王 斌，張 梟 ，張公贏，湯 真，賀子唯，田君哲，姚智卿，田 露，李士林

（1. 上海市公安局浦東分局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，上海 200120；2.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院人類學(xué)與人類遺傳學(xué)系，上海 200438；3.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院現(xiàn)代人類學(xué)教育部重點實驗室，上海 200438）

Y染色體非重組區(qū)（non-recombining region,NRY）遺傳標(biāo)記具有父系遺傳、單倍型等特點，是研究人類進(jìn)化、群體遺傳學(xué)、法醫(yī)遺傳學(xué)的理想標(biāo)記[1]。Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列（Y-short tandem repeat, Y-STR）和 單 核 苷 酸 多 態(tài) 性（Y-single nucleotide polymorphism, Y-SNP）是NRY區(qū) 兩 種重要的遺傳標(biāo)記，其中，利用Y-SNP單倍群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行單倍群劃分是進(jìn)行地理祖先和種群推斷的主要手段之一[2]。Y-SNP單倍群在不同地區(qū)和人群中的分布均表現(xiàn)出一定的特征性，根據(jù)未知來源男性樣本的Y-SNP單倍群，可推斷其地理來源或所屬的群體[3]；也可以利用高分辨率Y-SNP單倍群結(jié)合Y-STR單倍型進(jìn)行家系溯源，起到輔助司法案件偵破的作用，故具有重要的法醫(yī)學(xué)意義[4]。

上海浦東地區(qū)是其東南沿海的一座半島，為黃浦江東部地區(qū)的統(tǒng)稱。據(jù)2020年人口普查結(jié)果，浦東地區(qū)人口已達(dá)568萬余。本研究應(yīng)用Yf iler?Platinum PCR擴(kuò)增試劑盒[5]（美國Thermo Fisher Scientif ic公司）對上海浦東地區(qū)漢族的38個Y-STR基 因 座（DYS19，DYS389I，DYS389II，DYS390，DYS391，DYS392，DYS393，DYS437，DYS438，DYS439，DYS444，DYS447，DYS448，DYS449，DYS456，DYS458，DYS460，DYS481，DYS518，DYS522，DYS533，DYS549，DYS557，DYS570，DYS576，DYS593，DYS596，DYS627，DYS635，DYS643，DYS645，YGATAH4，DYS385a/b，DYS527a/b，DYS387S1a/b）進(jìn) 行 基 因 分 型，采用Y-SNP家系標(biāo)記試劑盒（中國閱微基因公司）[4]分析24個Y-SNP 位點，定義11個主要單倍群和13個亞單倍群，主要單倍群包括E-M96、D-JST021355、N-M231、C-M130、O-P186、I-M170、IJ-M429、K-M9、QR-M45、G-M201、IJK-M522；亞單倍群細(xì)枝包括D1a1a1-N1、D1a2a-P47、O1a-M119、O1b-M268、O1b2-M176、O2-M122、O2a1-KL1、O2a2-P201、O2a2b-P164、O2a2a1a2-M7、O2a2b1a1- M117、C2-M217、N1a1-M46。Y-STR和Y-SNP聯(lián) 合 分析，實現(xiàn)了對上海浦東漢族人群遺傳多態(tài)性的深度解析，提高了鑒別能力，擴(kuò)大了遺傳信息含量，能夠滿足不同案件需要，以及為群體遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 樣本

采集上海市浦東地區(qū)500名漢族男性無關(guān)個體的血液樣本并存留于FTA血樣采集卡上（英國Whatman公司）。本研究所有男性無關(guān)個體均為至少三代以上世居的本地人，基于知情同意原則，浦東地區(qū)的研究對象（n=500）均簽署了知情同意書。本研究所有內(nèi)容均由復(fù)旦大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過（批準(zhǔn)編號為BE1806）。

1.2 實驗方法

使用打孔器將DNA血卡樣本剪切成1 mm2大小，采用Chelex-100法提取基因組DNA。使用Yf iler? Platinum PCR擴(kuò)增 試 劑 盒分析所選38個Y-STR基因座。采用Y-SNP家系標(biāo)記試劑盒對24個Y-SNP位點進(jìn)行基因分型。擴(kuò)增實驗分別按照試劑盒說明書完成。使用9700型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以3500xL基因分析儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離。分型結(jié)果使用軟件GeneMapperTMID-X（美國Applied Biosystems公司）分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

