趙 佳，尚文會，田召兵，高慶娥，田秀俊

(1.西安市中心醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710003；2.淄博市傳染病醫(yī)院檢驗科，山東 淄博 255067)

肝癌是世界上第六大流行和第三大致死癌癥，每年造成約80萬人死亡[1-2]。在引起肝癌的風(fēng)險因素中，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染發(fā)揮著主要作用，全球超過50%的肝癌患者感染了HBV[3-4]。HBV有多種亞型，在我國以B、C亞型最常見。HBV介導(dǎo)肝癌的發(fā)病機制主要為HBV基因組整合到宿主細胞基因組中引起基因組不穩(wěn)定和插入突變，且HBV基因產(chǎn)物具有致癌活性[5-6]。靶向HBV誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生機制是非常有前景的治療策略，可以發(fā)現(xiàn)潛在的肝癌預(yù)防和治療的生物標志物和靶點。因此，對于HBV病毒的篩查、診斷和監(jiān)測具有重要的臨床意義[7]。

目前，除了檢測HBV血清學(xué)標志物外，基于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)技術(shù)檢測HBV DNA已廣泛應(yīng)用于臨床[8]。目前，市場上有多種商品化HBV DNA超敏定量試劑盒已獲國家藥品監(jiān)督管理局批準。由于臨床上定量檢測患者血清中HBV DNA時使用的試劑盒存在差異，且可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異?；诖?，本研究對同一肝癌患者使用不同商品化試劑盒定量檢測血清樣本中HBV DNA，并通過全基因組二代測序技術(shù)分析導(dǎo)致檢測結(jié)果差異的潛在原因，以期為HBV感染的臨床診斷提供檢測方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年10月2日淄博市傳染病醫(yī)院收治的1例肝癌患者為研究對象。該例患者經(jīng)臨床診斷為HCC 3b期[4]。2020年9月17日患者的相關(guān)臨床血清及生物化學(xué)檢測數(shù)據(jù)顯示，患者乙型肝炎表面抗體HBsAg、HBeAb、HBcAb均呈陽性，且肝功能指標(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、甲胎蛋白)也異常升高，提示患者HBV 感染陽性，且肝功能受損。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準。

1.2 試劑與儀器HBV DNA定量試劑盒分別購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司(文中簡稱為羅氏)和西安天隆科技有限公司(文中簡稱為天隆)。核酸提取儀器購自西安天隆科技有限公司，聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司?；鬯汜t(yī)療科技(上海)有限公司Illumina測序平臺提供二代測序服務(wù)。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA定量檢測2020年8月25日抽取HCC患者靜脈血10 mL，3 000 r·min-1離心5 min，取上清。分別使用羅氏和天隆公司的 HBV DNA定量試劑盒于2020年8月27日、2020年9月10日、2020年9月17日、2020年11月19日對肝癌患者血清樣本進行4次HBV載量檢測，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。HBV載量<1×104IU·L-1表示HBV感染陰性。

1.3.2 二代測序取患者3 mL血清，由慧算醫(yī)療科技(上海)有限公司進行二代測序。以文獻[9]中的HBV亞型(9種B型及15種C型)為參考建立一條通用參考序列。取肝癌患者基因組中HBV開放閱讀框Precore/core區(qū)序列與通用參考序列比對，尋找差異區(qū)域。如二者序列比對后完全一致，則無突變；如二者序列比對發(fā)現(xiàn)有位點堿基不一致，則發(fā)生突變。應(yīng)用MiSeqRepoter軟件對二代測序結(jié)果進行分析，尋找患者染色體中嵌合的HBV基因組序列，并定位到具體染色體上。

2 結(jié)果

2.1 2種HBV DNA定量試劑盒檢測患者血清中HBV載量比較結(jié)果見表1。羅氏HBV DNA定量試劑盒4次檢測結(jié)果均為HBV感染陰性，天隆HBV DNA定量試劑盒4次檢測HBV載量均>1×104IU·L-1，均為HBV感染陽性。

