歐勝平，桂 陽，黃萬兵，龔光祿，劉宏宇，朱國勝

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550001；2.貴州省農(nóng)作物品種資源研究所，貴陽 550006；3.貴州省食用菌育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550006；4.貴州省食用菌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資源育種功能實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550006；5.貴州省食用菌工程技術(shù)研究中心資源育種實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550006)

紅托竹蓀(Phallusrubrovolvatus)又名竹笙、竹參，因在自然界常生長在竹子殘體周邊的腐殖土上且菌托呈紫紅色而得名[1-2]。紅托竹蓀野生資源主要分布于貴州、云南、江西、四川和浙江等省[3-4]，目前人工規(guī)?；耘嘀饕谫F州[5]。研究表明，紅托竹蓀富含可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸、VC、多糖和礦質(zhì)元素[6-7]，品質(zhì)優(yōu)于長裙竹蓀和棘托竹蓀[8]，具有抗腫瘤、抗氧化和保護(hù)酒精性肝損傷等功能[9-11]，市場空間廣闊。

表1 儀器設(shè)備Table 1 Instruments and equipment

目前關(guān)于紅托竹蓀的研究大多局限于對常見碳氮源的篩選方面[12-13]，長期以來菌絲生長緩慢的問題一直難有突破，導(dǎo)致在實(shí)際生產(chǎn)中存在菌種衰退、多次傳代后生長受限和栽培周期長等問題，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)業(yè)發(fā)展。紅托竹蓀菌絲在原生境竹林中生長狀況良好，在同一地點(diǎn)可持續(xù)出菇，未見衰退[14-15]。因此，本研究以原生境中主要伴生植物金竹、苦竹、慈竹和楠竹的根、莖、葉和蔸作為培養(yǎng)基質(zhì)，并結(jié)合不同竹子根、莖、葉和蔸的營養(yǎng)成分分析，通過菌絲宏觀形態(tài)評價，以期找到與紅托竹蓀菌絲生長相關(guān)的關(guān)鍵物質(zhì)，并進(jìn)一步驗(yàn)證，為紅托竹蓀菌絲生長培養(yǎng)基配方優(yōu)化研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

菌種Yzs 020(P.rubrovolvatus)來自貴州省農(nóng)作物品種資源研究所。

1.2 試 劑

硝酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鈣、鎂、鋅、鐵、銅、錳和硒7種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液：國家有色金屬及電子材料分析測試中心；17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：源葉生物；色譜級甲醇：Tedia公司；七水硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O)：分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸銅(CuSO4)：分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水三氯化鐵(FeCl3)和無水氯化鈣(CaCl2)均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水硫酸錳(MnSO4)：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。L-谷氨酸：分析純，北京索萊寶科技有限公司；D-丙氨酸、L-蘇氨酸、DL-絲氨酸、L-天冬酰胺和L-天門冬氨酸均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 主要設(shè)備

主要儀器設(shè)備見表1。

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1菌種活化培養(yǎng)基

木屑50 g，馬鈴薯200 g，葡萄糖5 g，果糖25 g，蛋白胨2.5 g，硫酸銨2.5 g，瓊脂10 g，馬鈴薯切片加適量純水煮20 min后取濾液，最后純水定容1 000 mL。

1.4.2竹子根、莖、葉、蔸培養(yǎng)基

以不同竹子的根、莖、葉和蔸4個不同器官為主料，烘干至恒重后粉碎過80目篩，分別單獨(dú)稱取不同竹子的不同器官材料50 g、瓊脂10 g倒入鍋中煮開后純水定容1 000 mL，最后分裝滅菌，共15種培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基成分和編號見表2。

1.4.3礦質(zhì)元素和氨基酸驗(yàn)證基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖20 g，胰蛋白胨2.0 g，維生素B140 mg， 瓊脂粉10 g，純水定容1 000 mL。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1竹子根、莖、葉、蔸培養(yǎng)紅托竹蓀實(shí)驗(yàn)

將滅菌的竹材料培養(yǎng)基置于超凈工作臺上，分裝于平皿中，使用菌絲剛長滿的活化平皿，3 mm打孔器從菌落周圍打取菌片，菌絲面朝上，置25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個實(shí)驗(yàn)處理3個重復(fù)。待菌落直徑達(dá)到0.5 cm后，采用十字交叉法在菌落邊緣畫起始線，繼續(xù)培養(yǎng)到菌絲生長最快的培養(yǎng)基即將長滿平皿時，取出所有平皿畫終止線，用游標(biāo)卡尺測量起始線到終止線之間的距離(L)，記錄畫線的天數(shù)(d)，菌絲生長速度。菌絲長勢用“+”的數(shù)量表示好，“+”數(shù)量越多表示菌絲長勢越好，反之則越少(表3)。

