黃亞蘭，賴柏安，楊 玲，張薇珊，羅 婷

(遂寧市中心醫(yī)院病理科，四川 遂寧 629000)

胰腺導管腺癌是一種消化道腫瘤,惡性程度較高,診斷和治療難度大[1]，患病早期可能出現(xiàn)慢性胃炎、復發(fā)性胰腺炎的癥狀。此外，由于胰腺癌壓迫膽管,還可能導致黃疸癥狀的出現(xiàn),同時也可能出現(xiàn)糖尿病、腹瀉等良性疾病的癥狀[2]。胰腺導管腺癌是胰腺癌的主要類型,約占胰腺癌的80%～90%[3]。胰腺導管腺癌具有極高的侵襲性和轉移能力,由于胰腺癌缺乏早期診斷標志物,確診時多已發(fā)生局部浸潤和遠處轉移,導致放射治療和化學治療效果不理想,治療后患者的中位生存期小于6個月,即使接受胰腺癌手術的患者， 5 a生存率仍低于20%[4]。因此，深入探討胰腺導管腺癌的發(fā)病機制,為該病提供可行性診斷和治療靶點是目前急需要解決的問題。微RNA(microRNA，miRNA)具有發(fā)夾結構,能夠降解信使RNA(messenger RNA，mRNA)或抑制mRNA的翻譯,進而調控靶基因的表達[5]。有研究發(fā)現(xiàn),miR-342-3p在鼻咽癌、肝細胞癌等多種腫瘤中呈低表達,具有促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞侵襲的生物學行為,可以作為預測腫瘤預后的獨立因子[6]。末端尿苷酰轉移酶1 (terminal uridylyl transferase 1,TUT1)可對特定的miRNA進行尿苷化,并間接控制其穩(wěn)定性和miRNA的表達[7]。凝血酶敏感素-2(thrombospondin-2,THBS2)是血小板反應蛋白家族中的成員之一,具有多個結構域的鈣離子相關性糖蛋白[8]。有研究發(fā)現(xiàn),THBS2具有調節(jié)組織創(chuàng)傷后重塑和抗血管生成的作用[9],與腫瘤的關系密切。目前，尚未見關于miR-342-3p在胰腺導管腺癌組織中表達情況及調控TUT1、THBS2基因對胰腺導管腺癌細胞生物學行為的影響的相關報道?；诖?，本研究探討miR-342-3p/TUT1/THBS2通路在胰腺導管腺癌中的作用及機制，以期為胰腺癌的診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織來源選擇2008年5月至2021年3月在遂寧市中心醫(yī)院行根治性手術切除的胰腺導管腺癌標本(n=80)和對應癌旁正常組織標本(n=20)為研究對象。病例納入標準:(1)經病理學檢查確診為胰腺導管腺癌患者；(2)術前均未接受過放射治療、化學治療和靶向分子治療；(3)臨床資料完整;(4)原發(fā)胰腺導管腺癌；(5)患者知情同意并簽訂知情同意書。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并或并發(fā)影響本研究結果的疾病者。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 細胞、試劑與儀器人胰腺導管腺癌細胞株PANC-1購自中國科學院上海細胞庫;二辛可寧酸蛋白質定量試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司，聚偏氟乙烯膜和達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)購自上海碧云天生物技術有限公司，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳配膠試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司,TUT1和THBS2一抗購自美國Millipore公司,miR-342-3p mimic和miR-342-3p inhibitor由上海吉瑪制藥公司合成，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和細胞計數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購自美國 Promega 公司,Lipofectamine 3000、TRIzol試劑購自北京鼎國生物技術有限責任公司,慢病毒載體陰性對照(shRNA negative control,sh-NC)和pGCshL-TUT1載體由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;化學發(fā)光顯影系統(tǒng)購自英國Syngene公司,酶標儀購自美國Biotech公司，常氧培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達取胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織各50 mg,剪碎,在液氮中研磨,采用TRIzoI試劑提取總RNA,應用PrimeScriptTM RT Master Mix試劑盒反轉錄RNA。miR-342-3p上游引物序列為5′-GCTACACATTACAGATACCT-3′,下游引物序列為5′-GACACCACTGCCATACCT-3′;TUT1上游引物序列為5′-TTCATTAATCTGGTCCATCT-3′,下游引物序列為5′-GTAATCCTAGGTGATCTAT-3′;THBS2上游引物序列為5′-GTATCTCAGGCGTACCGGCT-3′,下游引物序列為5′-GCCTTAAGTGATGCCTAAGTCT-3′;以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參,GAPDH上游引物序列為5′-GTCAATCCAGGTATATACCT-3′,下游引物序列為5′-GTTATCGTCTATATTACCAT-3′。qRT-PCR反應體系:2×SYBR Green mixture 5 μL,PCR正向引物和反向引物各 1 μL,cDNA 1 μL,無RNase酶2 μL；反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40個循環(huán)。采用2-△△Ct法計算miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA相對表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng)將人胰腺導管腺癌細胞株PANC-1接種于DMEM中，置于37 ℃含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合度達80%以上時,棄培養(yǎng)液,使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次,胰蛋白酶消化細胞,棄液,PBS沖洗2次,加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 細胞轉染和分組取對數(shù)生長期PANC-1細胞,以每孔1×105個細胞接種于6孔板中,用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 24 h，待細胞生長至融合度80%～90%時進行轉染，取6孔板中的PANC-1細胞，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗，加入使用Lipofectamine 3000轉染試劑配置好的混合液。將細胞分為10組，分別為對照組(轉染miR-NC)、miR-342-3p過表達組(轉染miR-342-3p mimic)、miR-342-3p抑制劑組(轉染miR-342-3p inhibitor)、Vector組(轉染pCS4-HA vector)、TUT1組(轉染pcDNA3-Flag- TUT1)、陰性對照組(轉染sh-NC 慢病毒載體)、TUT1沉默組(轉染pGCshL-TUT1載體) 、miR-342-3p過表達+TUT1組(同時轉染miR-342-3p mimic和TUT1)、miR-342-3p過表達+THBS2組(同時轉染miR-342-3p mimic和THBS2)、TUT1+THBS2組(同時轉染pcDNA3-Flag-TUT1和THBS2),按照說明書操作進行轉染,轉染48 h后收集細胞。

