魏孫祥，陳惠香，胡 勝，趙一霞，石慧霞，季安全,*，孫啟凡,*

（1. 公安部鑒定中心，現(xiàn)場(chǎng)物證溯源技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；2. 山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001）

準(zhǔn)確識(shí)別案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)體液斑跡的組織屬性對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)的重建、案件性質(zhì)的確定等具有重要價(jià)值，是法醫(yī)物證學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容[1]。精液斑是法醫(yī)實(shí)踐中常見的生物檢材，強(qiáng)奸、猥褻等案件常常涉及精液鑒定。傳統(tǒng)的精液鑒定方法包括化學(xué)法、酶催化法、光譜法和免疫學(xué)法等，這些方法都有其局限性，如對(duì)檢材完整性要求高、靈敏度和特異性各異、檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定等[2]。微RNA（microRNA，miRNA）是一種長(zhǎng)度為18～25 nt的非編碼小分子RNA，其表達(dá)具有高保守性、時(shí)序性和良好的組織特異性，有望通過對(duì)其表達(dá)量的檢測(cè)為精斑確證提供一種分子生物學(xué)新途徑[3-5]。大量研究表明miR-891a-5p具有良好的精液特異性[6-8]，通過檢測(cè)其表達(dá)量可進(jìn)行精液鑒定；RNU6b在不同個(gè)體的不同體液類型中均具有較高的表達(dá)水平且相對(duì)穩(wěn)定，是目前基于miRNA的體液鑒定廣泛使用的內(nèi)參基因[3,9-10]。

本研究建立了可同時(shí)檢測(cè)miR-891a-5p和內(nèi)參基因RNU6b的雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)精液斑的100%準(zhǔn)確鑒別，具有很好的法醫(yī)學(xué)實(shí)踐與應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

數(shù)字PCR以QX200 AutoDG微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（Bio-Rad，美國(guó)）運(yùn)行，該設(shè)備包括自動(dòng)化微滴生成器、PX1 PCR反應(yīng)板熱封儀、帶96深孔反應(yīng)模塊的C1000 Touch熱循環(huán)儀和QX200微滴讀取器。

1.1.2 引物、探針設(shè)計(jì)與合成

miR-891a-5p、內(nèi)參基因RNU6b序列信息及引物探針序列見表1。本研究所用引物、探針為自行設(shè)計(jì)，由生工（上海）生物科技有限公司合成。

表1 miR-891a-5p、RNU6b序列信息及引物、探針序列Table 1 Sequences of miR-891a-5p and RNU6b and their primers/probes

1.1.3 樣本制備

本研究采集中國(guó)北方地區(qū)年齡在25～35歲無關(guān)志愿者的精液、外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌液樣本共107份，其中包括67份精液樣本、10份外周血樣本、10份月經(jīng)血樣本、10份唾液樣本、10份陰道分泌液樣本。樣本采集由公安部鑒定中心倫理委員會(huì)審查通過，所有志愿者均已簽署知情同意書。全部樣本采集按研究要求和相關(guān)操作規(guī)范進(jìn)行，制備處理后均儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和定量

按照miRNeasy Mini Kit（Qiagen，德國(guó)）操作說明書提取總RNA[11]，洗脫體積統(tǒng)一至30 μL；使用Nanodrop 2000c（Thermo Fisher Scientif ic, 美 國(guó)）測(cè)定總RNA的濃度和純度（A260/280）。

1.2.2 cDNA合成

按照TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit（Thermo Fisher Scientif ic, 美國(guó)）使用說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)體系為：dNTP mix（100 mmol/L total）0.15μL，MultiscribeTMRT enzyme（50 U/μL）1.00 μL，10 × RT Buffer 1.5 μL，RNase Inhibitor（20 U/μL）0.19 μL，miR-891a-5p逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物（1 μmol/L）、RNU6b逆轉(zhuǎn)錄引物（1 μmol/L）各0.75 μL，無核酸酶水5.66 μL，樣本5 μL。反應(yīng)條件為：16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min，4 ℃保持。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照（用無核酸酶水取代反轉(zhuǎn)錄酶）。

