魯琴，關(guān)建華，曾建偉，林明和，林久茂，Nathaniel Weygant，曹治云*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

目前，我國肝癌發(fā)病率和病死率在癌癥疾病中位列第三［1］。通過手術(shù)、放化療、免疫治療、靶向治療等雖然取得一定的進(jìn)步，但因復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的病死率仍居高不下。因此，尋找高效且低毒的抗腫瘤藥物，以此來降低復(fù)發(fā)和減少轉(zhuǎn)移是目前臨床治療中亟待解決的問題。缺氧是實(shí)體腫瘤常見的現(xiàn)象，腫瘤形成過程是腫瘤細(xì)胞對缺氧逐漸適應(yīng)的過程，而低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）在這一過程中起著中樞作用［2］。HIF-1可通過形成多血管體系和提高糖酵解速率來提高肝癌細(xì)胞對低氧條件的適應(yīng)性，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。miR-210（microRNA-210）是一種低氧誘導(dǎo)的miRNA，直接受HIF-1的調(diào)控，它的表達(dá)與HIF-1呈正相關(guān)性，目前被認(rèn)為是腫瘤低氧環(huán)境下的標(biāo)志性表達(dá)基因［3］。肝癌細(xì)胞在低氧的狀態(tài)下，通過調(diào)控糖酵解途徑的關(guān)鍵酶如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白、磷酸甘油酸激酶等，導(dǎo)致糖酵解加快及乳酸生成，降低線粒體氧化磷酸化發(fā)生水平，而此過程的調(diào)控核心單元為HIF-1/miR-210。深入探討HIF-1/miR-210誘導(dǎo)的能量代謝重編程具體調(diào)控機(jī)制，將為抗腫瘤藥物研究提供新的治療靶點(diǎn)［4-5］。

解毒消癥飲（JXY）在臨床上長期被應(yīng)用于消化道腫瘤患者的輔助治療，在圍放、化療期對于消化道腫瘤中熱毒熾盛型的患者，可減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，延長患者生存期［6-9］。該中藥復(fù)方還可通過抑制與內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-2和MMP-9的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對低氧條件下以HIF-1為通路核心的肝癌細(xì)胞增殖及血管新生的抑制作用［10-12］。但該方通過HIF-1/miR-210回路調(diào)控能量代謝重編程具體作用機(jī)制尚未明確。本文以HIF-1/miR-210為切入點(diǎn)，考察JXY干預(yù)肝癌細(xì)胞在能量代謝重編程過程中相關(guān)因子的表達(dá)情況，從分子水平探討該方調(diào)控的具體作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7，由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 JXY藥物組成：白花蛇舌草30 g，山慈菇15 g，苦參15 g，夏枯草15 g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂，參照文獻(xiàn)［10］按質(zhì)量配比制備JXY乙酸乙酯提取物。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、MTT（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Hoechst 33342染色試劑盒、葡萄糖含量檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；HIF-1α、人葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（glucose transporter 1，GLUT-1）、單羧 酸轉(zhuǎn) 運(yùn) 蛋 白-4（monocarboxylate transporter 4，MCT-4）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）抗體（美國Proteintech Group公司）；引物構(gòu)建于浙江尚亞生物技術(shù)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；低氧細(xì)胞工作站（英國Don Whitely Scientific公司）；CO2培養(yǎng)箱、-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Life公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 低氧與常氧培養(yǎng)條件 20% O2、5% CO2、37 ℃完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)為常氧培養(yǎng)條件；使用低氧細(xì)胞工作站（0.1% O2、5% CO2、94% N2的混合氣），37 ℃條件下培養(yǎng)為低氧條件。

2.2 干預(yù)條件篩選

2.2.1 MTT法觀察低氧和常氧條件對肝癌細(xì)胞活力的影響 將肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7分別按1.0×104個(gè)/mL均勻接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并同時(shí)分別置于低氧或常氧條件下培養(yǎng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別干預(yù)3、6、9、12、24、36、48 h后，棄去板中上清液，每孔加入10 μL的MTT（初始濃度：0.5 mg/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入含有1% NH4OH的DMSO溶解晶體至48 h后完全結(jié)束該實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀上于492 nm 測定吸光度值。

2.2.2 Western blot法檢測低氧和常氧條件對HIF-1α蛋白表達(dá)量的影響 取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞接板，分別同時(shí)置于低氧或常氧條件下培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間段（0.5、1、3、6、9 h）收集并提取蛋白。在干預(yù)時(shí)間結(jié)束后提取蛋白，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗冷庫孵育過夜，TBST洗膜，二抗搖床孵育2 h，通過Bio-Rad成像系統(tǒng)對蛋白指標(biāo)進(jìn)行成像，并使用Image J軟件對獲得的蛋白數(shù)據(jù)分析整理。

