楊 洋，黃旭龍，楊蕾蕾，Victor Amoroso，何韓軍

(1.湖南醫(yī)藥學院藥學院，湖南 懷化 418000；2.華南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，廣東 廣州 510642；3.深圳市中國科學院仙湖植物園，廣東 深圳 518004；4.College of Arts and Sciences,Central Mindanao University,Bukidnon 8710,Philippines)

紅腺忍冬(LonicerahypoglaucaMiq.)為忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera)藤本植物，又名菰腺忍冬、盤腺忍冬、山銀花、大銀花、大金銀花、大葉金銀花等，主產(chǎn)湖南、湖北、安徽等省，多生于山地、山谷的灌木叢、疏林中。紅腺忍冬是《中華人民共和國藥典》收錄的中藥山銀花指定的原料之一[1]。其味甘、性寒，有清熱解毒、涼散風熱的功效，具有抗病原微生物、抗炎退熱、抗氧化、抗腫瘤、抗過敏、抗動脈粥樣硬化、降血脂、保護肝臟、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1-4]。紅腺忍冬還被廣泛應用于飲料、食品、保健品、化妝品、日用化工和畜牧獸醫(yī)等領域。此外，紅腺忍冬在園林觀賞、綠化荒山、保持水土等方面亦具有重要的生態(tài)價值。

扦插和播種是紅腺忍冬在生產(chǎn)中常用的繁殖方法，但扦插繁殖系數(shù)低，受季節(jié)限制并對扦插條要求高[5]，而播種苗抗旱性差，不利于作為種苗大規(guī)模推廣[6]。利用組織培養(yǎng)對紅腺忍冬優(yōu)良株系進行快速繁殖，不僅繁殖速度快、繁殖系數(shù)高，還可以獲得大量優(yōu)良的脫毒種苗植株，擁有良好的應用前景。周婧等[7]和李魁鵬等[8]以紅腺忍冬腋芽莖段為外植體進行組織培養(yǎng)，腋芽的萌發(fā)率分別為41.61%和53.3%，但腋芽的萌發(fā)率易受外植體取材季節(jié)的影響?？妱θA等[9]和師風華等[10]以無菌組培苗葉柄為外植體進行組織培養(yǎng)，不定根和不定芽的誘導率分別為62.50%和18.25%。趙元等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大葉龍竹組培苗根系發(fā)達，造林成活率高、成林速度快、生長量大于傳統(tǒng)育苗造林。Run-Ze Sun等[12]對旋蒴苣苔成熟葉片和幼嫩葉片的組培研究發(fā)現(xiàn)，成熟葉片中DNA去甲基化所需的DNA糖基化酶裂解酶的表達顯著降低，故其再生能力隨著外植體年齡的增加而降低。在廣藿香[13]、金艷獼猴桃[14]、山葵[15]、福鼎大白茶[16]等誘導愈傷組織的研究中發(fā)現(xiàn)，以嫩葉為外植體優(yōu)于老葉、頂芽、莖段及根。而不受季節(jié)影響且更易獲取的嫩葉為外植體的紅腺忍冬組培快繁體系尚未建立，愈傷組織的形成，芽的誘導分化的最適誘導培養(yǎng)基和條件尚待摸索。本研究以紅腺忍冬嫩葉為外植體，旨在建立以紅腺忍冬嫩葉為外植體的組織培養(yǎng)快速繁殖體系，為紅腺忍冬種苗組織快繁工廠化大批量生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為新鮮紅腺忍冬嫩葉片，于2020年3月采自湖南省懷化市中方鎮(zhèn)荊坪古村。

1.2 外植體消毒和愈傷組織的獲得

選取紅腺忍冬健康嫩葉為外植體，先用吐溫80浸泡2 min，用自來水反復沖洗10 min，直至干凈，然后在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡15 s，再用0.1% HgCl2處理3 min、8 min和15 min，無菌水反復振蕩沖洗4～5次后置于接種盤中，將葉片接種于MS基本培養(yǎng)基上(圖1 A)，按2,4-二氯苯氧乙酸(2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，設置12個培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度梯度和處理時間組合(表1)。每個處理接種10瓶，重復3次。每3 d觀察一次，30 d后記錄觀察結果，并統(tǒng)計污染率、褐化死亡率和誘導率。