1.2.3 微滴式數(shù)字PCR方法的建立和優(yōu)化

1）生成微滴

雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)miR-891a-5p和內(nèi)參基因RNU6b，每24 μL反應(yīng)體系包括ddPCR Supermix for Probes（No dUTP）12 μL，cDNA 1.6 μL，特異性正向引物（終濃度900 nmol/L），通用反向引物（終濃度900 nmol/L），水解探針（終濃度250 nmol/L）。其中miR-891a-5p和RNU6b的引物配比為1∶1。設(shè)置陰性對(duì)照（使用去核酸酶的水代替cDNA作為模板）。將樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中，于自動(dòng)化微滴生成器生成微滴，并以另一96孔板接收生成的微滴。

2）PCR擴(kuò)增

將接收生成微滴的96孔板蓋膜、封膜，PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃、10 min，45個(gè)熱循環(huán)（94 ℃、30 s，62～56 ℃、60 s，72 ℃、30 s），98 ℃、10 min，4 ℃保持。升降溫速度為2.0 ℃/s。

3）讀取微滴

擴(kuò)增完畢后，在QX200微滴讀取器上讀取微滴數(shù)據(jù)，采用QuantaSoft Software v.1.7.4（Bio-Rad，美國(guó)）進(jìn)行數(shù)據(jù)收集與分析。包含10 000個(gè)以上微滴的反應(yīng)視作有效反應(yīng)，并用于數(shù)據(jù)分析。

4）檢測(cè)體系的優(yōu)化

主要從退火溫度、引物探針設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系中引物探針濃度、熱循環(huán)數(shù)等方面優(yōu)化檢測(cè)體系。使用帶96深孔反應(yīng)模塊的C1000 Touch熱循環(huán)儀溫度梯度功能進(jìn)行PCR擴(kuò)增退火溫度的優(yōu)化（62～56 ℃）。設(shè)置退火溫度梯度包括：62.0、61.6、60.9、59.8、58.4、57.3、56.5、56.0 ℃。

1.2.4 鑒別方法的建立

對(duì)全部107份樣本進(jìn)行miR-891a-5p和內(nèi)參基因RNU6b的雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)，其中：67份精液樣本（58份精液、9份精斑），40份非精液樣本（10份外周血、10份月經(jīng)血、10份唾液、10份陰道分泌液）。對(duì)精液樣本，42份取10 μL、16份取300 μL；另9份以50 μL制成精斑。外周血6份取10 μL、4份取500 μL。唾液6份取10 μL、4份取2 mL。月經(jīng)血和陰道分泌液經(jīng)剪取2 cm2衛(wèi)生棉提取制備。陽性微滴數(shù)小于2的反應(yīng)視為陰性[12-13]，拷貝數(shù)濃度計(jì)為“0”。對(duì)miR-891a-5p以及miR-891a-5p/RNU6b比值通過受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）作分析，根據(jù)曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve,AUC）確定本檢測(cè)體系鑒別能力以及最佳截?cái)嘀怠?/p>

1.2.5 鑒別方法的驗(yàn)證

1）靈敏度試驗(yàn)

3份精液樣本從1 μL開始2倍梯度稀釋，共8個(gè)梯度，稀釋后取1 μL進(jìn)行提取和檢測(cè)，即精液量分別為1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008 μL。同時(shí)使用金標(biāo)抗人精檢測(cè)試劑條PSA檢測(cè)以作比較。

2）模擬混合斑樣本的制備和檢測(cè)

3份精液樣本分別對(duì)應(yīng)3份外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌液樣本進(jìn)行1∶10、1∶50、1∶100混合斑的制作（外周血、月經(jīng)血、唾液固定為200μL，分別取20、4、2 μL精液于棉簽上進(jìn)行混合；陰道分泌液固定為2.5 cm2衛(wèi)生棉，分別取20、4、2μL精液與之混合），晾干后進(jìn)行檢測(cè)。

3）模擬降解精斑樣本的制備和檢測(cè)

