王 璧，王戰(zhàn)會，韓保衛(wèi)，鄭秋霞，孫宗斌，蔡萌萌，段廷賀

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院肝膽外科，河南 洛陽 471009；3.河南省第二兒童醫(yī)院胃腸外科，河南 洛陽 471009；4.蘭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，甘肅 蘭州 730000)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，每年造成約71.5萬人死亡，是癌癥死亡的第2大病因[1-3]。近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸上升，且有年輕化趨勢[4]。由于結(jié)直腸癌早期缺乏典型的臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，且目前結(jié)直腸癌的診斷尚缺乏特異性強、靈敏度高的檢測指標，因此，如何更好地實現(xiàn)早篩查、早診斷，對結(jié)直腸癌具有非常重要的意義。有研究指出，結(jié)直腸癌相關(guān)因子檢測及癌前篩查對該疾病的診斷、個體化治療及預(yù)后判斷意義重大[5]。因此，結(jié)直腸癌的分子標志物成為國內(nèi)外研究的熱點。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(Runt-related transcription factor 3,RUNX3)是新近發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，其在胃癌、肺癌、肝癌等多種消化道惡性腫瘤組織中呈低表達，且與患者的預(yù)后有關(guān)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3不僅參與細胞的增殖、生長和凋亡，還參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RUNX3作為重要的轉(zhuǎn)錄因子能夠促進轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路的激活和Wnt信號通路的抑制，而這些通路的異常轉(zhuǎn)導(dǎo)在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7-8]，提示RUNX3可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中也起到一定作用。目前，關(guān)于RUNX3在結(jié)直腸癌中的作用機制尚未完全明確。本研究對結(jié)直腸癌組織中的RUNX3表達水平進行分析，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床尋找結(jié)直腸癌標志物提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017年2月至2020年6月鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院胃腸外科收治的100例結(jié)直腸癌患者為研究對象。病例納入標準：(1)經(jīng)影像學(xué)、腸鏡及術(shù)后病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性結(jié)直腸癌；(2)患者術(shù)前均未接受過新輔助化學(xué)治療、放射治療及免疫治療。排除標準：(1)既往患有其他惡性腫瘤者；(2)合并機體臟器嚴重衰竭者；(3)術(shù)前已行化學(xué)治療、放射治療及免疫治療者；(4)臨床資料不完善者。100例患者中，男52例，女48例；年齡42～79(64.33±12.31)歲，其中≥60歲61例，<60歲 39例；腫瘤部位：結(jié)腸48例，直腸52例；腫瘤直徑：≥5 cm 43例，<5 cm 57例；分化程度：高分化18例，中分化52例，低分化30例；病理分型：潰瘍型66例，隆起型23例，浸潤型11例；浸潤深度：cT18例，cT230例，cT325例，cT437例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：N061例，N139例；遠處轉(zhuǎn)移：M081例，M119例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期29例，Ⅲ期26例，Ⅳ期16例。所有患者術(shù)中留取結(jié)直腸癌組織及距離癌組織邊緣5 cm以上的癌旁組織標本，將每例標本均分為2份，其中1份制備石蠟標本，另1份快速保存于-80 ℃冰箱備用。本研究采用查閱電子病歷、患者隨訪系統(tǒng)或電話等方法對所有患者進行隨訪，隨訪截止日期為2020年10月，生存期的計算為從患者手術(shù)日期到隨訪截止日期或死亡日期。本研究通過鄭州大學(xué)附屬洛陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準，所有患者及家屬簽署知情同意書。