表2 培養(yǎng)基Table 2 Culture medium

表3 竹子不同器官對紅托竹蓀菌絲生長差異分析Table 3 Variation analysis of different organs of bamboo on mycelial growth of P. rubrovolvatus

1.5.2竹子根、莖、葉、蔸中礦質(zhì)元素和氨基酸含量與紅托竹蓀菌絲生長相關(guān)性實(shí)驗(yàn)

竹子根、莖、葉中礦質(zhì)元素含量測定參照文獻(xiàn)[16]的方法，氨基酸含量測定方法參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 30987-2020[17]。使用軟件SPSS 24.0中的雙變量相關(guān)分析法對紅托竹蓀菌絲生長速度與竹子中物質(zhì)含量之間進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.5.3礦質(zhì)元素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加Zn2+(ZnSO4·7 H2O為添加劑，Zn2+濃度為2 μmol/L、20 μmol/L、200 μmol/L、2 000 μmol/L、20 000 μmol/L)，F(xiàn)e3+(以FeCl3為添加劑，F(xiàn)e3+的濃度為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L、10 000 μmol/L)，Mn2+(以MnSO4為添加劑，Mn2+的濃度為1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/L)，Ca2+(以CaCl2為添加劑，Ca2+的濃度為1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L、1 000 mmol/L)。接種、培養(yǎng)、記錄和測量等同1.5.1項(xiàng)。

1.5.4氨基酸驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加D-丙氨酸濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L；DL-絲氨酸濃度為1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L；L-蘇氨酸濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L；L-谷氨酸濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L。L-天門冬氨酸濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L；L-天冬酰胺濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、10 mg/L、100 mg/L、1 000 mg/L。接種、培養(yǎng)、記錄和測量等同1.5.1項(xiàng)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)在SPSS 24.0軟件和Excel軟件中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮竹子根、莖、葉、蔸對紅托竹蓀菌絲生長速度的影響

不同竹子培養(yǎng)基中菌絲生長速度和長勢見表3。從菌絲生長速度來看，4種新鮮竹子的根、莖、葉、蔸對菌絲生長影響差異較大。在所有竹子培養(yǎng)基中，紅托竹蓀菌絲在金竹根(JG)培養(yǎng)基中生長速度最快，生長速度為2.38 mm/d，苦竹葉(KY)培養(yǎng)基次之，生長速度為2.25 mm/d，這兩種培養(yǎng)基的菌絲生長速度差異不顯著，但和其他13個竹子培養(yǎng)基中菌絲生長速度比較都存在顯著差異，而金竹莖(JJ)和慈竹莖(CJ)培養(yǎng)基中菌絲生長最慢，生長速度分別為0.76 mm/d和0.50 mm/d。 15個竹子培養(yǎng)基中菌絲生長速度依次為：金竹根(JG)>苦竹葉(KY)>楠竹根(NG)>金竹蔸(JD)>苦竹蔸(KD)>楠竹莖(NJ)>楠竹葉(NY)>苦竹莖(KJ)>楠竹蔸(ND)>苦竹根(KG)>慈竹葉(CY)>慈竹蔸(CD)>金竹葉(JY)>金竹莖(JJ)>慈竹莖(CJ)。從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看(圖1)，苦竹葉(KY)培養(yǎng)基中菌絲潔白、濃密粗壯，長勢最好；金竹根(JG)培養(yǎng)基中菌絲長勢好，但菌絲卻較為稀疏、纖細(xì)；慈竹莖(CJ)培養(yǎng)基中菌絲長勢最差，菌絲稀疏纖細(xì)。

圖1 菌落形態(tài)(20 days)Fig.1 Colony morphology (20 days)