模擬降解精斑樣本的條件設(shè)置包括室外環(huán)境、紫外燈照射和洗滌，每個(gè)測(cè)試條件下各3份樣本分別取50 μL于棉簽上晾干。

a）室外樣本：放置于室外自然露天條件下0、4、8、14 d后進(jìn)行檢測(cè)；

b）紫外燈照射樣本：放置于紫外燈下照射0、4、8、24 h后進(jìn)行檢測(cè)；

c）洗滌樣本：“藍(lán)月亮”牌洗衣液浸泡10 min，自來水沖洗20 s后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，美國(guó)）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。精液與其他常見體液表達(dá)差異性分析使用非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利用ROC曲線以及miR-891a-5p/RNU6b比值評(píng)估m(xù)iR-891a-5p區(qū)分精液的能力并獲得鑒別的最佳截?cái)嘀怠?/p>

2 結(jié)果

2.1 雙重ddPCR檢測(cè)體系的建立和優(yōu)化

如“1.2.3”所述，經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終將正向引物及反向引物的終濃度設(shè)置為900 nmol/L，探針終濃度設(shè)置為250 nmol/L，熱循環(huán)數(shù)設(shè)置為45。經(jīng)退火溫度梯度試驗(yàn)（62～56 ℃），根據(jù)兩個(gè)檢測(cè)通道陽性微滴和陰性微滴的分離狀態(tài)（如圖1所示），將退火溫度優(yōu)化為59.8 ℃（D08）。

圖1 雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)體系退火溫度梯度擴(kuò)增一維圖（a：RNU6b；b：miR-891a-5p；A08—H08退火溫度分別為62、61.6、60.9、59.8、58.4、57.3、56.5、56℃）Fig.1 The one-dimensional plot of amplif ication with annealing temperature gradient by the dual-plex ddPCR detection (a: RNU6b;b: miR-891a-5p; A08 - H08 annealing temperatures: 62, 61.6, 60.9,59.8, 58.4, 57.3, 56.5, 56°C )

2.2 鑒別方法的建立

本研究將5種體液共107份樣本用于建立鑒別方法，提取后總RNA濃度和純度以及雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)結(jié)果見補(bǔ)充材料表S1。5種體液所有樣本內(nèi)參基因RNU6b均為陽性。所有精液樣本均能檢測(cè)出miR-891a-5p且表達(dá)水平較高（1.70～2 890.00 copies/μL）；少數(shù)非精液樣本（6/40）在總RNA濃度較高時(shí)能檢測(cè)到miR-891a-5p，但含量極低（≤0.69 copies/μL）。經(jīng)非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney U檢驗(yàn)），miR-891a-5p以及miR-891a-5p/RNU6b比值（即內(nèi)參歸一化后的miR-891a-5p表達(dá)量）在精液中均顯著高于其他體液，P值均小于0.000 1，具有顯著性差異。

經(jīng)ROC曲 線 分 析（圖2），miR-891a-5p以及miR-891a-5p/RNU6b比值區(qū)分精液與非精液的能力均為100%（AUC=1.000），即通過miR-891a-5p的絕對(duì)定量或相對(duì)表達(dá)量均可實(shí)現(xiàn)對(duì)精液樣本的準(zhǔn)確鑒別。

圖2 ROC曲線分析（a：miR-891a-5p；b：miR-891a-5p/RNU6b比值）Fig.2 Analysis of ROC curve (a: miR-891a-5p; b: ratio of miR-891a-5p/RNU6b)

miR-891a-5p最 佳 截 斷 值 為1.195 copies/μL，miR-891a-5p/RNU6b比值最佳截?cái)嘀禐?.48×10-4，此時(shí)靈敏度和特異性均為100%，靈敏度95%置信區(qū)間（conf idence interval，CI）為[94.58%，100.0%]，特異性95% CI為[91.24%，100.0%]。

據(jù)此，將本研究精液斑鑒定的原則總結(jié)如下：

1）若miR-891a-5p＞1.195 copies/μL，則可直接通過miR-891a-5p的絕對(duì)含量認(rèn)定樣本中含有精液成分。

2）若miR-891a-5p≤1.195 copies/μL，則需結(jié)合內(nèi)參基因計(jì)算miR-891a-5p/RNU6b比值以獲取相對(duì) 表 達(dá) 量，若miR-891a-5p/RNU6b＞5.48×10-4，則認(rèn)為該樣本或含精液；若miR-891a-5p/RNU6b≤5.48×10-4，則可認(rèn)為該樣本非精液（或低至不能檢測(cè)出）。

