王 婷

（新疆昌吉州動物疾病預(yù)防控制中 831100）

自從非洲豬瘟傳入我國以來，它對我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了較大的威脅，有時，還會因非洲豬瘟病毒的傳播與蔓延，造成生豬流行性傳染疾病，給生豬養(yǎng)殖企業(yè)或農(nóng)戶帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來，預(yù)防和治療非洲豬瘟病毒傳播與蔓延，已成我國生豬產(chǎn)業(yè)防治的重點，并探索和研究比較有效的預(yù)防方法和治療措施，用以保護(hù)我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不受其害，壯大我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，促進(jìn)新時代社會經(jīng)濟(jì)建設(shè)與發(fā)展。為此，我國有關(guān)主管部門已經(jīng)適時發(fā)布了針對非洲豬瘟病毒的檢測方法，要求各地應(yīng)用熒光PCR方法，強(qiáng)化對非洲豬瘟病毒的檢測，并為我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)起到了比較好的預(yù)防和控制作用。通過檢測實踐證明，應(yīng)用非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測方法，其檢測結(jié)果相對有效。但是，需要控制在檢測過程中出現(xiàn)的環(huán)境污染問題，否則，不但會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，還會因檢測結(jié)果出現(xiàn)的漏洞，不能及時采取應(yīng)對預(yù)防措施，造成非洲豬瘟病毒的傳播與蔓延，給我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。

1 應(yīng)用非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測方法需要的設(shè)施環(huán)境

眾所周知，我國地域廣大，幅員遼闊，各地造就的自然環(huán)境和生豬生長環(huán)境不同，形成的非洲豬瘟病毒檢測環(huán)境同樣不同。比如，地處我國西北邊陲的新疆昌吉地區(qū)，因其地處地球北緯緯度比較高的地帶，形成的氣候條件，是夏短冬長，氣溫溫差極大。如果在這一地區(qū)進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測，則是需要根據(jù)檢測要求，創(chuàng)設(shè)一個適合構(gòu)建檢測設(shè)施的必要環(huán)境。應(yīng)用熒光PCR方法檢測非洲豬瘟病毒，需要構(gòu)建一個實驗室，還要求這個實驗室，必須是能夠形成彼此獨(dú)立，又要實現(xiàn)隔離的三個區(qū)域，即核酸提取室、試劑準(zhǔn)備室和擴(kuò)增分析室。三個實驗區(qū)域的隔離程度，在它們之間，都不能實現(xiàn)空氣的直接相通。進(jìn)行這樣嚴(yán)格的隔離，主要是為了預(yù)防出現(xiàn)交叉污染，以免影響對非洲豬瘟病毒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與正確性[1]。

2 嚴(yán)格管護(hù)非洲豬瘟病毒的樣品

非洲豬瘟病毒樣品本身就潛在比較強(qiáng)的危險性，需要對它們進(jìn)行滅活、離心、研磨與剪碎等一系列必要程序的處理。同時，在處理非洲豬瘟病毒樣品時，還必須要在二級生物安全柜當(dāng)中，安全地實施處理。處理過程，一定要切忌將非洲豬瘟病毒液體，濺到生物安全柜上，以防在生物安全柜上留下殘液，出現(xiàn)非洲豬瘟病毒樣品之間的交叉污染問題。不僅如此，還要管護(hù)好裝有非洲豬瘟病毒樣品的離心管，必須要蓋嚴(yán)密封離心管，嚴(yán)禁非洲豬瘟病毒液體出現(xiàn)外泄問題。

3 正確應(yīng)用檢測儀器

進(jìn)行非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測，需要應(yīng)用的檢測設(shè)備或儀器，主要有微量移液器、核酸提取儀、二級生物安全柜、冷凍離心機(jī)和熒光PCR儀等。在應(yīng)用這些檢測設(shè)備或儀器以前，一定要對它們實施必要的定期功能性檢查、檢定與校準(zhǔn)，用以保證這些設(shè)備或儀器，是處在一種正常的使用狀態(tài)之下。尤其要保持熒光PCR儀的清潔性，嚴(yán)禁熒光PCR儀存在一些污染物、雜物或灰塵。在實驗室的三個區(qū)域之間，一定要保證它們使用的專用性，尤其要嚴(yán)禁調(diào)換使用移液器，挪用實驗設(shè)備或儀器[2]。

