葛卉，宋文龍，劉興菊,，梁海永

(1 河北農業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000；2 河北省種質資源與森林保護重點實驗室，河北 保定 071000)

柳屬(Salix)植物種類多樣，在世界各地都有廣泛分布。全世界共有520余種，其中中國共有 257種[1]。柳屬植物多為灌木或喬木，不僅用途廣泛，而且具有長遠開發(fā)前景，在環(huán)境保護方面具有凈化空氣、防風固沙、保持水土、修復被污染的土壤和修復水域的作用，在生活中可應用于城市園林綠化、營造木材林，作為生物質能源、編織品原材料、動物飼料等[2]。枝條是木本植物的重要觀賞部位之一，尤其在冬季落葉后。目前，園林綠化常用的彩枝樹種枝條分為紅枝型和黃枝型，紅枝以紅瑞木、檉柳為主，黃枝型以金枝國槐、金絲垂柳為主[3]。柳樹枝條顏色的變異極為豐富，最常見的有綠色、黃綠色和灰色，其他常見的還有黃色、紅色、褐色等[4]。金枝黃花柳(Salixcapreavar.aurea)為自然變種，其枝條為金黃色，顏色亮麗，株型豐滿，經引種馴化后，可應用于綠化觀賞[2]。但是金枝黃花柳為雌株，種子飛散時會造成飛絮污染，金枝黃花柳半同胞家系存在廣泛的形態(tài)變異[5]。枝條顏色由隱形基因控制，通過親本雜交產生的子代回交會產生2種表現(xiàn)型，分別為金枝型與普通型，并產生雌雄株。

目前，對選育速生、耐鹽、抗寒和抗旱的柳樹已經有大量研究，但柳樹作為園林綠化重要樹種，在優(yōu)良觀賞性狀方面的研究還很少[6-8]。本研究通過對金枝黃花柳回交產生的金枝型子代與普通型子代枝條顏色進行對比，并與親本進行比較，研究其遺傳特點，通過高通量測序、通路富集和功能注釋，挖掘2種枝條的差異基因以及探討色素合成的過程，為柳屬育種親本選配及早期選擇指標篩選奠定理論基礎，并為探索柳屬回交子代苗木生長、枝條性狀遺傳變異規(guī)律及雜種優(yōu)勢提供了重要線索。尤其是北方冬季彩色樹種較少，無絮彩色柳樹的培育在一定程度上將改善北方園林綠化植物品種應用匱乏的現(xiàn)狀，具有非常廣闊的市場空間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自于河北農業(yè)大學林學苗圃，位于E 115°26′47″，N 38°49′37″。該地形為平地，土壤類型為沙土，株行距為40 cm×50 cm。2020年3月對雄株(金枝黃花柳為母本、白皮柳為父本雜交產生的子代)與金枝黃花柳進行回交，回交子代枝條產生2種極端表現(xiàn)型，即金枝型與普通型。

1.2 試驗方法

1.2.1 枝色測定(2021年5月) 選取2種回交子代枝條與親本枝條測定枝條顏色，為了減少誤差，均選擇枝條的向光面。在統(tǒng)一自然光下，將白紙作為背景進行拍攝，用Photoshop調節(jié)白平衡，利用Photoshop中的取色器查看并記錄調節(jié)白平衡后的枝條Lab值。L表示亮度，其值域為0～100，即從黑色到白色；a表示紅綠程度，其值域為-128～127，即洋紅到綠色的變化；b表示藍黃程度，其值域為-128～127，即從藍色到黃色[9]。

1.2.2 轉錄組測序(2020年8月) 取極端金枝型和極端普通型2種顏色枝條各30根，構建2個極端混池，將所選材料放入液氮罐內帶回林木遺傳育種實驗室轉移到-80 ℃超低溫冰箱內，等待送樣進行轉錄組測序。將各混樣組送至北京百邁客生物科技有限公司進行DNA文庫構建以及高通量測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 運用 Excel 2016、SPSS 23和Photoshop 2020軟件對測得的試驗結果進行數(shù)據(jù)分析并繪制出圖形，分析金枝與普通枝條間的差異情況。利用百邁克云平臺進行轉錄組數(shù)據(jù)及相關生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 金枝黃花柳雜交子代枝色比較