2.2.3 MTT法觀察低氧和常氧條件下不同濃度JXY對肝癌細(xì)胞活力的影響 將肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7分別按1.0×104個(gè)/mL均勻接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時(shí)分別置于低氧或常氧條件下培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合度到達(dá)60%～70%時(shí)予以不同濃度JXY（0、0.05、0.1、0.2 mg/mL）干預(yù)，并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別干預(yù)6、9、12、24 h后，棄去板中上清液，每孔加入10 μL的MTT（初始濃度：0.5 mg/mL）后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入含有1% NH4OH的DMSO溶解晶體至48 h后完全結(jié)束該實(shí)驗(yàn)。酶標(biāo)儀上于492 nm測定吸光度A值，按以下公式計(jì)算：

2.3 干預(yù)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 細(xì)胞分組 將肝癌細(xì)胞分為常氧0 mg/mL組、常 氧0.1 mg/mL組、低 氧0 mg/mL組、低 氧0.1 mg/mL組。在細(xì)胞匯合度到達(dá)60%～70%時(shí)予以不同濃度JXY（0、0.1 mg/mL）干預(yù)，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置不同干預(yù)條件。

2.3.2 細(xì)胞爬片實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞形態(tài) 將蓋玻片消毒滅菌后放入6孔板中，按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)后，將蓋玻片放置于蘇木素溶液中染色2 min，超純水清洗3遍后，置于自來水中返藍(lán)10 min。再將蓋玻片放于伊紅溶液中染色1 min，超純水清洗3遍，晾干，中性樹膠封片，用顯微鏡采集圖片。

2.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞生長遷移 細(xì)胞接種到12孔板中后置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用無菌200 μL移液槍槍頭尖端從左至右水平輕輕刮擦，經(jīng)無菌PBS清洗后加入2 mL/孔的完全DMEM培養(yǎng)基，再置于顯微鏡下拍照。按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)，每隔24 h拍照1次，直至對照組劃痕全部閉合。

2.3.4 Hoechst染色法觀察肝癌細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞按照1.0×105個(gè)/mL接種在6孔板后置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁后按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)24 h，棄去上清液，PBS洗2遍后用福爾馬林進(jìn)行固定，加入400 μL的10 μg/mL Hoechst 33342染色并避光，15 min后PBS洗3遍，用熒光顯微鏡拍照。

2.3.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)觀察肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞消化，使用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后稀釋至所需細(xì)胞密度，24孔板下加入600 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，并取等體積細(xì)胞懸液加入Transwell小室，按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)，孵育24 h后取出小室用PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min后再用PBS清洗2遍，加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，最后用PBS清洗2遍并用棉簽輕輕擦去表面未遷移細(xì)胞后，置于光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。

2.3.6 可見分光光度法檢測肝癌細(xì)胞葡萄糖濃度 按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)24 h，收集細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照一定比例加入蒸餾水后用超聲波破碎細(xì)胞（冰浴，功率20%，超聲3 s，間隔10 s，重復(fù)30次），放置于沸水浴中煮沸10 min，冷卻后，25 ℃下8 500 r/min離心10 min，取上清液備用。分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，蒸餾水調(diào)零，按照葡萄糖含量檢測試劑盒說明書，在樣本中加入提前配置好的試劑混勻后，置于37 ℃水浴保溫15 min，于505 nm波長處讀取吸光值。

2.3.7 Agilent Seahorse XF能量代謝檢測肝癌細(xì)胞能量代謝水平 按照XF ATP RATE ASSAY檢測步驟說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)后，利用Seahorse XFe9檢測系統(tǒng)，檢測三磷酸腺苷（ATP）水平。

2.3.8 Western blot法檢測肝癌細(xì)胞GLUT1、MCT4、HK、PFK蛋白表達(dá)量 取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)24 h。干預(yù)后提取蛋白，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗冷庫孵育過夜，TBST洗膜，二抗搖床孵育2 h，通過Bio-Rad成像系統(tǒng)對蛋白指標(biāo)進(jìn)行成像，并使用Image J軟件對獲得的蛋白數(shù)據(jù)分析整理。