1.2 細胞、主要試劑與儀器人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460及結(jié)腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，RUNX3一抗購自武漢博士德生物工程有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗、辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)標記的羊抗兔二抗、二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，內(nèi)源性過氧化物酶阻滯劑購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒、放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白的表達取患者術(shù)中切除的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織(距離癌組織邊緣>5 cm以上)固定后制作的石蠟標本，層厚5 μm連續(xù)切片，80 ℃恒溫箱中烤片2 h，將切片置于二甲苯中脫蠟，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數(shù)95%乙醇、體積分數(shù)75%乙醇)脫去二甲苯并水化，將切片浸泡于枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液中進行抗原修復(fù)，自然冷卻后使用PBS沖洗，切片；每張切片滴加50 μL過氧化物酶阻滯劑，室溫孵育10 min,然后用PBS沖洗；用體積分數(shù)5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，傾去血清；滴加50 μL RUNX3一抗(稀釋倍數(shù)1100)，室溫孵育1 h，PBS沖洗3次，每次2 min；加入羊抗兔單克隆抗體IgG作為二抗(稀釋倍數(shù)150)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，遞減梯度乙醇(無水乙醇、體積分數(shù)95%乙醇、體積分數(shù)75%乙醇)脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。細胞核中出現(xiàn)淺黃色、棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為RUNX3陽性表達細胞，隨機選取5個高倍鏡視野，觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù)占同類細胞總數(shù)的百分比。參照KARPATHIOU等[9]和沈曉健等[10]的方法，根據(jù)染色強度及陽性細胞所占比例進行半定量評分：(1)陽性細胞所占比例為0%～25%計為1分，26%～75%計為2分，76%～100%計為3分；(2)無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(3)2項評分的乘積為每張切片的組織染色最終評分，二者相乘共分為0～9分，0～4分為低表達，5～9分為高表達。分別計數(shù)結(jié)直腸癌組織和癌旁組織標本中RUNX3蛋白高表達及低表達的例數(shù)，計算RUNX3蛋白高表達率和低表達率，高表達率=RUNX3蛋白高表達例數(shù)/總例數(shù)×100%，低表達率=RUNX3蛋白低表達例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460、結(jié)腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量將蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑分別按150比例加入蛋白裂解液中混勻，配置蛋白裂解混合液。取1 cm×1 cm×1 cm的結(jié)直腸癌組織樣本及癌旁組織樣本，研磨均勻后分別置于EP管中；另分別取人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460、結(jié)直腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞2×106個，置于相應(yīng)的EP管；各EP管做好標記，分別加入500 μL蛋白裂解混合液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液。根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書，在96孔板中設(shè)置標準孔和待測樣本孔，標準孔設(shè)置為8個標準品濃度，即于8個標準孔中分別加入相應(yīng)量的標準品試劑，然后以PBS將其補足為20 μL的終體積，使其標準品終質(zhì)量濃度分別為0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40、0.50 mg·μL-1；另取裂解后的結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460、結(jié)腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞上清液各20 μL，分別加入相應(yīng)的待測樣本孔中；最后向標準孔及各待測樣本孔中分別加入200 μL工作液，震蕩20 s混勻，覆膜后置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，然后用全波長多功能酶標儀在波長562 nm處測定各孔樣本的吸光度(A)值，并建立坐標軸，根據(jù)標準曲線計算出各樣本的實際蛋白濃度；將所有樣本取相同質(zhì)量并移入新的離心管中，并以PBS補足至相同體積，加入1/4樣本體積的loading buffer，充分混勻后置于金屬浴中100 ℃加熱變性10 min；每個泳道裝載20 μg變性蛋白，選擇80 V恒壓進行電泳約20 min,然后更換至 100 V恒壓電泳約1 h；蛋白分離后經(jīng)濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上；用洗膜液洗膜2次，每次10 min,然后將膜置于高效封閉液中室溫搖床震動下孵育15 min；分別將膜放置于配置好的目的蛋白RUNX3一抗溶液(稀釋倍數(shù)11 000)及內(nèi)參蛋白GAPDH溶液(稀釋倍數(shù)11 000)中4 ℃搖床震動下孵育過夜；再次洗膜后將膜置于配置好的二抗溶液(稀釋倍數(shù)11 000)中室溫搖床震動下孵育 2 h；在避光容器中配置增強化學(xué)發(fā)光顯色液，而后將其覆蓋于膜表面，放置1 min后在全自動凝膠成像系統(tǒng)中觀察、采集圖片，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶的灰度值，計算結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及人正常結(jié)腸上皮細胞NCM460和結(jié)腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞中目的蛋白RUNX3的相對表達量，RUNX3相對表達量以目的蛋白RUNX3灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示。實驗重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中RUNX3蛋白表達率比較結(jié)果見表1和圖1。結(jié)直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率為35.0%(35/100)，癌旁組織中RUNX3高表達率為74.0%(74/100)；結(jié)直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=30.670，P<0.05)。