表4 竹子礦質(zhì)元素含量Table 4 Mineral element content of bamboo 單位：mg/kg

同一種器官不同竹子進(jìn)行比較可知，竹葉培養(yǎng)中菌絲生長速度依次為：苦竹葉(KY)>楠竹葉(NY)>慈竹葉(CY)>金竹葉(JY)，4種不同竹葉之間顯著差異明顯；竹莖中菌絲生長速度依次苦竹莖(KJ)>楠竹莖(NJ)>金竹莖(JJ)>慈竹莖(CJ)，4種不同竹莖之間都存在顯著差異；竹蔸中菌絲生長速度依次為，苦竹蔸(KD)>金竹蔸(JD)>楠竹蔸(ND)>慈竹蔸(CD)，4種不同竹篼之間顯著差異明顯；竹根中菌絲生長速度依次為，金竹根(JG)>楠竹根(NG)>苦竹根(KG)，3種不同竹篼之間都存在顯著差異；從菌絲長勢來看，竹葉培養(yǎng)中苦竹葉(KY)長勢最好，楠竹葉(NY)次之，第三是慈竹葉(CY)，最差的是金竹葉(JY)；竹莖培養(yǎng)基中，苦竹莖(KJ)長勢最好，楠竹莖(NJ)次之，第三是金竹莖(JJ)，最差的為慈竹莖(CJ)；竹蔸培養(yǎng)基中，苦竹蔸(KD)長勢最好，金竹蔸(JD)次之，第三是楠竹蔸(ND)，最差的為慈竹蔸(CD)；在竹根培養(yǎng)基中，金竹根(JG)和楠竹根(NG)最好，苦竹根(KG)長勢較差。

表5 紅托竹蓀菌絲生長速度與礦質(zhì)元素相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis between mycelial growth and mineral elements of P. rubrovolvatus

表6 竹子氨基酸含量Table 6 Amino acid content of bamboo 單位：μg/g

整體上來看，菌絲生長速度和長勢在苦竹中表現(xiàn)要優(yōu)于其他3種竹子、楠竹次之，其次為金竹，慈竹中菌絲表現(xiàn)最差，不同竹不同器官菌絲生長表現(xiàn)無明顯規(guī)律。

2.2 不同竹子根、莖、葉中礦質(zhì)元素含量與紅托竹蓀菌絲生長速度的相關(guān)性

不同竹子根、莖、葉中礦質(zhì)元素含量測定結(jié)果見表4。12種竹子材料都含有7種礦質(zhì)元素，不同材料中礦質(zhì)元素含量差異較大，整體來看七種礦質(zhì)元素的總體趨勢為Ca>Mg>Fe>Mn>Zn>Cu>Se。

對不同竹子根、莖、葉中礦質(zhì)元素含量與紅托竹蓀菌絲生長速度之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表5)表明，紅托竹蓀菌絲生長速度與Ca、Mn、Zn和Fe四種礦質(zhì)元素含量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性強(qiáng)弱從大到小依次為Mn、Ca、Zn和Fe，而與Mg、Cu和Se三種元素含量的相關(guān)性不顯著。

2.3 不同竹子根、莖、葉中氨基酸含量與紅托竹蓀菌絲生長速度的相關(guān)性

不同竹子根、莖、葉中氨基酸含量測定結(jié)果見表6，12種竹子材料都含有17種氨基酸，不同材料中氨基酸含量差異較大，總體看竹子中17種氨基酸含量較高的有天冬酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸4種氨基酸。

對不同竹子根、莖、葉中氨基酸含量與紅托竹蓀菌絲生長速度之間進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果(表7)表明，天冬酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和絲氨酸與紅托竹蓀菌絲生長速度呈顯著的正相關(guān)，相關(guān)性強(qiáng)弱從大到小依次為丙氨酸、天冬酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。

2.4 礦質(zhì)元素驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表8和圖2可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的ZnSO4·7 H2O對紅托竹蓀菌絲生長影響差異大，從菌絲生長速度來比較，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度20～2 000 μmol/L的ZnSO4·7 H2O時，對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為20 μmol/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與除200 μmol/L外的其他實(shí)驗(yàn)組相比都存在顯著差異，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加ZnSO4·7 H2O的濃度達(dá)到20 000 μmol/L時菌絲不生長，與其他添加濃度相比都存在顯著差異。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加ZnSO4·7 H2O時，隨著添加濃度的增加菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢。而從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度20～2 000 μmol/L的ZnSO4·7 H2O時菌絲長勢優(yōu)于對照組，其中添加濃度為20 μmol/L時菌落特征表現(xiàn)最佳，其菌落菌絲潔白濃密。

表7 紅托竹蓀菌絲生長速度與氨基酸相關(guān)性分析Table 7 Correlation analysis between mycelial growth and amino acids of P. rubrovolvatus

表8 Zn2+對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 8 Effect of Zn2+ on mycelial growth rate of P. rubrovolvatus