2.3.9 熒光定量PCR法檢測肝癌細(xì)胞HIF-1α、miR-210 mRNA表達(dá)水平 取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行接板并置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，按“2.3.1”項(xiàng)下分組干預(yù)24 h，收集肝癌細(xì)胞，按經(jīng)典RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，并用常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄方法將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Green I做為熒光染料，而后根據(jù)Light CyelerDNA Master SYBR Green I說明書進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。HIF-1α正引：GCAGCAACGACACA GAAACT，反引：TGCAGGGTCAGCACTACTTC；miR-210正引：AATAATCGCTGTGCGTGTGAC，反引：AG TGCAGGGTCCGAGGTATT。檢測HIF-1α和miR-210 mRNA水平的表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞增殖活性的影響 MTT結(jié)果顯示，在低氧條件下培養(yǎng)的3株肝癌細(xì)胞增殖活性較常氧條件下明顯增強(qiáng)，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長而不斷升高。其中，Huh7和HepG2肝癌細(xì)胞在低氧條件下24 h細(xì)胞增殖活性達(dá)到最高，Hep3B細(xì)胞增殖活性在24 h仍在緩慢上升，至36 h達(dá)到峰值。見圖1。

圖1 不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞增殖活性的影響

3.2 不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，3株肝癌細(xì)胞在低氧條件下HIF-1α蛋白表達(dá)量較常氧條件下明顯上調(diào)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量也逐漸升高，說明低氧細(xì)胞模型已成功建立。因此結(jié)合MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選取低氧24 h為JXY干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。見圖2。

圖2 不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

3.3 不同濃度JXY和不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞活力的影響 JXY干預(yù)后在低氧和常氧條件下均能抑制肝癌細(xì)胞增殖，其在低氧條件下的抑制效果顯著高于常氧條件組，并且呈時(shí)間-劑量依賴性，見圖3。

圖3 不同濃度JXY和不同干預(yù)時(shí)間對低氧和常氧條件下肝癌細(xì)胞活力的影響

3.4 常氧和低氧條件下JXY對肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響 細(xì)胞予以不同濃度JXY干預(yù)后置于不同條件下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0 mg/mL濃度下，細(xì)胞在低氧條件下較常氧條件形態(tài)發(fā)生明顯改變；而在相同條件下，高濃度JXY干預(yù)可明顯抑制低氧條件導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞的形態(tài)改變。見圖4。

圖4 4組肝癌細(xì)胞不同干預(yù)時(shí)間細(xì)胞爬片圖（×200）

3.5 常氧和低氧條件下JXY對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，予以0 mg/mL JXY濃度下的Hep3B細(xì)胞遷移能力在不同條件下無明顯變化，HepG2和Huh7細(xì)胞在常氧條件下的遷移能力較低氧條件下更強(qiáng)；而高濃度能顯著抑制2種條件下3株肝癌細(xì)胞的遷移能力。見圖5。

圖5 4組肝癌細(xì)胞劃痕愈合圖（×100）

3.6 低氧和常氧條件下不同濃度JXY對肝癌細(xì)胞凋亡能力的影響 選取0.1 mg/mL作為后續(xù)生物學(xué)機(jī)制研究的濃度，檢測常氧和低氧條件細(xì)胞凋亡，染色結(jié)果表明，在低氧和常氧條件下JXY干預(yù)均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，低氧條件下發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量更多。見圖6。

圖6 4組不同肝癌細(xì)胞Hoechst染色圖（×200）

3.7 常氧和低氧條件下JXY對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，高濃度JXY對肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力具有顯著抑制作用。見圖7。

圖7 4組肝癌細(xì)胞遷移作用圖（×100）

3.8 4組肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)及HIF-1α、miR-210 mRNA表達(dá)水平比較 Western blot結(jié)果顯示，在0 mg/mL JXY濃度下，2株肝癌細(xì)胞在低氧條件下產(chǎn)生的HIF-1α顯著高于常氧條件組，而高濃度JXY能顯著下調(diào)在不同條件下HIF-1α的蛋白表達(dá)，見圖8。同時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，在0 mg/mL JXY濃度下，低氧條件下HIF-1α的累積促進(jìn)了miR-210 mRNA水平的表達(dá)，而高濃度JXY在抑制HIF-1α的同時(shí)也抑制了miR-210 mRNA水平的表達(dá)，兩者呈正相關(guān)。見圖9。

圖8 4組肝癌細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)比較

圖9 4組肝癌細(xì)胞HIF-1α和miR-210 mRNA表達(dá)水平比較

3.9 4組肝癌細(xì)胞葡萄糖含量和細(xì)胞能量代謝比較 葡萄糖含量檢測實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞能量代謝檢測結(jié)果顯示，在0 mg/mL JXY濃度下，低氧條件組較常氧條件組葡萄糖攝取含量和糖酵解途徑的ATP產(chǎn)量增加；而JXY干預(yù)對其具有顯著的抑制效果。見圖10。

