肪酸羥基化可生成羥基丁酸，而在3-羥基丁酸脫氫酶的作用下羥基丁酸氧化生成乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)[21]。As(Ⅴ)脅迫使得3-羥基丁酸等物質的下調表明As(Ⅴ)可能會促進P.kudriavzeviiA16的脂肪酸代謝，上調TCA循環(huán)，同時3′-磷酸腺苷的表達量上調，可為細胞提供更多的能量供應。

位于線粒體的內膜上的電子傳遞鏈是氧化磷酸化反應及ATP合成的主要位點，As(Ⅴ)脅迫下P.kudriavzeviiA16胞內NAD+表達量的下調及FMN表達量的上調，表明As(Ⅴ)可能促進了P.kudriavzeviiA16細胞的氧化磷酸化反應。

氨基酸通過TCA循環(huán)可以為生物體供能[22]，在本研究中，As(Ⅴ)脅迫下P.kudriavzeviiA16胞內甘氨酸、絲氨酸和絲氨酸代謝通路，氰基氨基酸代謝通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著上調，說明As(Ⅴ)脅迫導致了酵母細胞的能量代謝發(fā)生紊亂。LI等[23]以甘氨酸等氨基酸的含量變化闡明了斑馬魚受到砷脅迫會導致其能量代謝異常。另外有研究表明，生物體可以通過提高氨基酸的代謝速率來為機體提供應對外界脅迫所需的能量[24]。此外，氨?；鵷RNA可以通過轉運氨基酸影響核糖體蛋白的生物合成，氨酰tRNA生物合成代謝通路顯著上調表達，表明As(Ⅴ)脅迫對P.kudriavzeviiA16胞內的蛋白質合成/降解產生干擾。這與當砷質量濃度大于5 mg/L時生長受到明顯抑制的現(xiàn)象一致。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是防御細胞氧化應激關鍵因素，具有抗氧化的作用，可以緩解細胞的氧化應激；除此之外GSH可與蛋白質上的活性巰基結合，從而使其免于不可逆的氧化損傷[25]。GSH被認為是細胞抵抗有毒物質的一個重要組成部分，是無機砷氧化還原及砷解毒的重要物質[22]，作為一種金屬螯合劑，它在細胞抗砷毒性中發(fā)揮著重要作用[26]。谷胱甘肽代謝通路的顯著富集表明GSH可能被催化為氧化型谷胱甘肽，參與細胞砷的解毒。因此GSH與P.kudriavzeviiA16的生長和對培養(yǎng)基中砷脫除率關系密切，提示今后可以通過基因工程手段或者發(fā)酵工藝優(yōu)化來提高GSH的表達。

4 結論

砷酸鹽對P.kudriavzeviiA16的生長有抑制作用；隨著培養(yǎng)液中As(Ⅴ)濃度升高，P.kudriavzeviiA16對砷的脫除率下降。P.kudriavzeviiA16通過調節(jié)體內糖酵解反應、TCA循環(huán)、脂肪酸氧化代謝、氧化磷酸化和氨基酸代謝提高能量供給以應對As(Ⅴ)脅迫導致的毒性效應；此外，谷胱甘肽代謝通路的顯著富集也表明P.kudriavzeviiA16胞內GSH參與As(Ⅴ)的解毒作用，以減輕As(Ⅴ)脅迫帶來的細胞氧化損傷，降低As(Ⅴ)毒性。后續(xù)將利用其他組學聯(lián)合分析，厘清關鍵性差異代謝物并進行驗證性研究，為建立P.kudriavzeviiA16砷脫除技術提供有益參考。