杜濛濛，金春燕，顧志萍

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，江蘇 泰州 225300)

早產(chǎn)是一類較為復(fù)雜的疾病，已成為全球性醫(yī)療問(wèn)題[1]。早產(chǎn)可導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)相關(guān)后遺癥，甚至死亡，增加產(chǎn)婦及早產(chǎn)兒罹患多種疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。早產(chǎn)發(fā)病率隨著地域、國(guó)家、種族等不同存在著差異，而葉酸代謝相關(guān)基因在不同地域、國(guó)家等也存在差異性[3-4]。葉酸是人體重要營(yíng)養(yǎng)素之一，孕婦攝入葉酸不足可導(dǎo)致新生兒出生缺陷，甚至可能造成流產(chǎn)或早產(chǎn)[5]。5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是人體葉酸代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵酶的其中一種類型。相關(guān)研究表明，MTHFR基因 C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性與胎兒神經(jīng)管疾病、孕婦流產(chǎn)等不良妊娠的發(fā)生有關(guān)[6-8]。但目前臨床上關(guān)于MTHFR基因 C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性與早產(chǎn)的關(guān)聯(lián)性研究鮮有報(bào)道?；诖?，本研究調(diào)查分析了孕婦MTHFR基因 C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性的分布情況，并分析其與孕婦早產(chǎn)的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年1月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬泰州人民醫(yī)院建立孕檢檔案并在孕早期做葉酸代謝關(guān)鍵基因篩查的221例孕婦為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單胎妊娠；(2)臨床生物化學(xué)檢查結(jié)果及肝功能正常；(3)臨床資料完整且隨訪至分娩者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有腫瘤及心臟病者；(2)有吸煙及酗酒史者；(3)有胎盤(pán)早剝及前置胎盤(pán)等疾病者。根據(jù)孕婦分娩結(jié)果將研究對(duì)象分為早產(chǎn)組(n=125)和正常分娩組(n=96)。

1.2 方法

1.2.1 資料收集從醫(yī)院病案管理系統(tǒng)收集研究對(duì)象一般資料，主要包括姓名、年齡、性別、文化程度、居住地、工作、家族史、孕次、妊娠高血壓綜合征、懷孕方式、孕前補(bǔ)充葉酸時(shí)間、孕期藥物應(yīng)用史、自然流產(chǎn)史、人工流產(chǎn)史、葉酸水平等。

1.2.2 基因檢測(cè)采集受試者靜脈血2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，應(yīng)用Veriti Dx96-Well Thermal Cycler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀以金磁微粒層析法檢測(cè)MTHFR基因C677T位點(diǎn)的基因多態(tài)性。具體方法：將擴(kuò)增液與反應(yīng)液混合制成2種PCR 預(yù)混合液，分別標(biāo)記為突變(muta tion，M)型和野生型(wild type，WT)，然后將預(yù)混合液分裝，每管45 μL。然后，制作樣本稀釋液，取全血樣本混勻，以12吸取全血及樣本稀釋液混勻，反應(yīng)2 min后待血液呈現(xiàn)暗紅色時(shí)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。在分裝的預(yù)混合液中分別加入待測(cè)血液樣本，陰性對(duì)照液、陽(yáng)性對(duì)照液各5 μL，蓋緊管蓋后混勻。最后將PCR管置于PCR儀進(jìn)行50 ℃ 2 min、95 ℃ 3 min 30 s、94 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s、65 ℃ 30 s反應(yīng)，共33個(gè)循環(huán)；65 ℃ 10 min；4 ℃保持。然后將PCR產(chǎn)物滴加至檢測(cè)卡上的M孔和WT孔，2～5 min 內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判讀。根據(jù)檢測(cè)線(T線)有無(wú)出現(xiàn)條帶來(lái)判讀C677T位點(diǎn)的基因型：M管產(chǎn)物在T線處不出現(xiàn)條帶而WT管產(chǎn)物出現(xiàn)條帶為CC型，M型管產(chǎn)物在T線處出現(xiàn)條帶而WT管產(chǎn)物不出現(xiàn)條帶為T(mén)T型，2個(gè)管產(chǎn)物均在試紙條T線處出現(xiàn)條帶為CT型。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡分析所有研究對(duì)象的MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性符合遺傳平衡(P>0.05)，說(shuō)明納入人群處于遺傳平衡狀態(tài)，樣本具有群體代表性。

2.2 2組受試者一般資料比較結(jié)果見(jiàn)表1。早產(chǎn)組與正常分娩組受試者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)、文化程度、孕前3個(gè)月配偶是否吸煙、孕前3個(gè)月配偶是否酗酒、家庭經(jīng)濟(jì)情況、工作、孕次、自然流產(chǎn)史及人工流產(chǎn)史等情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 早產(chǎn)組受試者中居住在鄉(xiāng)村、有妊娠高血壓綜合征、通過(guò)人工輔助生殖技術(shù)懷孕、孕前補(bǔ)充葉酸時(shí)間為1個(gè)月及有孕期服藥史者所占比例顯著高于正常分娩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；早產(chǎn)組受試者的葉酸水平顯著低于正常分娩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 早產(chǎn)組與正常分娩組受試者一般資料比較