直接計算浦東漢族人群38個Y染色體STR基因座的等位基因數(shù)量、等位基因頻率。采用R Studio軟 件（R語 言 版 本 號4.1.2，https://www.rstudio.com）計算法醫(yī)學(xué)參數(shù)：單倍型匹配概率（haplotype match probability, HMP）、鑒別能力（discrimination capacity, DC）、獨特單倍型比例（fraction of unique haplotype, FUH），單倍型多樣性（haplotype diversity,HD）。有關(guān)數(shù)據(jù)與其他群體共有的27個Y-STR基因座進(jìn)行比較，使用Arlequin軟件計算群體間成對遺傳距離Rst。

使用R Studio軟件中的“MASS”軟件包進(jìn)行多維尺度分析。應(yīng)用EA-Ypredictor軟件[6]對38個Y-STR基因座進(jìn)行單倍群預(yù)測，采用ARMS-PCR驗證預(yù)測的準(zhǔn)確性。直接計算浦東漢族人群單倍群頻率分布結(jié)果并與其他參考人群進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 Y-STR遺傳多態(tài)性

本研究Y-STR基因分型體系包括32個單拷貝基因座和3個多拷貝基因座（DYS385a/b、DYS527a/b、DYS387S1a/b）。單倍型數(shù)據(jù)見補充材料表S1，經(jīng)直接計算得到的基因頻率的結(jié)果見補充材料表S2。

浦東漢族人群32個單拷貝Y-STR基因座共檢測出240個“等位”基因，基因頻率分布為0.002 0～0.958 0。在多拷貝基因座DYS385a/b、DYS527a/b、DYS387S1a/b分別檢測出62、37、46種單倍型，單倍型頻率分布在0.002 0～0.160 0之間。經(jīng)計算，38個基因座在浦東漢族人群中的單倍型多樣性（HD）為0.999 943 9，匹 配 概 率（HMP）為0.002 056，鑒別能力（DC）為0.986 0，獨特單倍型比例為（FUH）0.972 0。在DYS458、DYS448、DYS627、DYS518、DYS385a/b基因座中觀察到有中間基因分型的現(xiàn)象，在多拷貝基因座DYS527a/b、DYS385a/b、DYS387S1a/b則有多基因分型模式存在（中間基因分型和多基因分型均經(jīng)重復(fù)三次實驗驗證）。38個Y-STR基因座的GD值計算結(jié)果見表1，其分布在0.081 1（DYS645）～0.952 3（DYS387S1a/b）之間。在浦東漢族人群中共檢出493種單倍型，其中，486種單倍型為唯一分型，7種單倍型檢出2次。

表1 38個Y-STR基因座在浦東地區(qū)漢族人群中的基因多樣性 (n=500)Table 1 Genetic diversity of Y-STR loci from Chinese Han-ethnic population in Shanghai Pudong area (n=500)

2.2 Y-SNP遺傳多態(tài)性

本研究Y-SNP基因分型體系包括24個Y-SNP標(biāo)記。單倍群結(jié)果見表2。浦東漢族的主要單倍群結(jié)果為：C單倍群6.80%、D單倍群1.60%、N單倍群6.80%、O單倍群82.60%、QR單倍群2.20%。詳細(xì)單倍群結(jié)果為：C2-M217（6.80%）、D1a1a1-N1（1.60%）、N1a1-M46（2.00%）、N-M231（4.80%）、O1a-M119（25.2%）、O1b2-M176（0.20%）、O1b-M268（7.00%）、O2a1-KL1（21.40%）、O2a2a1a2-M7（2.00%）、O2a2b1a1-M117（12.20%）、O2a2b-P164（10.60%）、O2a2-P201（1.80%）、O2-M122（2.20%）、QR-M45（2.20%）。

表2 浦東地區(qū)500名漢族人群的Y-SNP單倍群Table 2 Y-SNP haplogroups from 500 unrelated Han-ethinc individuals in Pudong area

2.3 浦東漢族與25個群體遺傳差異分析

根據(jù)浦東漢族和其他25個參考人群的共有Y-STR基因座“等位”基因頻率，計算成對遺傳距離Rst?；诔蓪z傳距離進(jìn)行多維尺度英文分析，結(jié)果見圖1。北方漢族參考人群包括黑龍江[7]、陜西[8]、內(nèi)蒙古、山東[9]、河南[7]、長春[10]、遼寧[11]等地漢族群體；南方漢族參考人群包括上海[12]、浙江[13]、江蘇[14]、江西[7]、安徽[15]、寧波、重慶[16]、云南[4]、廣東[17]、深圳、貴州[18]、四川[19]、廣西[7]等地漢族群體。少數(shù)民族參考人群選擇寧夏回族[20]、貴州苗族[21]。外部人群（Out Group）選自日本[22-23]和韓國[24]。未注明參考文獻(xiàn)的人群數(shù)據(jù)來源于YHRD數(shù)據(jù)庫[25]。