1.3.4 CCK-8法檢測各組細胞增殖能力取對照組、miR-342-3p過表達組、miR-342-3p抑制劑組、Vector組、TUT1組、陰性對照組、TUT1沉默組、miR-342-3p 過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組對數(shù)生長期PANC-1細胞，以每孔1×106個細胞接種于96孔板,置于37 ℃、含體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于24、48、72 h 時取出培養(yǎng)板,每孔加入 10 μL CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用酶標儀測各孔吸光度值，吸光度值越大，細胞增殖能力越強。實驗重復3次，取均值。

1.3.5 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況取對照組、miR-342-3p過表達組、miR-342-3p抑制劑組、Vector組、TUT1組、陰性對照組、TUT1沉默組、miR-342-3p 過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組對數(shù)生長期PANC-1細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板,用不含乙二胺四乙酸鈉的胰蛋白酶消化并收集細胞,PBS重懸細胞,3 000 r·min-1離心10 min,棄上清、重新重懸細胞，分別加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)混勻，避光孵育20 min，1 h后使用流式細胞儀檢測各組PANC-1細胞的凋亡情況。

1.3.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-342-3p與TUT1的靶向關系通過Targetscan網站預測miR-342-3p與TUT1的3′非編碼區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)的結合點位,采用聚合酶鏈式反應法從基因組擴增含有與miR-342-3p結合野生型或突變型的TUT13′-UTR序列,克隆到pGL-3熒光素酶報告載體,將載體和TUT1、對照物轉染到完全培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h的PANC-1細胞中,48 h后,采用雙熒光素酶報告基因測試盒檢測野生型和突變型TUT1相對熒光素酶活性。實驗重復3次，取均值。

1.3.7 Western blot法檢測PANC-1細胞中TUT1、THBS2蛋白表達提取對照組、miR-342-3p過表達組和miR-342-3p抑制劑組PANC-1細胞中的蛋白質,3 000 r·min-1離心5 min,加入蛋白裂解液，采用二喹啉甲酸法測蛋白濃度。使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，轉膜 1 h，緩沖液沖洗。根據(jù)抗體說明書，加入TUT1 (11 000稀釋)、THBS2 (11 000稀釋)一抗和GAPDH抗體(11 000稀釋)， 4 ℃過夜。室溫下孵育二抗，2 h后回收二抗，緩沖液沖洗，電化學發(fā)光法顯影，拍照記錄。以GAPDH為內參，應用Image J軟件進行目的蛋白定量分析，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值表示。實驗重復3次，取均值。