圖2 菌落形態(tài)(20 d, Zn2+)Fig.2 Colony morphology (20 days, Zn2+)

由表9和圖3可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的FeCl3對紅托竹蓀菌絲生長影響差異大，從菌絲生長速度來比較，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度10～100 μmol/L 的FeCl3時，對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，與除了添加100 μmol/L的其他實(shí)驗(yàn)組相比都存在顯著差異，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加FeCl3的濃度達(dá)到10 000 μmol/L時菌絲死亡。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加FeCl3時，隨著添加濃度的增加菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢，超過極限耐受濃度菌絲死亡。而從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度10～100 μmol/L的FeCl3時，菌落菌絲的色澤和長勢都要優(yōu)于對照組，其中添加濃度為10 μmol/L時菌落特征表現(xiàn)最佳，其菌落邊緣整齊、菌絲潔白濃密。

表9 Fe3+對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 9 Effect of Fe3+ on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖3 菌落形態(tài)(20 d, Fe3+)Fig.3 Colony morphology (20 days, Fe3+)

由表10和圖4可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的MnSO4對紅托竹蓀菌絲生長影響差異大，從菌絲生長速度來比較，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度1～100 μmol/L的MnSO4時，對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為100 μmol/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與除了添加10 μmol/L的其他實(shí)驗(yàn)組相比都存在顯著差異，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加MnSO4的濃度達(dá)到1 000 μmol/L時抑制菌絲的生長，與其他添加濃度相比都存在顯著差異。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加MnSO4時，隨著添加濃度的增加菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢。而從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度1～1 000 μmol/L的MnSO4時，菌落菌絲的色澤和長勢都要優(yōu)于對照組，其中添加濃度為100 μmol/L時菌落特征表現(xiàn)最佳，其菌落邊緣整齊、菌絲潔白濃密。

表10 Mn2+對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 10 Effect of Mn2+ on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖4 菌落形態(tài)(20 d, Mn2+)Fig.4 Colony morphology (20 days, Mn2+)

由表11可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度10～100 mmol/L的CaCl2時，對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為10 mmol/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與除了添加100 mmol/L的其他實(shí)驗(yàn)組相比都存在顯著差異，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加CaCl2的濃度達(dá)到1 000 mmol/L時抑制菌絲的生長，與其他添加濃度相比都存在顯著差異。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加CaCl2時，隨著添加濃度的增加，菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢。從菌絲長勢和菌落形態(tài)可知(圖5)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度1～10 mmol/L的CaCl2時，菌落邊緣整齊，菌絲濃密度和長勢都要優(yōu)于對照組，而當(dāng)其中添加濃度為100～1 000 mmol/L時菌落特征表現(xiàn)出邊緣不整齊。

表11 Ca2+對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 11 Effect of Ca2+ on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖5 菌落形態(tài)(20 d, Ca2+)Fig.5 Colony morphology (20 days, Ca2+)

2.5 氨基酸驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由表12可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為10 mg/L時，D-丙氨酸對紅托竹蓀菌絲生長促進(jìn)作用最明顯，與其他添加濃度的菌絲生長速度相比都存在顯著差異，D-丙氨酸添加濃度為0.1 mg/L、1 mg/L、100 mg/L和1 000 mg/L時菌絲生長速度都低于對照組。由圖6可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度D-丙氨酸對菌落特征的影響不明顯。

由表13可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為10～100 mg/L時，DL-絲氨酸對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為10 mg/L時對菌絲生長促進(jìn)作用最明顯，與除了添加100 mg/L的其他實(shí)驗(yàn)組菌絲生長速度相比都存在顯著差異。而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加DL-絲氨酸的濃度大于100 mg/L時，菌絲生長速度下降。由圖7可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加低濃度DL-絲氨酸時，菌落邊緣整齊，而添加濃度達(dá)到1 000 mg/L時菌落邊緣不整齊。

圖6 菌落形態(tài)(20 d, D-丙氨酸)Fig.6 Colony morphology (20 days， D-alanine)

表12 D-丙氨酸對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 12 Effect of D-alanine on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

表13 DL-絲氨酸對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 13 Effect of DL-serine on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖7 菌落形態(tài)(20 d, DL-絲氨酸)Fig.7 Colony morphology (20 days，DL-serine)

由表14可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-蘇氨酸的濃度在10～1 000 mg/L的范圍內(nèi)，L-蘇氨酸對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為100 mg/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與其他添加濃度相比都存在顯著差異，而當(dāng)添加濃度大于100 mg/L時，菌絲生長速度開始下降。從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看(圖8)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度為100 mg/L的 L-蘇氨酸時，菌落的氣生菌絲要最多，菌絲長勢最好。