圖1 浦東漢族和其他25個參考人群多維尺度分析Fig.1 Multidimensional scaling plot with Pudong Han-ethnic population and 25 reference ones

北、南方漢族分別用三角形、圓形，少數(shù)民族群體用四角星，外部人群用方形，而上海浦東漢族則用紅色五角星表示。結(jié)果顯示，上海浦東漢族與江蘇漢族（Rst=0.000 9）和浙江漢族（Rst=0.000 9）的距離最近。在中國人群中，浦東漢族與廣西漢族的距離（Rst=0.064 9）最遠(yuǎn)。

MDS圖形整體呈現(xiàn)南北方人群分層，北方漢族人群（藍(lán)色圓圈內(nèi)）聚類關(guān)系更加緊密，南方漢族人群（綠色圓圈內(nèi)）聚類較為松散，這說明南方漢族人群相對于北方漢族人群在Y-STR基因座中有較大的遺傳變異。在南方漢族人群內(nèi)部，浦東漢族、江蘇漢族、江西漢族、上海漢族、浙江漢族更加接近。

2.4 EA-Ypredictor軟件預(yù)測及ARMS-PCR驗證Y-SNP單倍群

基于38個Y-STR基因座的分型結(jié)果，本研究使用EA-Ypredictor軟件進(jìn)行單倍群預(yù)測，得到預(yù)測單倍群。應(yīng)用Y-SNP家系標(biāo)記試劑盒進(jìn)行單倍群定義，得到其真實單倍群結(jié)果。

經(jīng)計算，主要單倍群預(yù)測準(zhǔn)確的樣本為488個、不準(zhǔn)確的12個，準(zhǔn)確率為97.60%。預(yù)測不準(zhǔn)確的12例樣本及其實際單倍群結(jié)果見表3。其他預(yù)測結(jié)果見補充材料表S1。

表3 12例預(yù)測錯誤樣本及實際檢驗結(jié)果Table 3 12 EA-Ypredictor-falsely-predicted samples ascribed into their erroneous and actual Y-SNP haplogroups

為了進(jìn)一步探究中國人群的單倍群分布的相關(guān)性和差異，基于已發(fā)表的論文數(shù)據(jù)[7,26-29]，本研究調(diào)查了其他15個中國人群主要單倍群的頻率，數(shù)據(jù)比較結(jié)果見圖2。

圖2 浦東漢族與中國其他15個人群的單倍群分布Fig.2 Haplogr oup distribution among the Pudong Han-ethnic population and other 15 ones in China

3 討論

本研究對浦東漢族人群的38個Y-STR基因座的遺傳多態(tài)性調(diào)查結(jié)果顯示，浦東漢族HD值為0.999 943 9，表明該38個Y-STR基因座聯(lián)合應(yīng)用可滿足對浦東漢族人群鑒別的需要。在38個Y-STR基因座中，有4個基因座的GD值低于0.5，分別是DYS391（0.412 2）、DYS437（0.445 9）、DYS438（0.377 3）、DYS645（0.081 1），其他基因座的GD值均大于0.5，這說明本研究所用的Y-STR基因分型體系有良好的遺傳多態(tài)性，適用于司法實踐個體識別和親緣鑒定。

基于遺傳距離Rst，本研究選擇了其他25個人群進(jìn)行多維尺度分析，聚類結(jié)果顯示出不同地域人群之間的親緣關(guān)系。從整體上看，26個人群可被劃分為四類：南方漢族（包括上海、浙江、江西、江蘇、安徽、寧波、重慶、云南、廣東、廣西、深圳、貴州、四川等地所選漢族），北方漢族（包括黑龍江、陜西、內(nèi)蒙古、山東、河南、長春、遼寧等地所選漢族），少數(shù)民族（貴州苗族和寧夏回族）以及外部人群（日本和韓國人群）。東南地區(qū)漢族（包括浙江、上海、江西、江蘇、浦東等地漢族）處于南北方漢族之間，但是更接近南方省份漢族。既往研究曾引入一個“中部漢族”的概念來定義東南中部地區(qū)漢族人群[30]，本研究結(jié)果也表明南方省份漢族的東南地區(qū)群體具有更緊密的遺傳關(guān)系，這也同時證明南北方人群有其內(nèi)部遺傳結(jié)構(gòu)[31]。

