姚新轉(zhuǎn)，陳凌霄，張寶會(huì)，呂立堂

(1.貴州大學(xué)茶學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

茶樹(Camelliasinensis(L.) O. Ktze.)是我國最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物之一，茶是世界三大主要飲品之一，茶中含有許多對人體有益的成分，如：氨基酸、茶多酚、咖啡堿和芳香物質(zhì)等，具有調(diào)節(jié)人體精神狀態(tài)，提高人體免疫力和抗菌消炎的作用。隨著對茶葉的深入研究，β-葡萄糖苷酶對提高茶葉品質(zhì)和茶樹抗性育種的重要性不斷被發(fā)掘，成為了非常熱門的茶葉研究領(lǐng)域。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGLU)屬于水解酶，能夠催化水解芳香基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖釋放。經(jīng)過加熱處理后的茶葉勻漿物加入β-葡萄糖苷酶會(huì)有芳樟醇、香葉醇的生成，可以推測出在茶葉中有以葡萄糖苷形式存在的芳樟醇、香葉醇的香氣前體[1]。香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[2]，茶葉香型主要是栗香、青草香、清香、高香、花果香、甜香和高火香等[3-4]，茶葉含有醇類、脂類、醛類、酮類以及含氮化合物等十余類香氣成分，目前已從茶葉中分離出700多種香氣物質(zhì)[5]，香氣形成的途徑主要有四個(gè)：其一，兒茶素氧化作用及類胡蘿卜素經(jīng)過偶聯(lián)氧化降解形成醇及醛類物質(zhì)組成的多種香氣成分，類胡蘿卜素氧化降解形成紫羅蘭酮系等香氣物質(zhì)[6]；其二，脂肪酸過氧化及降解途徑形成青葉醇、己烯醛等化合物[7]；其三，氨基酸的脫氨脫羧和美拉德反應(yīng)形成醛類芳香物質(zhì)[8]；最后，利用糖苷類香氣前體在葡萄糖苷酶的作用下水解生成相應(yīng)的醇類[9]。白茶萎凋時(shí)間比較長，這一階段是茶葉加工中品質(zhì)形成的重要過程[10]，鮮葉隨著萎凋開始大量失水，茶葉中水解酶類活性提高，各種氧化還原反應(yīng)和水解反應(yīng)在葉片內(nèi)部不斷進(jìn)行著，推動(dòng)白茶品質(zhì)的形成[11]。β-葡萄糖苷酶的活性直接影響茶葉的品質(zhì)，這些物質(zhì)在茶葉深加工和制藥領(lǐng)域也起著重要的作用。

茶樹生長發(fā)育過程和茶葉產(chǎn)量都會(huì)受到各種生物和非生物脅迫影響，如干旱、高溫、寒冷等不同的逆境脅迫。在茶樹的進(jìn)化過程中，茶樹可以感受到外界脅迫傳遞的信號，從而調(diào)控茶樹內(nèi)部酶的活性，在一定程度上抵消逆境脅迫帶來的危害，因此通過挖掘這種抗性基因來提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)，增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分關(guān)鍵。茶樹體內(nèi)可能存在含氰糖苷和含氰類脂物質(zhì)，當(dāng)茶樹受到破壞時(shí)，經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解釋放出氫氰酸，對生物脅迫和病原真菌有抗性作用[12]， 在許多植物中，BGLU基因都以基因家族的方式存在染色體中，參與細(xì)胞壁木質(zhì)化、酶活性的調(diào)控、信號的傳導(dǎo)以及激素的活化等生理過程[13-14]。在擬南芥中有48個(gè)BGLU基因[15]，在水稻中有40個(gè)BGLU基因[16]，擬南芥中的AtBGLU10可以催化產(chǎn)生游離的ABA，以此來提高植物的抗干旱和抗鹽脅迫能力[17]，而水稻OsBGLU基因也會(huì)受到干旱和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[18]，說明BGLU基因在茶樹的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中有著很重要的作用。