根據(jù)以上鑒定標(biāo)準(zhǔn)，用于建立本方法的所有107份樣本均被100%正確判別。

2.3 鑒別方法的驗(yàn)證

2.3.1 靈敏度試驗(yàn)

本研究對(duì)3份精液樣本進(jìn)行了精液量從1 μL到0.008 μL的提取和檢測(cè)，結(jié)果見補(bǔ)充材料表S2所示。根據(jù)2.2中的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，使用本方法當(dāng)精液量低至0.008 μL時(shí)，所有樣本仍都能被正確鑒定為精液。而傳統(tǒng)方法金標(biāo)抗人精檢測(cè)試劑條PSA在精液量為0.016 μL及至0.008 μL時(shí)陰性率為66.7%（4/6）。

2.3.2 模擬混合樣本試驗(yàn)

本研究對(duì)3份精液樣本與外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌液按1∶10、1∶50、1∶100混合而成的斑跡進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見補(bǔ)充材料表S3。所有混合斑均可檢測(cè)出miR-891a-5p且根據(jù)miR-891a-5p的絕對(duì)含量均能被正確鑒定為含有精液成分（miR-891a-5p ＞1.195 copies/μL）。miR-891a-5p/RNU6b比值隨著混合比例中精液成分的降低而逐漸下降。

2.3.3 模擬降解樣本試驗(yàn)

本研究分別進(jìn)行了室外樣本、紫外燈照射樣本和洗滌樣本的制備和檢測(cè)，每個(gè)條件各使用3份來自不同個(gè)體的精斑樣本，檢測(cè)結(jié)果見補(bǔ)充材料表S4。室外放置的精斑樣本精液特異性成分miR-891a-5p在4 d時(shí)已顯著降低，且隨著時(shí)間梯度逐漸減少，而內(nèi)參基因RNU6b則較為穩(wěn)定；較之于室外樣本，紫外燈照射的精斑miR-891a-5p含量隨時(shí)間梯度的變化較小，僅在從0 h到4 h下降較明顯；洗滌樣本在洗滌后miR-891a-5p含量顯著降低。根據(jù)本研究2.2中的精液斑鑒定原則，所有模擬降解樣本及對(duì)照樣本均被正確判定為精液。

3 討論

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是近年來逐漸發(fā)展成熟的一種分子檢測(cè)技術(shù)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比具有以下優(yōu)勢(shì)：

1）可對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量，克服了相對(duì)定量檢測(cè)中歸一化和校準(zhǔn)問題[14]。

2）在檢測(cè)微量目標(biāo)核酸時(shí)精確度、重復(fù)性和靈敏度更高[15-16]。

3）對(duì)潛在PCR抑制劑相對(duì)不敏感，更不易受擴(kuò)增效率的影響[17]，并可進(jìn)行多重檢測(cè)。

本研究在前期工作的基礎(chǔ)上建立了可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)目標(biāo)分子miR-891a-5p與RNU6b的雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)體系，該體系可將模板的使用量降低一半，對(duì)于法醫(yī)樣本常為微量這一特點(diǎn)而言具有極其重要的意義。使用建立的雙重檢測(cè)體系對(duì)來自5種體液共107份樣本進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了miR-891a-5p的精液特異性?；趦煞N目標(biāo)分子的表達(dá)情況，使用ROC分析確立了精液鑒別方法，最終可實(shí)現(xiàn)精液與其他體液100%的準(zhǔn)確區(qū)分。