對枝條顏色進行定量分析，并做出色差圖，金枝型及普通型子代枝條色差圖，見圖1；母本及父本枝條色差分布，見圖2。

(a)金枝型

(a)母本

由圖1可知，在回交子代植株枝條中，金枝型金枝黃花柳回交子代枝條表現(xiàn)為黃色到橙色，不同單株之間存在枝條顏色差異；普通型金枝黃花柳回交子代枝條表現(xiàn)為墨綠色至棕色，不同單株之間存在明顯的枝條顏色差異。

由圖2可知，金枝黃花柳回交子代群體與其父母本相比，金枝型子代枝條顏色與母本相差不多，普通型相較于父本來說更偏向于棕色。顏色性狀屬于數(shù)量性狀遺傳，一般具有連續(xù)變異的特點，金枝黃花柳經過雜交產生的子代并不表現(xiàn)為金枝，而子代回交后，出現(xiàn)金枝型與普通型2種性狀，并且產生雌雄株[10-11]。

2.2 轉錄組測序分析

2.2.1 測序結果產出統(tǒng)計 基于高通量轉錄測序結果，對干凈數(shù)據(jù)、總堿基數(shù)、GC含量和質量值≥30的堿基所占的百分比進行統(tǒng)計。測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表，見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

由表1可知，運用高通量轉錄組測序技術，分別獲得6.30 Gb和5.95 Gb有效數(shù)據(jù)(Clean data)，試驗樣品中GC含量均超過45.12%，Q30堿基百分比均超過94.62%，可以用于進一步的轉錄組分析。

2.2.2 差異表達基因篩選 金枝與普通型枝條基因差異表達火山圖，見圖3。

圖3 金枝型與普通型枝條基因差異表達火山圖

由圖3可知，金枝黃花柳回交子代群體中金枝型枝條與普通型枝條相比，存在2 499個顯著差異表達基因，其中上調基因數(shù)量984個，占差異表達基因總數(shù)的39.38%；下調基因數(shù)量1 515個，占差異表達基因總數(shù)的60.62%，上調表達基因數(shù)量明顯少于下調表達基因數(shù)量。

2.2.3 差異表達基因 GO 功能富集分析 差異表達基因GO注釋分類統(tǒng)計圖，見圖4。

圖4 差異表達基因GO注釋分類統(tǒng)計圖

由圖4可知，通過GO數(shù)據(jù)庫注釋，共獲得1 416個差異表達基因，其中上調540個，下調876個，分別包括GO系統(tǒng)3個主要分支，即：生物學過程(1-21)，細胞組分(22-37)和分子功能(38-52)?；亟蛔哟鹬π团c普通型枝條在生物學過程的21個亞分組(代謝等)中，在代謝過程、細胞過程、單一生物過程中得到注釋的序列最多，僅有極少數(shù)注釋到節(jié)律過程。在構成細胞組分的16個亞分組(細胞器部分等)中，細胞、細胞部分注釋的差異表達基因最多，超分子復合物和細胞外區(qū)部分注釋到的序列最少。在分子功能的15個亞分組(催化活性等)中，回交子代金枝枝條與普通型枝條對催化活性、結合活性注釋到的基因序列多，在轉錄因子活性和蛋白質結合活性中序列少。

2.2.4 差異表達基因COG分類分析 利用COG數(shù)據(jù)庫對基因產物進行直系同源分類，差異表達基因 COG 功能富集分析見圖5。

圖5 差異表達基因 COG 功能富集分析

由圖5可知，樣品組之間差異表達基因COG分類統(tǒng)計結果顯示，通過COG功能富集分析，共注釋到750個差異基因在不同功能類中，其中上調277個，下調473個。在一般功能預測基因中，存在256個差異表達基因，其次是轉錄通路157個，信號轉導機制通路145個，復制、重組和修復通路130個，在翻譯后修飾、蛋白質周轉和伴侶，糖轉運和代謝，次級代謝物的生物合成、運輸和分解代謝，氨基酸轉運和代謝通路中也有較多富集。