Yin等[32]對公開發(fā)表的Y染色體單倍群預(yù)測軟件進(jìn)行了比較，在主要單倍群的預(yù)測中，EAYpredictor的平均準(zhǔn)確率更高?；趯υ颇险淹ㄈ巳旱脑敿?xì)單倍群預(yù)測結(jié)果，EA-Ypredictor的表現(xiàn)更加突出，詳細(xì)單倍群預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)89.50%。本研究中EA-Ypredictor的主要單倍群預(yù)測準(zhǔn)確度達(dá)97.6%。未來投入到實際應(yīng)用中可快速地將主要單倍群區(qū)分，然后再進(jìn)行精細(xì)單倍群結(jié)構(gòu)的鑒定，以降低實驗成本，縮短實驗周期，提高鑒定效率。Y-STR單倍型數(shù)據(jù)庫在法醫(yī)學(xué)實戰(zhàn)中發(fā)揮著重要的作用，Y-STR作為男性特征性標(biāo)識服從單倍遺傳的特性并積累了相當(dāng)多的突變，Y-STR的平均突變率在3.35×10-3突變/遺傳標(biāo)記/代[33]，這樣高突變率的特征使得Y-STR在不同人群之間可能存在完全相同或相似的現(xiàn)象。2014年，Ballantyne等[34]收集了全球111個群體的1.4萬男性無關(guān)個體數(shù)據(jù)，基于17個Y-STR基因座，發(fā)現(xiàn)了地理位置不同的群體之間存在相同單倍型的情況。Wang等[35]比較了2萬例男性單倍型數(shù)據(jù)，揭示出不同的Y-SNP單倍群的Y-STR單倍型存在相同或相似的情況。Y-SNP的突變率約為3×10-8突變/遺傳標(biāo)記/代[33]。Y-STR的分化程度遠(yuǎn)高于Y-SNP，Y-STR的高突變率是不同單倍群之間存在相同或相似Y-STR單倍型的原因之一。在實際案件中，如果目標(biāo)Y-STR單倍型在數(shù)據(jù)庫中匹配到多個家系時，可以通過Y-SNP單倍群信息進(jìn)一步縮小家系范圍。也就是說，Y-SNP單倍群信息在Y-STR的基礎(chǔ)上能夠增加一個維度進(jìn)行個體識別。

以往的研究表明，中國漢族人群超過70%都是O單倍群[36]。在本研究中浦東漢族的O單倍群頻率是82.60%，和中國人群整體單倍群分布頻率一致。O單倍群可以繼續(xù)被劃分為兩個大支，主要分為O1和O2單倍群，這兩個單倍群占東亞男性的60%。中國漢族人群人口眾多，單倍群頻率數(shù)據(jù)可以反映出不同地理位置人群的遺傳差異。O1單倍群的分布受地理格局影響，其在北方省份低頻分布，幾乎都在20%以下；而在南方省份漢族人群中比較高頻，都在25%以上。本研究顯示浦東漢族O1單倍群占比32.40%。其中O1a-M119占比25.20%，是浦東漢族人群比例最高的單倍群。O1a-M119在中國東南沿海、侗傣族人群、臺灣原住民集中分布[37]。O1a-M119單倍群在人群中差別比較顯著，雖然山東省和上海浦東地區(qū)都是中國內(nèi)陸的半島，但是山東省O1a-M119的比例僅為3.0%[4]。以往的研究對O2單倍群下游的O2a2b-P164和O2a1-KL1的研究結(jié)果表明,O2a2b-P164在南方漢族的平均分布比例為21.54%[37]，在北方漢族分布則為34.11%，故O2a2b-P164能夠反映南北方人群的差異。而本研究中浦東漢族的O2a2b-P164和O2a2b1a1-M117單 倍 群 的 是22.8%，這個頻率分布的結(jié)果更符合南方漢族的特點。通過人群中Y-SNP頻率分布，可以推斷未知個體的生物地理來源，因而在面臨Y-STR單倍型比對無結(jié)果的案件時，Y-SNP數(shù)據(jù)或可提供有效線索。

綜上所述，上海浦東地區(qū)漢族人群38個Y-STR基因座有較高的遺傳多態(tài)性。Y-STR和Y-SNP的聯(lián)合分析，更精確地解析了浦東漢族人群的遺傳結(jié)構(gòu)，可為司法實踐的家系溯源和個體識別提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。本研究所獲得的Y-STR基因頻率和Y-SNP單倍群頻率數(shù)據(jù)還可為法醫(yī)學(xué)與群體遺傳學(xué)研究提供原始數(shù)據(jù)。

補充材料

與本文相關(guān)的補充數(shù)據(jù)見：1）http://www.xsjscifs.com/CN/abstract/abstract7035.shtml；2）http://www.xsjs-cifs.com/CN/abstract/abstract7036.shtml。