本體系不僅包含了精液特異性分子miR-891a-5p，同時(shí)加入了內(nèi)參基因RNU6b。內(nèi)參的加入可以對(duì)miR-891a-5p的表達(dá)情況進(jìn)行必要的歸一化分析，避免了因樣本在RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和ddPCR過程中出現(xiàn)問題而造成的假陰/陽性概率，同時(shí)大大提高了方法的靈敏度。使用NanoDrop 2000c對(duì)核酸進(jìn)行初步定量是法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室常用方法，但此方法對(duì)低濃度RNA樣本的定量準(zhǔn)確性較差[18-21]，我們選擇使用不同體積梯度的原始精液樣本進(jìn)行方法靈敏度的測(cè)試驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)隨著提取時(shí)精液量的降低，RNU6b和miR-891a-5p的數(shù)字PCR定量結(jié)果均呈現(xiàn)出明顯的下降規(guī)律，而NanoDrop 2000c測(cè)量的總RNA濃度并沒有明顯變化規(guī)律，進(jìn)一步證實(shí)了NanoDrop無法對(duì)低濃度核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量。而當(dāng)精液量低于0.063 μL時(shí)，大多數(shù)樣本僅通過miR-891a-5p的絕對(duì)含量已經(jīng)無法進(jìn)行準(zhǔn)確判別（miR-891a-5p＜1.195 copies/μL），但此時(shí)通過內(nèi)參基因進(jìn)行校正后,在精液量為0.008 μL時(shí)依然能夠被正確判定為精液，這使得本體系比傳統(tǒng)PSA試紙條法更加靈敏。

在實(shí)驗(yàn)樣本的檢測(cè)中，針對(duì)液體類樣本（精液、外周血、唾液）設(shè)置了不同體積的原始體液樣本（這就意味著體積越大模板的總量也越大）進(jìn)行提取檢測(cè)及后續(xù)分析，發(fā)現(xiàn)原始樣本體積的多少并不影響本體系的鑒別效果：當(dāng)樣本初始量相對(duì)較少時(shí)，如同樣為10 μL的精液、外周血和唾液，所有外周血和唾液樣本均不能檢測(cè)到miR-891a-5p；而當(dāng)樣本體積較大，如多達(dá)500 μL外周血或2 mL唾液，少數(shù)樣本雖能夠檢出極少量的miR-891a-5p，但使用內(nèi)參基因?qū)ι蠘恿窟M(jìn)行歸一化后依然可以作出準(zhǔn)確判別，而被檢測(cè)到的極少量miR-891a-5p的樣本，在沒有使用內(nèi)參基因的方法中可能會(huì)被錯(cuò)判而成為假陽性樣本。

犯罪現(xiàn)場(chǎng)所遺留的體液斑跡往往不僅微量，而且可能是降解或混合物，混合斑、降解樣本的檢測(cè)一直是法醫(yī)體液鑒定的重點(diǎn)和難點(diǎn)[22]。在模擬降解樣本的檢測(cè)中，室外放置14 d、紫外照射24 h及經(jīng)洗滌的精斑均可被正確判別，說明此種降解程度的樣本依然適用于本鑒定方法。由于條件所限，本研究未能對(duì)更多降解樣本進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，這將是下一步要重點(diǎn)開展的工作之一。而在模擬混合斑樣本的檢測(cè)中，精液與其他4種常見體液1∶100比例混合后仍都能通過本體系檢測(cè)出精液特征分子miR-891a-5p、且能正確認(rèn)定為含有精液成分，充分體現(xiàn)出所建方法在混合斑鑒定中也具有較大潛力。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)miR-891a-5p/RNU6b比值隨著混合比例中精液成分的降低而逐漸下降，說明RNU6b在樣本中的穩(wěn)定性較好，也一定程度上反映出RNU6b作為內(nèi)參基因的適用性。

4 結(jié)論

本研究成功建立了miR-891a-5p與內(nèi)參基因RNU6b的雙重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)體系，能夠?qū)崿F(xiàn)精液斑的100%準(zhǔn)確鑒別，靈敏度高，且適用于混合斑和降解樣本。因此，本檢測(cè)體系具有很好的應(yīng)用前景，可在法醫(yī)實(shí)際案件中進(jìn)行廣泛應(yīng)用。

補(bǔ)充材料

與本文相關(guān)的補(bǔ)充數(shù)據(jù)見：http://www.xsjs-cifs.com/CN/abstract/abstract6992.shtml。