污染率(%)=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

褐化死亡率(%)=(褐化死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；

誘導率(%)=(誘導出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.3 初代分化培養(yǎng)

在超凈工作臺上，取生長良好且長勢一致的愈傷組織，用解剖刀切割成1 cm3左右大小后接種于以MS為基本培養(yǎng)基，設置6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.01、0.05、0.10、0.50 mg/L)共16個處理組合(表2)。每3 d觀察一次，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導分化芽的出芽率及分化芽的生長情況。

出芽率(%)=(出芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%。

1.4 繼代增殖培養(yǎng)

在超凈工作臺上，取生長良好且長勢一致的分化芽，切割成大小和數(shù)目都相同的芽叢后接種到分別添加6-BA(1.0、1.5、2.0 mg/L)和NAA(0.01、0.05、0.10 mg/L)的MS固體培養(yǎng)基中(表3)。每3 d觀察一次，接種30 d后統(tǒng)計分化芽的增殖系數(shù)和生長狀態(tài)。

增殖系數(shù)=增殖后芽的總數(shù)/接種時芽的總數(shù)。

1.5 生根培養(yǎng)

將生長至3～5 cm的芽自基部切下，接種至NAA(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L)的添加活性炭0.3 g/L的1/2 MS固體培養(yǎng)基中(表4)，以不添加活性炭為空白對照(ck)。每3 d觀察一次，30 d后觀察并統(tǒng)計組培苗生根的根長、根數(shù)及質量。

生根率(%)=(生根的誘導株數(shù)/接種的總株數(shù))×100%。

表1 2,4-D濃度及HgCl2消毒時間對紅腺忍冬誘導愈傷組織的影響Table 1 The effects of 2,4-D concentration and HgCl2 disinfection time on the callus induction of Lonicera hypoglauca Miq.

表2 不同6-BA和NAA濃度配比對愈傷組織誘導芽的影響Table 2 The impact by different content of 6-BA and NAA on buds induction of callus

1.6 煉苗及移栽

將生根培養(yǎng)瓶轉移到煉苗室中培養(yǎng)2 d，擰松瓶蓋1 d，打開瓶蓋煉苗1 d，將苗取出，用流水輕輕沖洗干凈根系間的培養(yǎng)基，然后移栽到營養(yǎng)土(V泥炭土∶V珍珠巖=3∶1)中，25 ℃下培養(yǎng)，定期澆水，每3 d觀察一次，21 d后觀察并統(tǒng)計幼苗成活率。

成活率(%)=(移栽成活的株數(shù)/移栽的總株數(shù))×100%。

1.7 培養(yǎng)條件

本試驗初代、繼代培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，其中蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L；生根培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基，蔗糖15 g/L、瓊脂7 g/L、活性炭0.3 g/L。pH均調(diào)為5.8～6.0，121 KPa高壓蒸汽滅菌20 min，培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強度2 500 lx，光照時間12 h/d，相對濕度為60%。

2 結果與分析

2.1 紅腺忍冬誘導愈傷組織培養(yǎng)的適宜條件篩選

以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同濃度2,4-D及HgCl2不同消毒時間對紅腺忍冬外植體誘導愈傷組織的影響。結果(表1、圖1)表明，不同濃度2,4-D處理外植體均有不同程度的脫分化表現(xiàn)，而紅腺忍冬外植體在A 7處理組合中，愈傷誘導率最高(86.67%)，且平均褐化死亡率最低(5.56%)，與其他11個組合相比具有顯著差異，且長勢好，顏色較綠，質地疏松(圖1 B)。雖然A 9處理組合污染率最低，但綜合處理8 min和15 min的污染率來看，兩者相差不大，且8 min處理的褐化死亡率要顯著低于15 min。因此，綜合外植體平均誘導率、平均褐化死亡率和平均污染率，得出紅腺忍冬嫩葉外植體最適消毒時間為8 min，最適誘導愈傷組織的生長調(diào)節(jié)劑2,4-D的濃度為4.0 mg/L。