通過對茶樹基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從茶樹基因組中鑒定到BGLU基因，并對該基因家族成員的蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系、染色體定位等進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)分析了茶樹BGLU家族成員在PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫、茉莉酸甲酯處理、鹽脅迫、冷脅迫處理中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為茶樹BGLU家族基因機(jī)制和抗逆響應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA(http://tpia.teaplant.org/)、植物基因組數(shù)據(jù)庫(https://plants.ensembl.org/index.html)、擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)中下載茶樹、擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)，包括基因組注釋、CDS、染色體定位、蛋白結(jié)構(gòu)等信息，用于茶樹BGLU基因家族的生物信息學(xué)分析。

1.2 茶樹BGLU基因家族的篩選與分析

利用TBtools上的BLAST功能，結(jié)合茶樹基因組(http://tpia.teaplant.org)及NCBI((http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫確定BGLU基因的CDS序列、蛋白序列；將蛋白序列上傳到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件分析其保守結(jié)構(gòu)域；利用Expasy(https://web.expasy.org/protparam/)上的ProtParam工具預(yù)測BGLU蛋白序列的蛋白長度(Length)、分子量(MW)、等電點(diǎn)(PI)。從茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中提取CDS、基因組DNA等信息；最后通過亞細(xì)胞定位分析軟件WoLF PSORT II(https://www.genscript.com/tools/wolf-psort)預(yù)測該蛋白在細(xì)胞中的定位情況。

1.3 茶樹BGLU基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序分析

將29個(gè)茶樹BGLU基因的CDS序列輸入GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)中分析其基因結(jié)構(gòu)，再由MEME(http://meme-suite.org/)分析29個(gè)茶樹BGLU基因的保守結(jié)構(gòu)域，motif數(shù)目設(shè)置為15個(gè)，motif寬度設(shè)置6～50，利用TBtools繪制保守結(jié)構(gòu)基序的圖片。

1.4 茶樹BGLU系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI中下載擬南芥和茶樹的BGLU基因家族蛋白序列，并利用Clustal W軟件對FtsH蛋白進(jìn)行多序列比對，分析BGLU基因家族的進(jìn)化關(guān)系。對29個(gè)茶樹和35個(gè)擬南芥的BGLU蛋白序列進(jìn)行分析，在MEGA 7.0軟件中采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展值為1 000，導(dǎo)出進(jìn)化樹結(jié)果，使用PS軟件進(jìn)行進(jìn)化樹編輯與美化。

1.5 茶樹BGLU染色體定位及分布

通過對茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA(http://tpia.teaplant.org/)的分析，利用HMM 3.0軟件中的perl 腳本從茶樹的基因組中獲取BGLU基因的信息，BGLU的基因名稱根據(jù)其在染色體上的位置順序進(jìn)行命名。BGLU基因的染色體定位信息來源于茶樹基因組數(shù)據(jù)庫，利用MapInspect軟件對茶樹染色體上的BGLU基因進(jìn)行定位。

1.6 茶樹BGLU基因家族順式作用元件分析

從茶樹的基因組中尋找到BGLU基因啟動(dòng)子起始密碼子上游的2 000 bp序列，再分別提交至在線分析軟件PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和SoftBerry (http://linux1.soft berry.com/all.htm) 進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)域可能含有的順式作用元件和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測。

1.7 茶樹BGLU基因表達(dá)模式分析

根據(jù)鑒定出的茶樹BGLU基因的編號，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)數(shù)據(jù)庫下載它們在茶樹不同組織(包括頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、莖、根、果)、鹽脅迫、冷脅迫、PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫和MeJA處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(TPM值)，結(jié)果使用TBtools軟件制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹BGLU基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)預(yù)測