2 結果

2.1 miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA在胰腺導管腺癌組織和癌旁正常組織中的相對表達量比較

胰腺導管腺癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的相對表達量分別為1.03±0.02、0.98±0.03和1.04±0.02，癌旁正常組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2mRNA的相對表達量分別為1.67±0.39、1.53±0.44和1.75±0.52；胰腺導管腺癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA的相對表達量顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 胰腺導管腺癌癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA表達與患者臨床病理學參數(shù)的關系結果見表1。不同年齡、腫瘤直徑、淋巴結轉移和腫瘤分期患者癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；高分化癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達顯著高于中+低分化癌組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 胰腺導管腺癌癌組織中miR-342-3p、TUT1、THBS2 mRNA表達與患者臨床病理學參數(shù)的關系

2.3 各組PANC-1細胞的增殖能力和細胞凋亡率比較結果見表2、表3、表4和圖1。培養(yǎng)0 h時，各組PANC-1細胞的增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，TUT1組細胞的增殖能力均顯著低于Vecort組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TUT1組細胞的凋亡率顯著高于Vecort組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，TUT1沉默組細胞的增殖能力顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TUT1沉默組的細胞凋亡率顯著低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

培養(yǎng)24、48、72 h時，miR-342-3p抑制劑組的細胞增殖能力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達組的細胞增殖能力顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h時，miR-342-3p過表達+TUT1組、miR-342-3p 過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組與miR-342-3p過表達組的細胞增殖能力比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。培養(yǎng)48、72 h時，miR-342-3p 過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組的細胞增殖能力均顯著低于miR-342-3p過表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。miR-342-3p抑制劑組細胞的凋亡率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達組細胞的凋亡率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；miR-342-3p過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組細胞的凋亡率顯著高于miR-342-3p過表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 Vector組與TUT1組PANC-1細胞增殖能力和細胞凋亡率比較

表3 陰性對照組與TUT1沉默組PANC-1細胞增殖能力和細胞凋亡率比較

表4 對照組、miR-342-3p抑制劑組、miR-342-3p過表達組、miR-342-3p過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組和TUT1+THBS2組細胞增殖能力和細胞凋亡率比較

A:對照組;B:miR-342-3p過表達組;C:miR-342-3p抑制劑組;D:Vector組;E:TUT1組;F:陰性對照組;G:TUT1沉默組;H:miR-342-3p過表達+TUT1組;I:miR-342-3p過表達+THBS2組;J:TUT1+THBS2組。

2.4 miR-342-3p與TUT1的靶向關系分析結果結果見圖2。熒光素酶報告結果顯示,對照組和miR-342-3p過表達組細胞中野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性分別為1.02±0.19、1.74±0.67，突變型TUT1的熒光素酶活性分別為1.01±0.23、1.03±0.22。miR-342-3p過表達組細胞中野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；突變型TUT1報告基因的熒光素酶活性與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 miR-342-3p與TUT1的靶向關系

2.5 對照組、miR-342-3p過表達組和miR-342-3p抑制劑組細胞中TUT1、THBS2蛋白相對表達量比較結果見圖3。對照組和miR-342-3p過表達組細胞中TUT1蛋白的相對表達量分別為1.02±0.07、1.63±0.18，THBS2蛋白的相對表達量分別為0.97±0.05、1.59±0.14；對照組和miR-342-3p抑制劑組細胞中TUT1蛋白的相對表達量分別1.01±0.05、0.49±0.03，THBS2蛋白的相對表達量分別為0.95±0.07、0.34±0.06。miR-342-3p過表達組細胞中TUT1和THBS2蛋白的相對表達量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);miR-342-3p抑制劑組細胞中TUT1和THBS2蛋白的相對表達量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 對照組、miR-342-3p過表達組和miR-342-3p抑制劑組細胞中TUT1、THBS2蛋白表達(Western blot)