2.2.5 差異表達基因KEGG通路富集分析 差異表達基因KEGG通路富集散點圖，圖中呈現(xiàn)了顯著性Q值最小的前20個通路，見圖6。

圖6 差異表達基因KEGG通路富集散點圖

由圖6可知，利用KEGG分析差異表達基因在某一通路上是否存在顯著差異，由KEGG 注釋到的差異基因數(shù)目為753個，其中上調323個，下調430個?；亟蛔哟?類枝條樣本在植物-病原體相互作用通路富集的基因數(shù)最多且顯著性明顯，在內質網蛋白質加工和酪氨酸代謝通路富集的基因數(shù)較多，在?；撬岷痛闻；撬岽x中也有一些差異表達基因。

基因的KEGG富集結果，見表2。

表2 基因的KEGG富集結果

由表2可知，回交子代2類枝條樣本在植物-病原體相互作用通路富集的基因數(shù)最多且顯著性明顯，為44個差異表達基因，占KEGG通路富集的10.38%，在內質網蛋白質加工和酪氨酸代謝通路富集的基因數(shù)較多，分別為33個和12個差異基因，在?；撬岷痛闻；撬岽x中也有一定顯著性，注釋到5個差異表達基因，在植物激素信號傳導、淀粉和蔗糖代謝、苯丙素合成、氨基酸和核苷酸糖代謝通路中也有較多基因富集，但差異不顯著。其余富集通路的差異基因比例為 0.94%～3.77%。

2.2.6 葉綠素合成與代謝途徑中相關差異表達基因 由于枝條中色素表達產生差異，金枝黃花柳回交子代群體枝條產生不同顏色，因此，對葉綠素合成與代謝途徑相關差異表達基因進行篩選。葉綠素合成與代謝相關通路注釋結果，見表3。

表3 葉綠素合成與代謝相關通路注釋結果

由表3可知，通過KEGG注釋分析通路，篩選出參與卟啉和葉綠素代謝通路(ko00860)的差異基因共有4個，分別是葉綠素/細菌葉綠素a合成酶、葉綠素酶、葉綠素/細菌葉綠素a還原酶和血紅素加氧酶。通過GO注釋分析，發(fā)現(xiàn)參與分子功能中原葉綠素內酯還原酶活性通路(GO:0016630)的差異基因有2個，分別是原葉綠素酸酯氧化還原酶B和原葉綠素酸酯氧化還原酶A。葉綠素合成與代謝相關通路差異基因表達情況，見表4。

表4 葉綠素合成與代謝相關通路差異基因表達情況

由表4可知，6種差異基因中有4個上調基因，2個下調基因。上調基因中，葉綠素/細菌葉綠素a還原酶差異基因表達量最多，有1 180個；其次是原葉綠素酸酯氧化還原酶B差異基因，有329個；血紅素加氧酶差異基因，有170個；葉綠素/細菌葉綠素a合成酶差異基因數(shù)量最少，有121個。下調基因中，葉綠素酶差異基因較多，有385個；原葉綠素酸酯氧化還原酶A差異基因數(shù)量較少，有193個。

2.2.7 卟啉與葉綠素代謝通路分析 綠色植物的葉綠素合成需要多種酶的參與，是一個非常復雜的過程。從谷氨酰-t RNA(Glu-t RNA)到合成葉綠素，由16種酶20多個基因編碼的完成[12]。此過程中任何一種基因表達發(fā)生差異，都有可能對葉綠素的合成產生影響。卟啉與葉綠素代謝通路，見圖7。

圖7 卟啉與葉綠素代謝通路

由圖7可知，與金枝型枝條相比，普通型枝條的葉綠素/細菌葉綠素a合成酶(2.5.1.133)與葉綠素/細菌葉綠素a還原酶(1.3.1.111)基因表達上調，因此，普通型細菌葉綠素a和細菌葉綠素b含量比金枝型多。葉綠素/細菌葉綠素a合成酶(2.5.1.62)基因表達上調，葉綠素酶(3.1.1.14)基因表達下調，二者共同通過反饋作用共同調節(jié)葉綠素a與葉綠素b的表達量。