表14 L-蘇氨酸對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 14 Effect of L-threonine on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖8 菌落形態(tài)(20 d, L-蘇氨酸)Fig.8 Colony morphology (20 days, L-threonine)

由表15可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-谷氨酸，添加濃度小于100 mg/L時，對菌絲生長促進(jìn)作用不明顯，而當(dāng)添加L-谷氨酸的濃度為100 mg/L時，L-谷氨酸對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，與其他添加濃度相比都存在顯著差異，添加濃度超過100 mg/L菌絲生長速度開始下降。從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看(圖9)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度100～1 000 mg/L 的L-谷氨酸時，菌落菌絲的色澤和長勢都要優(yōu)于對照組，其中添加濃度為100 mg/L時菌落特征表現(xiàn)最佳，菌絲長勢旺盛、潔白濃密。

由表16可知，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-天門冬氨酸的濃度在0.1～10 mg/L范圍內(nèi)，L-天門冬氨酸對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為1 mg/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與其他添加濃度相比都存在顯著差異，而當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-天門冬氨酸的濃度達(dá)到1 000 mg/L時菌絲生長受到抑制。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-天門冬氨酸，隨著添加濃度的增加菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢。從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看(圖10)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度0.1～10 mg/L的L-天門冬氨酸時，菌落菌絲的色澤和長勢都要優(yōu)于對照組，其中添加濃度為1 000 mg/L時菌絲稀疏、長勢弱，同時菌落開始變紅。

表15 L-谷氨酸對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 15 Effect of L-glutamic acid on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖9 菌落形態(tài)(20 d, L-谷氨酸) Fig.9 Colony morphology (20 days, L-glutamic acid)

表16 L-天門冬氨酸對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 16 Effect of L-aspartic acid on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

圖10 菌落形態(tài)(20 d, L-天門冬氨酸)Fig.10 Colony morphology (20 days, L-aspartic acid)

由表17可知在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-天冬酰胺，隨著添加濃度的增加菌絲生長速度呈先上升后下降的變化趨勢?；A(chǔ)培養(yǎng)基中添加L-天冬酰胺的濃度在0.1～100 mg/L范圍內(nèi)，L-天冬酰胺對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，其中添加濃度為100 mg/L時對菌絲生長促進(jìn)效果最明顯，與其他添加濃度的菌絲生長速度相比都存在顯著性差異。從菌絲長勢和菌落形態(tài)來看(圖11)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度10～100 mg/L的L-天冬酰胺時，菌落菌絲的濃密度和長勢都要優(yōu)于其他添加濃度，其中添加濃度為100 mg/L時菌落特征表現(xiàn)最佳，菌絲長勢旺盛、潔白濃密。

表17 L-天冬酰胺對紅托竹蓀菌絲生長速度和長勢的影響Table 17 Effect of L-asparagine on mycelial growth rate and growth of P. rubrovolvatus

3 結(jié)論和討論

通過研究原生境中不同竹子的根、莖、葉對紅托竹蓀菌絲生長的影響，并結(jié)合根、莖、葉中礦質(zhì)元素和氨基酸含量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種礦質(zhì)元素(Ca、Mn、Zn、Fe)及6種氨基酸(天冬酰胺、天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和絲氨酸)與紅托竹蓀菌絲生長速度呈顯著正相關(guān)；進(jìn)一步采用單因素試驗(yàn)分別驗(yàn)證相關(guān)性物質(zhì)對菌絲生長的影響，結(jié)果表明，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度相關(guān)性物質(zhì)對菌絲生長均有促進(jìn)作用，Zn2+的最適添加濃度為20 μmol/L，F(xiàn)e3+的最適添加濃度為10 μmol/L，Mn2+的最適添加濃度為100 μmol/L，Ca2+的最適添加濃度為10 mmol/L，D-丙氨酸的最適濃度為10 mg/L，DL-絲氨酸的最適添加濃度為10 mg/L，L-蘇氨酸的最適添加濃度為100 mg/L，L-谷氨酸的最適添加濃度為100 mg/L，L-天門冬氨酸的最適添加濃度為1 mg/L，L-天冬酰胺的最適添加濃度為100 mg/L。

圖11 菌落形態(tài)(20 d, L-天冬酰胺)Fig.11 Colony morphology (20 days, L-asparagine)