2.2 愈傷組織分化培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA和NAA。結果(表2)表明，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織分化誘導芽的比率逐漸上升，當濃度超過1.0 mg/L后出芽率開始下降，NAA亦具有同樣的變化趨勢，說明高濃度的6-BA和NAA均不利于愈傷組織誘導分化芽。在16個處理組合中B 7的平均出芽率最高(83.33%)，且分化芽生長較粗壯，顏色鮮綠，長勢最好。故6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L為本試驗誘導愈傷組織分化較理想的生長調(diào)節(jié)劑配方。

2.3 分化芽的增殖培養(yǎng)

以MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度6-BA和NAA。在9個試驗處理組合中，紅腺忍冬分化芽均有不同程度的增殖，且隨著NAA濃度的緩慢升高，其分化芽增殖系數(shù)基本呈下降趨勢，而隨著6-BA濃度的不斷增加，紅腺忍冬分化芽增殖系數(shù)先增大后減小，當生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.5 mg/L和NAA 0.05 mg/L時，紅腺忍冬分化芽增殖系數(shù)最高(5.42)，且芽生長粗大，顏色較綠，長勢好(圖1 C)。適合紅腺忍冬分化芽增殖誘導的生長調(diào)節(jié)劑配方為6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

注：A為接種的紅腺忍冬外植體嫩葉； B為外植體誘導愈傷組織30 d生長情況；C為分化芽增殖30 d的生長情況； D為生根培養(yǎng)30 d生長情況；E為紅腺忍冬煉苗移栽生長情況。圖1 紅腺忍冬的組織培養(yǎng)Fig.1 Tissue culture of Lonicera hypoglauca Miq.

表3 不同6-BA和NAA濃度配比對芽擴繁誘導的影響Table 3 The impact by different concentration ratios of 6-BA and NAA on shoot multiplication of buds

2.4 分化芽生根培養(yǎng)及煉苗移栽

將分化增殖的紅腺忍冬芽切割成長3～5 cm，接種至不同濃度NAA的1/2 MS基本培養(yǎng)基中。結果(表4)顯示，未添加活性炭的D 1～D 5組平均生根率明顯低于添加了活性炭的D 6～D 10組，且D 6～D 10組根更粗壯，須根更多，生長狀況也更好。在各組中，隨著NAA濃度的增高，生根率呈先升后降的趨勢，當NAA濃度為0.15 mg/L(D 3和D 8)時，生根率均達最大值，在D 8處理中高達91.11%，與其他濃度處理差異顯著，且此時植株生長健康，根系粗壯發(fā)達(圖1 D)，生長較快。因此，NAA 0.15 mg/L為誘導紅腺忍冬生根的最適生長調(diào)節(jié)劑濃度。經(jīng)過煉苗移栽至營養(yǎng)土(V泥炭土∶V珍珠巖=3∶1)中(圖1 E)，25 ℃下培養(yǎng)，成活率高達100%。

3 討 論

周婧等[7]和李魁鵬等[8]對紅腺忍冬腋芽莖段進行消毒處理，污染率分別為34.64%和31.0%，Nong等[17]研究認為，紅腺忍冬腋芽污染率相對較低(16.0%)。而本試驗選用的紅腺忍冬嫩葉為外植體的污染率僅為3.33%，污染率極低，能極大減少組培過程中由于污染造成的損失，提高組培效率和種苗供應量。此外，本研究的褐化死亡率也低于上述研究報道。再者，本研究發(fā)現(xiàn)，由于紅腺忍冬嫩葉上著生有較多絨毛，在組織培養(yǎng)過程中如外植體消毒不徹底，會被污染甚至死亡，因此獲得有活性的無菌材料是植物組織快繁體系建立的首要條件。相比于嫩葉，外植體腋芽除了被有絨毛以外，其整體結構更為復雜，一方面，由于葉原基和腋芽原基之間的縫隙容易藏菌；另一方面，相比于已經(jīng)有部分成熟組織的嫩葉，腋芽的分生組織占比較大，對細菌、病毒的抗性相對較差，因此增加了細菌、病毒等在外植體上著生和感染的幾率。張華通等[13]研究發(fā)現(xiàn)，以廣藿香嫩葉作為外植體誘導率較高，污染率較低，而以頂芽和莖段做外植體的誘導過程中受到大量細菌和真菌的污染。吳燕燕等[14]發(fā)現(xiàn)，以金艷獼猴桃莖段做外植體比葉片更容易染菌。與老葉和莖段相比，福鼎大白茶嫩葉為外植體的褐化率最低，存活時間最長，且出現(xiàn)愈傷組織最早[16]。山葵嫩葉誘導愈傷組織誘導率(100%)高于老葉(90%)、葉柄(94%)、莖(38.67%)和根(41.33%)，且山葵嫩葉誘導的愈傷組織質地疏松，更易誘導分化出不定芽[15]。因此，以嫩葉為外植體不僅更優(yōu)于其他部位，且不受季節(jié)限制，也更易獲取，更適合工廠組織快繁大批量生產(chǎn)種苗的取材。