4 精心處置和使用試劑

進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測，必須要使用必要的試劑。如果使用的是一種商品試劑盒，在接收到試劑盒以后，必須要將這樣試劑盒內(nèi)的陽性對照，放在實驗室的核酸提取室當(dāng)中，并將熒光PCR預(yù)混液，也要放在實驗室的試劑準(zhǔn)備室當(dāng)中。因為試劑盒內(nèi)的陽性對照，它們絕大多數(shù)都是重組質(zhì)粒或高濃度的陽性樣本，其本身就潛在較大的危險性。正是因為這樣，在開蓋吸取這些標(biāo)本的時候，操作人員一定要慎之又慎，并倍加小心，因為如果一旦出現(xiàn)一些濺灑現(xiàn)象，將會提高非洲豬瘟病毒樣品標(biāo)本的污染性，進(jìn)而會嚴(yán)重影響到非洲豬瘟病毒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與正確性。

5 特別注意防范性操作

開展非洲豬瘟病毒檢測工作，必須有專業(yè)人員進(jìn)行檢測操作。這樣，就需要對具體實施檢測的操作人員，開展系統(tǒng)的上崗培訓(xùn)工作，并堅持培訓(xùn)考核，通過考核合格以后，進(jìn)行持證上崗。同時，即使是專業(yè)檢測人員也要建立高度的預(yù)防檢測污染意識，并具備高超的檢測操作技能。檢測人員由此實驗區(qū)域到彼實驗區(qū)域，都必須要注意及時更換防護(hù)用品。如果是在核酸提取室內(nèi)進(jìn)行檢測過程操作，要戴好一次性口罩、手套和帽子，并要做到對它們進(jìn)行勤換，以防造成污染。如果要對熒光PCR管進(jìn)行封蓋處理，操作人員必須要使用一次性的PE手套實施操作。

6 實施嚴(yán)格的實驗檢測操作

6.1 實驗檢測必須遵循的原則

檢測人員進(jìn)入試驗區(qū)，必須要按照單一方向的行進(jìn)程序，主持具體的實驗檢測，即由試劑準(zhǔn)備室，到核酸提取室，再到擴(kuò)增分析室。在每個試驗區(qū)，一定要設(shè)置好非常明顯的警示或提示標(biāo)志。各實驗區(qū)域還要必須保持高度清潔，嚴(yán)禁將各個試驗區(qū)的實驗設(shè)備、儀器或物品混用。當(dāng)實驗檢測操作人員需要離開實驗檢測區(qū)域時，切忌將工作服帶出實驗區(qū)域[1]。

6.2 正確操作預(yù)混與試劑的分裝

擴(kuò)增所需要的試劑，需要在紫光燈照射環(huán)境下的負(fù)壓工作臺或超凈工作臺上，進(jìn)行配置與分裝，并需要對熒光PCR預(yù)混液，進(jìn)行小量的分裝，還要將分裝好的熒光PCR預(yù)混液，保存在-20℃的環(huán)境之中。在進(jìn)行熒光PCR預(yù)混液分裝時，也要盡可能減少重復(fù)加樣的頻率次數(shù)，用以減少造成污染的機(jī)會。在分裝預(yù)混液和試劑的過程中，僅需應(yīng)用試劑準(zhǔn)備室中的移液器以及Tip頭，一定要禁用其他實驗區(qū)域的移液器和Tip頭，意在預(yù)防發(fā)生污染現(xiàn)象。

6.3 規(guī)范進(jìn)行核酸提取加樣

凡是參加非洲豬瘟病毒檢測的操作人員，都必須根據(jù)試劑盒上的說明書或作業(yè)操作指導(dǎo)書所提示的步驟，進(jìn)行嚴(yán)格的操作，預(yù)防非洲豬瘟病毒標(biāo)本或試劑遭到氣溶膠的污染。同時，具體檢測操作人員，必須要戴一次性手套，如果被戴的一次性手套上，不管是什么原因被濺上了相應(yīng)的反應(yīng)液，必須要立即更換新的一次性手套。如果檢測操作需要打開離心管，又必須需要檢測操作人員運(yùn)用雙手，打開離心管。在開啟離心管時，動作一定要輕，也要用又緩勁，意在預(yù)防液體被濺出。假若濺到了手套或桌面上時，不但要及時更換手套，還要用稀酸對桌面進(jìn)行快速的擦拭。如果用移液器吸取液體或進(jìn)行加樣時，同樣要加倍小心，既要進(jìn)行慢慢地吸，又要一次性吸完，以防出現(xiàn)交叉性污染或形成氣溶膠污染，并且要在最后一道操作程序，加陽性對照，用以降低陰性對照或標(biāo)本的污染幾率。當(dāng)加入核酸以后，又必須要即刻蓋緊管蓋，用以規(guī)避在樣品之間出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象。