3 討論

胰腺癌是一種致死率極高的消化系統(tǒng)常見的腫瘤。近年來,胰腺癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢,該病的發(fā)病比較隱匿,且在發(fā)病早期就可出現(xiàn)組織浸潤和遠處轉移,而且惡性程度較高,放射治療和化學治療效果不理想。目前，最有效的辦法是行根治性腫瘤切除手術。但近80%的患者確診時已屬于晚期或者已發(fā)生轉移[10]。僅有20%的患者才有機會進行手術,10%的患者才可行徹底的切除手術,而且常規(guī)手術治療后,患者平均生存率最高為20個月,切除率較低,預后較差[11]。有研究報道,胰腺癌的 5 a總生存率僅為5%,是常見腫瘤中病死率較高的惡性腫瘤[12]。因此,迫切需要探索新的有效的治療方法來改變胰腺癌的治療現(xiàn)狀。

miRNA參與細胞增殖、凋亡等多種生理過程和生物學行為的調控[13]。miR-342-3p由14號染色體編碼,有研究表明,miR-342-3p可通過靶向人宮頸癌中的FOXM1來抑制增殖、遷移和侵襲[14]。miR-342-3p還可通過直接抑制E2F1的表達調控人肺癌MYC的轉錄活性[15]。還有研究表明,miR-342-3p可通過靶向AGR2抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移[16]。關于miR-342-3p在肺癌、宮頸癌、甲狀腺癌、乳腺癌中的作用的研究較多,但目前關于miR-342-3p在胰腺導管腺癌中的作用的報道較少?；诖?，本研究探討了miR-342-3p在胰腺導管腺癌中的作用,并通過觀察miR-342-3p對TUT、THBS2的調控作用來驗證miR-342-3p/TUT1/THBS2通路在胰腺導管腺癌中的主要作用。

TUT1 是末端尿苷酰轉移酶,可將尿苷磷酰化尾部與 U6-snRNA 的30區(qū)結合,誘導 LSM2-8 蛋白復合物的募集[17]。有研究表明，TUT1可通過使特定 miRNA 的尿苷磷?；?，來間接控制miRNA的穩(wěn)定性和整體miRNA的表達。在人骨肉瘤細胞株MG63和U2OS中,增強TUT1的表達可以抑制細胞增殖[18]。THBS2是一種鈣結合糖蛋白,在創(chuàng)傷修復、腫瘤形成和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著組織重建的作用[19]。有研究顯示，THBS2在宮頸癌中呈低表達[20]。本研究結果顯示,miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA胰腺導管腺癌組織中的相對表達量顯著低于癌旁正常組織。胰腺導管腺癌組織中miR-342-3p及TUT1、THBS2 mRNA的表達與患者的年齡、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及腫瘤分期無關；但與腫瘤的分化程度有關，其在高分化腫瘤組織中的相對表達量顯著高于中+低分化組織。本研究結果提示，miR-342-3p、TUT1、THBS2可能屬于抑癌基因,其表達量增加能夠阻止胰腺導管腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

為了證實miR-342-3p在胰腺導管腺癌中的作用機制,本研究采用CCK-8和流式細胞術檢測PANC-1細胞的增殖和凋亡情況,結果顯示,過表達miR-342-3p可以抑制PANC-1細胞的增殖,促進其凋亡;抑制miR-342-3p的表達可以促進PANC-1細胞的增殖,降低其凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達miR-342-3p可顯著上調野生型TUT1報告基因的熒光素酶活性；過表達TUT1后,PANC-1細胞的增殖能力顯著降低,凋亡率顯著升高，沉默TUT1的表達后,PANC-1細胞的增殖能力則顯著升高,凋亡率顯著降低；過表達miR-342-3p后,PANC-1細胞中的TUT1、THBS2蛋白的表達顯著增加,而抑制miR-342-3p 表達后,TUT1、THBS2蛋白的表達則顯著降低。以上結果說明，miR-342-3p與TUT1、THBS2存在正相關關系。為了進一步驗證miR-342-3p/TUT1/THBS2通路對PANC-1細胞增殖和凋亡的作用機制,本研究采用雙轉染實驗來觀察miR-342-3p 對TUT1和THBS2的作用,結果顯示,miR-342-3p過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達+THBS2組、TUT1+THBS2組的細胞增殖能力顯著低于miR-342-3p過表達組。miR-342-3p過表達+TUT1組、miR-342-3p過表達組+THBS2組、TUT1+THBS2組的細胞的凋亡率顯著高于miR-342-3p過表達組；這說明，miR-342-3p/TUT1/THBS2通路可以抑制PANC-1細胞的增殖,并促進其凋亡。

綜上所述,過表達miR-342-3p可以抑制PANC-1細胞的增殖,促進其凋亡，進而抑制胰腺導管腺癌的發(fā)展，其機制可能與miR-342-3p/TUT1/THBS2通路有關。