礦質(zhì)元素可作為酶的組成部分并維持酶的活性，馮光志等[18]在對平菇的研究中發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加Zn2+可通過調(diào)節(jié)羥甲基纖維素酶的分泌來促進(jìn)菌絲生長；胡越等[19]對糙皮側(cè)耳的研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的Mn2+可提高漆酶和錳過氧化物酶的活性；而漆酶、錳過氧化物酶和羥甲基纖維素酶主要降解木質(zhì)纖維素[20-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，竹子培養(yǎng)基中Mn、Zn的含量與紅托竹蓀菌絲生長速度存在顯著相關(guān)性，由此推測紅托竹蓀菌絲生長可能受錳過氧化物酶、漆酶和羥甲基纖維素酶等胞外酶分解利用竹子木質(zhì)纖維素的影響。另外，添加適量的Fe3+、Ca2+對紅托竹蓀菌絲生長有促進(jìn)作用，具體生理生化響應(yīng)機(jī)制尚不明確。潘維新，付庭治[23]的研究發(fā)現(xiàn)，鐵元素能增加食用菌菌絲細(xì)胞膜的透性，促進(jìn)細(xì)胞膜脂透入，再與細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合，形成蛋白鐵或多糖鐵。在高植物研究中通過添加外源Ca2+可提高體內(nèi)活性氧清除酶活性并降低丙二醛的含量，緩解鹽脅迫對植物細(xì)胞膜的損害，從而維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和功能性[24]；丁曉[25]的研究發(fā)現(xiàn)，添加外源Ca2+對香菇菌絲生長有同樣的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定濃度Ca2+、Zn2+、Fe3+和Mn2+均能促進(jìn)紅托竹蓀菌絲的生長，低濃度時，菌絲生長速度隨礦質(zhì)元素添加濃度的增加而升高，而當(dāng)添加濃度達(dá)到一定高濃度時菌絲生長受到抑制，甚至死亡，與糙皮側(cè)耳[26]、真姬菇[27]和金針菇[28]等食用菌研究的結(jié)果類似。礦質(zhì)元素除了作為酶的組成部分并維持酶的活性外，還能調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素含量過高，必然造成食用菌生長環(huán)境的高滲透壓，而大部分食用菌在高滲透的培養(yǎng)基上代謝活動降低，從而導(dǎo)致菌絲生長受抑制[29]。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是生物體不可缺少的重要營養(yǎng)之一，本研究結(jié)果表明，紅托竹蓀菌絲可以很好地吸收利用D-丙氨酸、DL-絲氨酸、L-天門冬氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬酰胺這六種氨基酸，菌絲生長都呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的趨勢，這與添加外源氨基酸對黑木耳和黑牛肝菌等食用菌菌絲生長影響的研究結(jié)果類似[30-31]。常婷婷[32]研究表明，添加丙氨酸、絲氨酸和天冬酰胺3種外源氨基酸復(fù)配溶液能明顯提高香菇菌絲轉(zhuǎn)氨酶活性并減少丙二醛的積累；轉(zhuǎn)氨酶是氨基酸代謝中的重要酶，其活性的高低可以反映生物體氮代謝的強(qiáng)弱，從而影響生物體的蛋白質(zhì)代謝和生長發(fā)育；另外聚天門冬氨酸同源多肽分子末端的氨基和羧酸官能團(tuán)與金屬離子配位結(jié)合形成植物易吸收的形式[33]，從而提高了植物對礦質(zhì)元素的利用。本課題組前期研究表明，礦質(zhì)元素對紅托竹蓀菌絲生長影響顯著，推測氨基酸對紅托竹蓀菌絲生長的影響可能與礦質(zhì)元素的吸收利用有關(guān)。NADPH氧化酶是一個多亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合物，可催化胞外O2生成超氧陰離子，并以此為基礎(chǔ)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)[34]，ROS 在細(xì)胞中發(fā)揮著雙重作用：適量的ROS可防御調(diào)節(jié)細(xì)胞受到的脅迫，過量則會造成細(xì)胞組分的損傷，影響細(xì)胞正常生命活動的進(jìn)行[35]；李銀鳳，劉曉柱[36]對平菇和雙色臘蘑2種食用菌中NADPH氧化酶A蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，A蛋白質(zhì)中存在著大量絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)。外源絲氨酸和蘇氨酸是否通過調(diào)節(jié)NADPH氧化酶的活性來影響紅托竹蓀菌絲生長有待進(jìn)一步研究。