表1 結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白表達率比較

A:癌旁組織；B:結(jié)直腸癌組織。

2.2 結(jié)直腸癌組織和結(jié)腸癌細胞系中RUNX3蛋白相對表達量比較結(jié)果見圖2和圖3。結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中RUNX3蛋白相對表達量分別為0.52±0.28、0.99±0.17；結(jié)直腸癌組織中RUNX3蛋白相對表達量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.904,P<0.05)。結(jié)腸癌細胞系HCT-116、SW-480細胞和正常結(jié)腸上皮細胞NCM460中RUNX3蛋白相對表達量分別為0.58±0.05、0.62±0.09、1.05±0.01，結(jié)腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量均顯著低于正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-14.738、-8.082,P<0.05)；結(jié)腸癌細胞系HCT-116與SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.554,P>0.05)。

A:癌旁組織；B:結(jié)直腸癌組織。

A:結(jié)腸癌細胞系HCT-116細胞；B：結(jié)腸癌細胞系SW-480細胞；C：正常結(jié)腸上皮細胞NCM460。

2.3 結(jié)直腸癌組織中RUNX3表達與患者臨床病理特征的關(guān)系結(jié)果見表2。結(jié)直腸癌組織中RUNX3表達水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤TNM分期有關(guān)(P<0.05)，與患者的性別、年齡、腫瘤直徑、位置、大體分型、浸潤深度及分化程度無關(guān)(P>0.05)。

2.4 結(jié)直腸癌組織中RUNX3表達水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系結(jié)果見圖4。Kaplan-Meier生存分析顯示，結(jié)直腸癌組織中RUNX3低表達患者生存率為60.0%(39/65)，高表達患者生存率為71.4%(25/35)；高表達患者生存率顯著高于低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.413，P<0.05)。

表2 結(jié)直腸癌組織中RUNX3表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖4 結(jié)直腸癌組織中RUNX3高表達和低表達患者的生存曲線

2.5 結(jié)直腸癌患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析結(jié)果見表3。單因素Cox回歸分析顯示，腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期及RUNX3表達水平與患者生存顯著相關(guān)(P<0.05)，而患者性別、年齡、腫瘤位置、直徑、大體分型、分化程度與結(jié)直腸癌患者生存無顯著相關(guān)性(P>0.05)。

表3 結(jié)直腸癌患者生存影響因素的單因素Cox回歸分析

2.6 結(jié)直腸癌患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果見表4。將單因素Cox回歸中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素進一步行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，有無遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期及RUNX3表達水平是影響患者生存的獨立危險因素(P<0.05)。

表4 結(jié)直腸癌患者生存影響因素的多因素Cox回歸分析

3 討論

結(jié)直腸癌作為惡性程度較高的消化道腫瘤，侵襲能力較強，易出現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者預(yù)后不良，嚴重威脅著患者的生命健康[11]。盡管目前結(jié)直腸癌發(fā)病機制尚未完全闡明，但分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因的遺傳多態(tài)性在結(jié)直腸癌易感性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12-13]；因此，將抑癌基因或癌基因作為治療的靶點是目前結(jié)直腸癌研究的熱點之一[14]。

RUNX3基因是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，又稱急性髓性白血病因子2(acute myeloid leukemia 2,AML2)基因，其位于人染色體1號短臂1p36.1和鼠4號染色體上，含6個外顯子和1 290 bp的開放閱讀框，總長約67 kb，其中啟動子p2可控制基因的轉(zhuǎn)錄，對細胞的生長發(fā)育、凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，RUNX3參與多種惡性腫瘤細胞的生長發(fā)育、增殖、凋亡及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[15]，其中以TGF-β和Wnt信號傳導(dǎo)通路為主。RUNX3參與介導(dǎo)TGF-β由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核，促使TGF-β與核內(nèi)靶蛋白相結(jié)合，調(diào)節(jié)靶點基因轉(zhuǎn)錄，同時與TGF-β傳導(dǎo)通路下游因子相互協(xié)同，增強TGF-β抑制細胞增長的能力；RUNX3還可以與Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵效應(yīng)器T細胞因子4和β-連環(huán)蛋白形成復(fù)合物，從而抑制T細胞因子4/β-連環(huán)蛋白復(fù)合物與靶標DNA的結(jié)合，減弱目的基因的轉(zhuǎn)錄，抑制該通路的致癌作用。RUNX3異常表達導(dǎo)致TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路紊亂，細胞抗凋亡能力增強，從而引發(fā)包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生[16-17]。