通過擬南芥、茶樹基因組數(shù)據(jù)BLASTP比對出來的假設(shè)CsBGLU基因提交到NCBI-CDD在線網(wǎng)站進(jìn)行保守域的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證，最終得到了29個(gè)茶樹BGLU基因，并根據(jù)基因在染色體的位置及其同源關(guān)系將其命名。進(jìn)一步對茶樹BGLU基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析(表1)，結(jié)果顯示，茶樹最長的BGLU蛋白是CsBGLU 06，最短的蛋白是CsBGLU 29；相對分子量在11.5(CsBGLU 28和CsBGLU 29)～62.4 kD(CsBGLU 14和CsBGLU 15)；理論等電點(diǎn)(Pi)介于4.56(CsBGLU 27)～9.34(CsBGLU 19)之間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Pi<7的CsBGLU 蛋白達(dá)到了62.52%(19個(gè))以上，表明大部分CsBGLU蛋白富含酸性氨基酸。BGLU基因家族成員外顯子數(shù)目也不同(表2)，不同BGLU基因之間外顯子數(shù)目的變化，體現(xiàn)了該基因受到環(huán)境影響的程度不同，經(jīng)歷了不一樣的進(jìn)化歷程。根據(jù)亞細(xì)胞定位可知茶樹BGLU基因大部分都定位在液泡中，而CsBGLU 28、CsBGLU 29基因定位在細(xì)胞核和液泡上。

2.2 茶樹BGLU基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序分析

根據(jù)茶樹BGLU基因組DNA序列和CDS序列提交至GSDS 2.0的結(jié)果進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，通過 MEME進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，利用TBtools繪制基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序。根據(jù)圖1可知，茶樹BGLU家族有一定的保守性，至少有15個(gè)保守基序(Motif)，由圖可知CsBGLU的基序個(gè)數(shù)由2個(gè)(CsBGLU 26、CsBGLU 27、CsBGLU 28、CsBGLU 29)到15個(gè)(CsBGLU 01、CsBGLU 02、CsBGLU 09、CsBGLU 10)，Motif 1～Motif 15廣泛分布在茶樹BGLU基因中， CsBGLU 10和CsBGLU 11擁有相同的保守基序， CsBGLU 14和CsBGLU 15也擁有相同的保守基序， Motif 7除了CsBGLU 17、CsBGLU 18、CsBGLU 19、CsBGLU 21、CsBGLU 23、CsBGLU 24和CsBGLU 25不存在之外在其他CsBGLU都有， Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5、Motif 6、Motif 7、Motif 8、Motif 10、Motif 12和Motif 15分布于大部分茶樹CsBGLU基因中，結(jié)果說明這些基序在茶樹BGLU基因中發(fā)揮著重要的作用。

表1 茶樹BGLU基因家族基因的特征Table 1 Characteristics of BGLU gene family genes in tea

2.3 茶樹BGLU系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究茶樹BGLU基因家族成員的分類，將47個(gè)擬南芥、35個(gè)煙草BGLU的蛋白序列與篩選得到的29條茶樹BGLU蛋白，總共111個(gè)BGLU蛋白進(jìn)行多序列比對并構(gòu)建進(jìn)化樹(圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙草、茶樹BGLU基因在四個(gè)亞家族中都有分布，說明茶樹BGLU基因和擬南芥同源性很高，BGLU基因物種分化非常保守，蛋白序列的相似性表明這兩個(gè)物種的BGLU基因可能具有相似的生物學(xué)功能。根據(jù)擬南芥的同源基因分類，將擬南芥、煙草和茶樹BGLU基因家族分為四個(gè)亞家族，茶樹BGLU在GroupⅠ～Group Ⅳ亞家族分別有2、11、7、9個(gè)成員。

2.4 茶樹BGLU基因染色體定位及分布

為了解茶樹BGLU基因染色體定位分布情況，將鑒定到的29個(gè)CsBGLU基因與茶樹基因組數(shù)據(jù)庫TPIA比對分析，獲取CsBGLU基因在染色體上的起始位置信息，利用TBtools軟件繪制染色體定位(圖3)。結(jié)果顯示，CsBGLU 04、CsBGLU 24、CsBGLU 28基因不能定位到染色體上，其他26個(gè)CsBGLU基因都能定位到染色體上，其中Chr 7號染色體包含基因個(gè)數(shù)最多，有7個(gè)CsBGLU基因，分別是CsBGLU 10、CsBGLU 11、CsBGLU 12、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 16、CsBGLU 20；而Chr 1、Chr 2、Chr 13號染色體上最少，都只有一個(gè)CsBGLU基因，分別是CsBGLU 13、CsBGLU 08、CsBGLU 17；Chr 4、Chr 9、Chr 10號染色體不含CsBGLU基因。