表1 2 種HBV DNA定量試劑盒檢測肝癌患者血清中HBV載量比較

2.2 二代測序結(jié)果二代測序結(jié)果顯示，患者基因組中含有人DNA讀長36 417 246 bp(99%)、病毒DNA讀長509 617 bp(1%)。509 617 bp病毒DNA讀長中498 064 bp(98%)為HBV DNA。與通用序列比對結(jié)果顯示，HCC患者基因組中HBV Precore/core區(qū)序列中未發(fā)現(xiàn)突變位點，患者基因組中HBV Precore/core區(qū)中P區(qū) 1 700～2 140 bp區(qū)間缺失(圖1)。二代測序結(jié)果分析顯示，患者多條染色體上整合了HBV基因組，其中5號染色體上HBV基因組讀長3 136 bp，1號染色體上HBV基因組讀長2 274 bp，10號染色體上HBV基因組讀長51 bp，6號染色體上HBV基因組讀長47 bp。

綠線：HBV基因組開放閱讀框；灰線：通用序列；深藍色曲線：正向測序每個區(qū)域讀長數(shù)；淺藍色曲線：反向測序每個區(qū)域的讀長數(shù)。

3 討論

二代測序技術(shù)突破了Sanger測序的局限，對于樣本中的每對堿基可以達到10 000次以上的覆蓋[9]。因此，在病毒相關(guān)研究方面極大地提高了檢測低頻率變異位點的敏感度。此外，隨著計算機技術(shù)和統(tǒng)計學(xué)方法的發(fā)展，研究者能夠更精準地了解病毒的組成結(jié)構(gòu)和多樣性?；诖耍狙芯繌母伟┗颊哐鍢颖咎崛NA進行二代測序以探究導(dǎo)致不同商品化試劑盒定量檢測HBV DNA結(jié)果差異的原因。

本研究結(jié)果顯示，羅氏HBV DNA定量試劑盒4次檢測結(jié)果均為HBV感染陰性，天隆HBV DNA定量試劑盒4次檢測結(jié)果均為HBV感染陽性，檢測結(jié)果存在較大差異，故對患者血清進行二代測序以探究差異潛在的原因。本研究將肝癌患者基因組中HBV Precore/core區(qū)序列與通用序列比對結(jié)果顯示，并未發(fā)現(xiàn)突變位點；患者基因組中HBV Precore/core區(qū)中P區(qū) 1 700～2 140 bp區(qū)間缺失，進一步分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)域正是羅氏試劑盒檢測的靶標位點，因此，導(dǎo)致羅氏試劑盒無法檢測到HBV感染。

有研究發(fā)現(xiàn)，HBV DNA整合主要發(fā)生在病毒感染早期，為隨機整合，但有相對熱點的染色體，且整合發(fā)生頻率很高，在HBV感染相關(guān)的肝癌患者中，85%～90%患者染色體發(fā)生了HBV DNA整合[10]。有研究表明，HBV可以通過DNA整合來影響整合位點周圍基因功能，破壞或促進對細胞生長和分化至關(guān)重要基因的表達，從而促進肝細胞惡性轉(zhuǎn)化[11]。本研究對HBV DNA基因整合到人染色體的嵌合位點進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者多條染色體上整合了HBV基因組，其中5號染色體上HBV基因組讀長3 136 bp，1號染色體上讀長2 274 bp，10號染色體上讀長51 bp，6號染色體上讀長47 bp。

此外，本研究二代測序結(jié)果顯示，患者基因組中含有病毒DNA讀長509 617 bp(1%)，509 617 bp病毒DNA中498 064 bp(98%)為HBV DNA。這說明，本研究納入的肝癌患者染色體上整合了HBV基因，推測HBV感染時基因組整合到宿主染色體上可能是患者血清中的HBV基因組P區(qū)序列缺失的原因，但仍有待進一步闡明。另外，對于測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有HBV病毒存在，并不等同于有活性的HBV病毒顆粒，還需要對測序結(jié)果進行更加深入細致的分析。

綜上所述，不同商品化HBV DNA定量試劑盒檢測結(jié)果存在差異，可能是HBV感染時基因組整合到宿主染色體上導(dǎo)致的序列缺失，因此，在使用不同的檢測試劑盒進行臨床診斷時務(wù)必慎重。