表4 不同NAA濃度對芽誘導生根的影響Table 4 The effects of different NAA concentrations on the roots regeneration of buds

外源生長調(diào)節(jié)劑的合理配比對紅腺忍冬芽的誘導和增殖尤為關鍵。濃度過低或過高，都不利于芽的形成和增殖，過高濃度還有抑制作用。在分化芽的增殖試驗中，本試驗所得紅腺忍冬分化芽增殖最佳生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L，這與李魁鵬等[8]、葉立濤等[18]和王慧俐等[19]利用腋芽和莖段為外植體研究獲得的試驗數(shù)據(jù)基本一致，但本試驗的增殖系數(shù)(5.42)高于直接使用腋芽為外植體的Nong等[17]試驗的增殖系數(shù)(1.50)和李魁鵬等[8]試驗增殖系數(shù)(2.60)。結合本試驗和相關文獻，推測這可能是因為紅腺忍冬嫩葉外植體經(jīng)過脫分化和再分化的過程，已經(jīng)適應了大量增殖的過程和環(huán)境，且形成了相對外植體腋芽更加無菌無病毒的分化芽，因此其分化增殖能力更強。

多項資料顯示，由于山銀花生命力旺盛等生理特征，因此其生根相對容易，加入適量濃度的NAA后，易長出須根，但濃度不宜太大，否則會阻遏根的生長，甚至導致植物枯死[18-20]。李翔[20]研究表明，山銀花最適NAA生根濃度為0.25 mg/L。Nong等[17]研究顯示，紅腺忍冬生根培養(yǎng)較適宜NAA濃度為0.1 mg/L?？妱θA等[9]使用生長調(diào)節(jié)劑配比6-BA 2.0 mg/L+KT(呋喃氨基嘌呤)2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L得到最高生根率(62.50%)。在本研究中，當NAA濃度為0.15 mg/L時，生根率達到最大值(91.11%)，與Nong等[17]得到的數(shù)據(jù)較相近。在試驗活性炭有無對比中發(fā)現(xiàn)，添加了適量(0.3 g/L)活性炭的根系和生長情況比沒有添加活性炭時要好，不僅根須更多且相對粗壯，苗木也更健壯，葉色更濃綠，這可能除了活性炭吸附一些有害物質以外，還與組培苗根系有避光生長的特性有關[20]，添加活性炭后，為根系創(chuàng)造了生長的黑暗環(huán)境，故能更好地促進根系生長。

4 結 論

與其他外植體相比，利用嫩葉為外植體進行組培苗生產(chǎn)不僅更易獲取大量材料，更有效降低了誘導愈傷組織和誘導芽產(chǎn)生的難度，獲得更為健壯的再生植株，大大提高了紅腺忍冬的繁殖效率。本研究首次以更易取材的紅腺忍冬嫩葉為外植體，探索出一套較為完善的“外植體-愈傷組織-分化芽-增殖芽-分化根-煉苗移栽”的紅腺忍冬組織快繁體系，為紅腺忍冬種苗組織快繁工廠化大批量生產(chǎn)提供了新思路。