表2 BGLU基因家族外顯子數(shù)目及占比Table 2 The exon numbers and proportion of BGLU gene family

2.5 茶樹BGLU基因家族順式作用元件分析

為探究茶樹BGLU基因家族順勢作用元件情況，將鑒定到的29條CsBGLU基因利用plant CARE軟件確定順勢作用元件，結(jié)果用Excel軟件制作表格(表3)。結(jié)果表明，大多數(shù)CsBGLU基因還含有脫落酸、赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯、水楊酸等激素類順式作用元件，還有響應(yīng)高溫、低溫、鹽、干旱、冷脅迫的順式作用元件，除此之外還有參與晝夜控制的順式作用元件，參與分生組織表達(dá)的順式作用元件，參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的順式作用元件，比如：有72.4%的成員含有干旱脅迫應(yīng)答元件，有58.6%的成員含有脫落酸應(yīng)答件，說明CsBGLU基因在參與茶樹生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中具有重要的意義。

圖2 茶樹和擬南芥BGLU基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic trees of BGLU gene families in tea and Arabidopsis thaliana

2.6 茶樹BGLU基因表達(dá)模式分析

為了解茶樹BGLU基因家族的表達(dá)情況，從TPIA數(shù)據(jù)庫下載它們在茶樹八大組織(花、根、莖、嫩元葉、成熟葉、老葉、頂芽、果實(shí))的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，結(jié)果使用TBtools軟件制作熱圖(圖4)。結(jié)果顯示，CsBGLU在多種組織中均有表達(dá)，如：CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 06、CsBGLU 08、CsBGLU 09、CsBGLU 13、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20在所有組織中均具有較高的表達(dá)水平，而CsBGLU 02、CsBGLU 05、CsBGLU 17、CsBGLU 19、CsBGLU 21、CsBGLU 22、CsBGLU 27在各組織表達(dá)水平較低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)CsBGLU 14、 CsBGLU 15和CsBGLU 20在各組織中表達(dá)量較高且數(shù)值相同，而CsBGLU 24、CsBGLU 25、CsBGLU 28和CsBGLU 29在各組織中表達(dá)量較低且數(shù)值也一樣。相對其他基因而言，CsBGLU 01在葉、頂芽和莖中的表達(dá)水平比在其他組織的高，并且它的表達(dá)量隨著葉片的成熟度增加呈現(xiàn)下降趨勢，但是該基因在果實(shí)表達(dá)量低。由此可見不同CsBGLU基因參與到茶樹不同部位的生長過程。

圖3 茶樹BGLU基因的染色體位點(diǎn)Fig.3 Chromosome loci of BGLU gene in tea tree

圖4 茶樹BGLU基因在不同組織中表達(dá)模式Fig.4 The expression pattern of tea BGLU genes in different tissues

本研究對茶樹BGLU基因在PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫(0、24、48、72 h)、鹽脅迫處理(0、24、48、72 h)平均溫度達(dá)到10 ℃以上，茉莉酸甲酯處理(0、24、48 h)以及冷處理(非馴化ck;最低點(diǎn)，完全馴化CA 1;平均溫度達(dá)到10 ℃以上，去馴化CA 3)后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果顯示，在干旱脅迫下，與其他基因的表達(dá)水平相比，CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 08、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表達(dá)量在0 h都較高，在24 h后受到了干旱抑制，48 h后表達(dá)量有所上升，最后在72 h下降；CsBGLU 06基因的表達(dá)量在干旱下被抑制(圖5 A)。