RUNX3雖表達廣泛，但被認為與胃腸道發(fā)育相關(guān)，以RUNX3為靶點的研究能夠進一步理解結(jié)直腸癌的發(fā)病機制。RUNX3異常表達不僅與胃腺癌癌前病變及胃腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后相關(guān)，而且參與肺癌、膀胱癌、胰腺癌等惡性腫瘤形成。而RUNX3與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及臨床預(yù)后的相關(guān)性尚未完全闡明?；诖?，本研究通過免疫組織化學(xué)染色法檢測結(jié)直腸癌患者癌組織及癌旁組織中RUNX3蛋白的表達水平，并通過蛋白免疫印跡法檢測結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常結(jié)直腸上皮細胞NCM460、結(jié)腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織中RUNX3蛋白高表達率顯著低于癌旁組織；結(jié)直腸癌組織中RUNX3蛋白的相對表達量顯著低于癌旁組織，結(jié)腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白的相對表達量均顯著低于正常結(jié)腸上皮細胞NCM460，而結(jié)腸癌細胞系HCT-116和SW-480細胞中RUNX3蛋白相對表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。賈光輝[18]、孫光源等[19]通過蛋白免疫印跡法檢測RUNX3蛋白在66對配伍的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RUNX3在結(jié)直腸癌組織中的表達較癌旁組織顯著下調(diào)。另有研究表明，大腸癌中的RUNX3表達量較正常黏膜組織顯著降低，且RUNX3在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和低分化組中的表達水平顯著低于未轉(zhuǎn)移組和中高分化組。上述研究與本研究結(jié)果一致，即結(jié)直腸癌組織中RUNX3高表達率顯著低于癌旁組織，結(jié)直腸癌細胞中RUNX3的表達水平顯著低于正常腸上皮細胞，這提示RUNX3基因的沉默、失活可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

目前，圍繞RUNX3基因表達下調(diào)的相關(guān)分子機制，有研究指出，RUNX3基因表達下調(diào)與該基因啟動子區(qū)域甲基化密切相關(guān)[20]，而RUNX3基因表達下調(diào)會導(dǎo)致TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制，造成細胞凋亡失控，引發(fā)癌變可能。袁澤龍等[21]在關(guān)于zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)和RUNX3在進展期直腸癌新輔助化學(xué)治療敏感性關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，與直腸癌旁組織相比，RUNX3蛋白在癌組織中表達顯著下調(diào)，可能與 EZH2通過誘導(dǎo)H3組蛋白的第27位賴氨酸發(fā)生甲基化而沉默RUNX3蛋白表達有關(guān)，其通過多因素logistic回歸法分析發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白表達差異也是影響新輔助化學(xué)治療療效的影響因素之一，即RUNX3蛋白表達越低，療效越差。LI[22]研究顯示，RUNX3基因在結(jié)直腸癌組織中顯著下調(diào)，并且與結(jié)直腸癌的分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)，RUNX3在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期患者的癌組織中表達水平高于Ⅲ、Ⅳ期患者，提示低表達RUNX3患者往往預(yù)后不良。因此，為進一步探究RUNX3表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，本研究根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果對結(jié)直腸癌患者RUNX3表達水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性進行統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RUNX3蛋白表達與患者是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，這進一步提示，RUNX3可能作為一種抑癌基因抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展， RUNX3表達水平可反映結(jié)直腸癌患者的惡性程度，其可作為判斷結(jié)直腸癌預(yù)后的一個指標。

本研究Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，RUNX3高表達患者的生存率顯著高于低表達患者，提示RUNX3低表達可能不利于患者生存。同時，本研究通過COX模型單因素及多因素分析顯示，腫瘤的 TNM分期及RUNX3表達水平是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。以上結(jié)果提示，RUNX3與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、不良預(yù)后具有高度相關(guān)性，可作為判定患者預(yù)后的潛在指標。

綜上所述，RUNX3在結(jié)直腸癌組織中呈低表達，且與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后有高度相關(guān)性，其可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，但具體的調(diào)控機制尚待進一步研究。