6.4 進(jìn)行擴(kuò)增分析

進(jìn)行非洲豬瘟病毒樣品擴(kuò)增分析，需要在擴(kuò)增分析室內(nèi)進(jìn)行，具體操作人員要盡可能減少不必要的走動，意在規(guī)避氣溶膠性的污染。在應(yīng)用熒光PCR實施非洲豬瘟病毒擴(kuò)增分析時，它并不需要進(jìn)行電泳。當(dāng)經(jīng)過擴(kuò)增后已經(jīng)使用過的反應(yīng)管，絕對不能再使用，需要直接對它們進(jìn)行必要的無害化處理。對反應(yīng)管的處理，要么進(jìn)行焚燒，要么進(jìn)行深埋，絕不允許草草地處理，以免出現(xiàn)污染后患。

6.5 必須做好試驗區(qū)的清潔工作

當(dāng)對非洲豬瘟病毒實驗檢測過程完成以后，一定要用次氯酸鈉或紫外燈進(jìn)行照射，以這樣的消毒方式，將實驗檢測用過的工作臺面，進(jìn)行比較徹底地消毒，然后再用70%的乙醇或清水，對次氯酸鈉進(jìn)行徹底地清洗。在應(yīng)用紫外燈照射方式進(jìn)行消毒清潔時，需要將紫外燈光照射的波長，至少調(diào)整到254nm，進(jìn)行紫外線照射消殺。如果是對實驗工作臺面進(jìn)行紫外線殺毒，需要將紫外線燈放在距離實驗工作臺面的60～90cm的間距上，進(jìn)行紫外照射殺毒。對于應(yīng)用熒光PCR方法檢測非洲豬瘟病毒工作完成以后，針對檢測區(qū)域的善后處理消毒工作，不可輕視或大意。因為在檢測操作場地或區(qū)域，比較容易留下殘余，如果不能通過必要有效的消毒或殺毒，往往容易留下隱患或后患，一旦有非洲豬瘟病毒殘留，將會造成嚴(yán)重后果。

7 結(jié)語

應(yīng)用熒光PCR方法檢測非洲豬瘟病毒，是目前比較有效的一種檢測方法。因此，國家有關(guān)主管部門發(fā)布了針對非洲豬瘟病毒的檢測方法。應(yīng)用熒光PCR方法檢測非洲豬瘟病毒，它的最大優(yōu)勢是能體現(xiàn)檢測結(jié)果的正確性與準(zhǔn)確性。嚴(yán)格講，針對傳染性病毒的檢測，需求的就是檢測結(jié)果的正確性與準(zhǔn)確性。如果沒有檢測結(jié)果的正確性和準(zhǔn)確性，不但會貽誤非洲豬瘟的有效預(yù)防或控制，還會造成病毒的傳播或蔓延，造成的后果將難以想象。因此，只有檢測結(jié)果具有正確性或準(zhǔn)確性，才能根據(jù)檢測結(jié)果情況，采取針對性措施，遏制非洲豬瘟病毒泛濫。但這種檢測法，同樣有其一定弊端，即它最忌諱出現(xiàn)各種直接性或間接性污染現(xiàn)象，因其能嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。并且，它對檢測環(huán)境或條件要求較高，需要構(gòu)建專屬實驗檢測場所或?qū)嶒炇?，并需進(jìn)行各檢測區(qū)域間的嚴(yán)格隔離，其檢測成本比較高。盡管如此，還要應(yīng)用這種方法進(jìn)行檢測，只要能特別規(guī)避污染現(xiàn)象發(fā)生，僅有檢測成本的投入，相比非洲豬瘟病毒成本造成的損失，幾乎不成比例。