3 討論與結論

3.1 討論

高通量轉錄組測序技術可以發(fā)掘植物潛在的功能基因、探索植物體內的生理調控機制、形態(tài)差異產生機制，發(fā)掘參與植物生長發(fā)育相關基因，以及抗病、抗逆等優(yōu)良性狀相關的基因，分析雜種優(yōu)勢的分子機理等，為進一步了解基因的作用機理打下基礎[13-18]。在關于柳屬樹種轉錄組測序技術應用中，鄭紀偉以垂柳和簸箕柳為研究材料，比較喬木柳與灌木柳轉錄本之間的差異，結果發(fā)現(xiàn)，利用喬木柳開發(fā)的引物在喬木柳不同種及種間的通用性更高，而利用灌木柳開發(fā)的引物在灌木柳不同種及雜種間的通用性更高[19]；劉菁菁以簸箕柳雌、雄花序為材料，通過高通量測序與生物信息分析，確定這2種花序中的差異基因和表達差異基因[13]。通過對金枝型與普通型2個樣品的轉錄組分析，發(fā)掘新基因1 705個，其中1 430個得到功能注釋?；诒葘Y果，進行基因表達量分析。根據(jù)基因在不同樣品中的表達量識別差異表達基因，并對其進行功能注釋和富集分析。

木本植物枝條的樹皮、射線薄壁組織、韌皮部、木質部甚至髓中都可發(fā)現(xiàn)葉綠體，尤其是幼嫩枝條中[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與葉綠素合成有關的卟啉，葉綠素代謝通路和原葉綠素酸脂還原酶活性通路中基因表達存在差異。卟啉環(huán)是葉綠素核心部分，葉綠素合成受多種酶催化和某些轉錄因子調控[21]。通過KEGG注釋通路分析，篩選出參與卟啉和葉綠素代謝通路(ko00860)的差異基因共有4個，其中葉綠素/細菌葉綠素a合成酶、葉綠素/細菌葉綠素a還原酶和血紅素加氧酶基因表達上調，葉綠素酶基因表達下調。在有光條件下，原葉綠素酸酯還原酶在植物顯綠過程中起重要作用[22]。葉綠素酸酯氧化還原酶的作用是在光照條件下，催化原葉綠素酸酯形成葉綠素酸酯。原葉綠素酸酯氧化還原酶A基因易受光照影響，在黃化組織中特異性表達，參與構成黃化質體中原片層體，而原葉綠素酸酯氧化還原酶B組成型表達在2種類型植物中并不受光照條件影響[23]。通過GO注釋通路分析，發(fā)現(xiàn)參與分子功能中原葉綠素內酯還原酶活性通路(GO:0016630)的差異基因有2個，其中原葉綠素酸酯氧化還原酶B基因表達上調，原葉綠素酸酯氧化還原酶A基因表達下調。

3.2 結論

本研究以金枝黃花柳回交子代及其親本為材料，發(fā)現(xiàn)子代枝條主要表現(xiàn)金枝和普通型2種類型。金枝型子代枝條表現(xiàn)為黃色到橙色，普通型回交子代枝條表現(xiàn)為墨綠色至棕色。通過回交，子代重新獲得具有與母本相似的金枝性狀，且產生雄株。未來可在園林綠化進行應用。

通過RNA轉錄組測定及分子生物學分析，對比不同表型金枝黃花柳回交子代相關基因表達譜的不同。結果顯示，枝條轉錄組共檢測到差異表達基因2 499個，其中上調基因984個，下調基因1 515個。功能注釋和富集分析發(fā)現(xiàn)，與色素合成有關的基因表達量存在差異，部分基因會影響代謝通路，進而影響枝條中葉綠素的含量，導致枝條顏色存在差異。通過差異表達基因通路發(fā)現(xiàn)，金枝型枝條細菌葉綠素含量低于普通型枝條，枝條呈現(xiàn)金黃色，與原葉綠素酸酯氧化還原酶A基因上調表達有關，對光照更敏感。葉綠素酸酯氧化還原酶通路中的葉綠素酸酯氧化還原酶A(porA)基因，在金枝型中發(fā)生特異性表達。