2.3 早產(chǎn)組與正常分娩組受試者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型比較結(jié)果見(jiàn)表2。早產(chǎn)組與正常分娩組受試者M(jìn)THFR基因C677T位點(diǎn)基因型和等位基因的分布頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 早產(chǎn)組與正常分娩組受試者基因型比較

2.4 MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與早產(chǎn)的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表3。多因素logistic回歸分析結(jié)果顯示，MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC基因型及等位基因T分布頻率是孕婦發(fā)生早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。MTHFR基因C677T位點(diǎn)CT、TT基因型和等位基因C分布頻率與孕婦發(fā)生早產(chǎn)無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表3 MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與早產(chǎn)的關(guān)系

3 討論

目前，早產(chǎn)遺傳學(xué)相關(guān)研究主要集中于研究相關(guān)基因分型與血清生物化學(xué)指標(biāo)或環(huán)境因素的相互作用[9]。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，目前與早產(chǎn)相關(guān)的基因包括凝血相關(guān)基因、葉酸代謝相關(guān)基因及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因。葉酸直接或間接參與人體多種生物化學(xué)代謝反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，葉酸相關(guān)基因多態(tài)性參與心血管疾病、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及唐氏綜合征等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展[10-11]。

MTHFR基因作為葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，其在同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)轉(zhuǎn)為蛋氨酸及DNA合成的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。在圍孕期補(bǔ)充葉酸是目前全球性的公共衛(wèi)生干預(yù)方案，可有效預(yù)防神經(jīng)管缺陷等疾病。但流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充葉酸的效果在不同人群中存在差異[13]。有研究顯示，MTHFR基因C677T位點(diǎn)等位基因在不同地區(qū)分布頻率不同，如在河南、廣西和海南地區(qū)的分布頻率分別為62.1%、39.1%、26.2%[14-15]，整體上看由北到南表現(xiàn)為遞減趨勢(shì)，存在明顯的地域差異性，提示不同的遺傳特征對(duì)葉酸補(bǔ)充效果有較大影響。王連等[16]研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)孕婦的血清葉酸水平顯著低于正常分娩者。本研究中早產(chǎn)組孕婦葉酸水平低于正常分娩組，與王連等[16]研究報(bào)道一致，提示葉酸可能參與了早產(chǎn)的發(fā)生，推測(cè)其原因可能為孕婦體內(nèi)葉酸缺乏或者出現(xiàn)代謝障礙時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體血漿中HCY水平升高，機(jī)體出現(xiàn)生物化學(xué)功能異常，最終導(dǎo)致早產(chǎn)。

隨著單核苷酸多態(tài)性的相關(guān)研究技術(shù)的快速發(fā)展，醫(yī)學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)葉酸代謝關(guān)鍵基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生關(guān)系密切。ZHANG等[17]分別檢測(cè)了82例自然流產(chǎn)者和82例正常分娩者的MTHFR基因多態(tài)性及血清HCY水平，結(jié)果顯示，自然流產(chǎn)者血清HCY水平高于正常分娩者；該研究還發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變是孕婦自然流產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。MTHFR基因多態(tài)性可使相關(guān)酶活性降低，HCY水平升高，機(jī)體出現(xiàn)血液高凝狀態(tài)或形成血栓，進(jìn)而導(dǎo)致絨毛間細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，引起胎兒血管灌注不良及胎盤(pán)炎癥等[18]。胎盤(pán)血液循環(huán)受阻，可間接影響胎兒發(fā)育及分娩，可能導(dǎo)致早產(chǎn)。本研究比較了早產(chǎn)孕婦與正常分娩孕婦的MTHFR基因位點(diǎn)的基因型及等位基因的分布頻率，結(jié)果顯示，早產(chǎn)組孕婦MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型及等位基因分布頻率與正常分娩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性可能參與早產(chǎn)的發(fā)生。為進(jìn)一步研究葉酸代謝關(guān)鍵基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)早產(chǎn)的影響，本研究將有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因型及等位基因進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC基因型及等位基因T的分布頻率是孕婦發(fā)生早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步證實(shí)了葉酸代謝關(guān)鍵基因位點(diǎn)多態(tài)性與早產(chǎn)有關(guān)。

綜上所述，孕婦葉酸代謝關(guān)鍵基因多態(tài)性與早產(chǎn)具有一定關(guān)聯(lián)性，其中MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC基因型及等位基因T的分布頻率是孕婦發(fā)生早產(chǎn)的危險(xiǎn)因素。因此，建議MTHFR基因C677T位點(diǎn)CC基因型及T等位基因婦女，在備孕期間及妊娠結(jié)束前都要補(bǔ)充足夠的葉酸，以減少因葉酸代謝問(wèn)題導(dǎo)致的早產(chǎn)發(fā)生。