表3 茶樹BGLU順式作用元件分析Table 3 Cis-elements analysis of tea BGLU genes

在鹽脅迫處理下，CsBGLU 01、CsBGLU 03、CsBGLU 06、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 17、CsBGLU 20等基因的表達(dá)量在鹽脅迫下被抑制；CsBGLU 09基因受鹽脅迫時(shí)表達(dá)量急劇增高，隨著時(shí)間延長，在48 h和72 h慢慢下降；CsBGLU 08基因在24 h和48 h鹽脅迫下都具有較高的表達(dá)量，在72 h表達(dá)量大幅度降低；CsBGLU 10、CsBGLU 11、CsBGLU 16的表達(dá)量在24 h被顯著誘導(dǎo)上調(diào)，而在48 h和72 h時(shí)下調(diào)(圖5 B)。

在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下，CsBGLU 08、CsBGLU 12、CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表達(dá)量在12 h和24 h受到抑制，而在48 h被誘導(dǎo)上調(diào)，總體呈先降低后升高的趨勢；而CsBGLU 17的表達(dá)水平在MeJA 處理后的12 h或24 h時(shí)誘導(dǎo)上調(diào)，而在48 h時(shí)受到抑制；CsBGLU 01基因在MeJA處理過程中的表達(dá)量較高，在48 h的表達(dá)量最高；同時(shí)發(fā)現(xiàn)CsBGLU 03、CsBGLU 06的表達(dá)量波動(dòng)不大，受 MeJA 處理的影響較小(圖 5 C)。

在冷處理下，CsBGLU 14、CsBGLU 15、CsBGLU 20的表達(dá)量在CA 1被小幅度誘導(dǎo)上調(diào)，在CA 3急劇上調(diào)；CsBGLU 08的表達(dá)量在CA 1和CA 3時(shí)都受到抑制；CsBGLU 24、CsBGLU 25、CsBGLU 28、CsBGLU 29的表達(dá)量在CA 1被抑制，在CA 3急劇上升；CsBGLU 07、CsBGLU 13、CsBGLU 23、CsBGLU 26的表達(dá)量在CA 1誘導(dǎo)上調(diào)，在CA 3受到抑制(圖5 D)。

圖5 BGLU基因在干旱(A)、鹽(B)、茉莉酸甲酯(C)和冷(D)脅迫下的表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of BGLU gene under drought (A), salt (B), methyl jasmonate (C) and cold (D) stress

3 討論與結(jié)論

該研究在全基因組水平上一共鑒定到29個(gè)茶樹CsBGLU基因。CsBGLU基因等電點(diǎn)范圍(PI)介于4.56(CsBGLU 27)～9.34(CsBGLU 19)之間，同時(shí)發(fā)現(xiàn)PI<7的CsBGLU 蛋白達(dá)到了62.52%(19個(gè))以上，表明大部分CsBGLU蛋白富含酸性氨基酸，可能會(huì)在酸性環(huán)境下發(fā)揮重要作用。通過亞細(xì)胞定位可知BGLU基因大部分都定位在液泡上，有部分定位在細(xì)胞核。將煙草、茶樹BGLU基因進(jìn)行多序列比對構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，并分為4個(gè)亞家族，由圖2可知，茶樹BGLU基因在4個(gè)亞家族中都有分布，說明煙草、茶樹BGLU基因同源性很高；茶樹BGLU基因分布在7號染色體上的基因最多，有7個(gè)；從茉莉酸甲酯、冷脅迫、鹽脅迫、PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到熱圖了解到，當(dāng)茶樹受到各種脅迫時(shí)BGLU基因表達(dá)量的改變有助于發(fā)掘更多的抗脅迫基因。

茶樹是多年生植物，同樣是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在茶樹的生長發(fā)育中，會(huì)受到環(huán)境和人為的影響。BGLU基因在茶樹生長發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫中具有重要的作用，而目前為止對茶樹BGLU基因家族的研究還未見報(bào)道，所以本研究根據(jù)生物信息學(xué)分析，了解到茶樹BGLU基因廣泛參與到茶樹的生長發(fā)育和逆境脅迫，對茶樹BGLU基因家族的每個(gè)成員進(jìn)行鑒定，篩選出對脅迫具有敏感性的基因，為深入了解β-葡萄糖苷酶在提高茶葉品質(zhì)和茶樹抗性育種中的作用奠定了基礎(chǔ)。