圖10 4組肝癌細(xì)胞葡萄糖含量和細(xì)胞能量代謝比較

3.10 4組肝癌細(xì)胞GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表達(dá)比較 Western blot結(jié)果表明，低氧條件下由于能量代謝重編程引起的GLUT-1、HK、PFK和MCT-4等相關(guān)蛋白的高表達(dá)，JXY干預(yù)后均能起到顯著的抑制作用。見圖11。

圖11 4組肝癌細(xì)胞GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表達(dá)比較

4 討 論

腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)在低氧環(huán)境下對能量的需求，會(huì)對能量進(jìn)行代謝重編程，即弱化線粒體的氧化磷酸化途徑，取而代之選擇糖酵解，主要表現(xiàn)為葡萄糖攝取量顯著提高、糖酵解活性明顯增強(qiáng)及乳酸大量堆積，又被稱為Warburg效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞代謝重編程的間接表現(xiàn)是葡萄糖攝取量增加，因?yàn)槠咸烟遣荒芡ㄟ^細(xì)胞膜，在很大程度上依賴于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的運(yùn)輸，腫瘤為攝取葡萄糖會(huì)應(yīng)激性高表達(dá)GULT，其中GULT-1和GULT-3是HIF-1轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的靶基因，其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高與HIF-1直接相關(guān)。糖酵解過程中的3個(gè)限速酶HK、PFK和PK是糖酵解途徑的3個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄水平和激酶活性受HIF-1的直接調(diào)控［5］。而且糖酵解不僅可為細(xì)胞增殖提供不可缺少的中間代謝產(chǎn)物，如6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇式丙酮酸及丙酮酸等，作為細(xì)胞合成核酸、氨基酸、脂肪酸等細(xì)胞結(jié)構(gòu)生物大分子不可或缺的前體物質(zhì)，又可快速產(chǎn)生一定量的ATP用于維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)，使腫瘤細(xì)胞達(dá)到生長與代謝的空前平衡［13］，而此過程的調(diào)控核心單元為HIF-1/miR-210回路。

實(shí)體腫瘤組織內(nèi)部處于低氧狀態(tài)，這時(shí)細(xì)胞通常會(huì)通過啟動(dòng)相關(guān)信號調(diào)節(jié)通路，從而改變分子的DNA轉(zhuǎn)錄模式以應(yīng)對不良微條件，應(yīng)對這種改變的核心分子是HIF-1。HIF-1由對氧敏感的HIF-1α亞基和對氧不敏感的HIF-1β亞基組成，在正常氧分壓下HIF-1β是具有活性的分子，而HIF-1α則通過PHD羥化其分子上的脯氨酸后進(jìn)入蛋白酶體降解通路最終被酶解代謝［14-15］。在腫瘤低氧的微環(huán)境中，HIF-1α的降解途徑被阻斷，直接導(dǎo)致HIF-1α水平的累積。

人miR-210位于染色體1lp15.5，序列為“CUGU GCGUGUGACAGCGGCUGA”。常氧條件下，內(nèi)源性miR-210水平維持在非常低的狀態(tài)［16］。低氧條件下，HIF-1α的表達(dá)應(yīng)激性上調(diào)，HIF-1α啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件可和miR-210序列（6～8個(gè)核苷酸）配對，抑制miR-210降解的同時(shí)上調(diào)miR-210轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物［17］，過表達(dá)miR-210又可削弱PHD mRNA的翻譯水平，降低HIF-1α的羥化，抑制其降解。實(shí)驗(yàn)表明腫瘤細(xì)胞在缺氧處理48～72 h后，上調(diào)的HIF-1α能夠促進(jìn)VEGF和miR-210的表達(dá)，而抑制miR-210 mRNA水平則會(huì)降低HIF-1α的蛋白水平［18］。這表明HIF-1α與miR-210之間是一個(gè)正反饋回路的調(diào)控關(guān)系［19］。

研究表明夏枯草的主要成分夏枯草總黃酮可同時(shí)抑制線粒體氧化磷酸化和糖酵解途徑抑制肝癌誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡，苦參素抑制HepG2細(xì)胞糖酵解過程抑制肝癌細(xì)胞增殖，此外紅豆杉、白頭翁、穿心蓮、黃芩、半枝蓮等多種清熱解毒中藥都具有抑制腫瘤糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的作用［20-22］。這為中藥抗腫瘤藥物研究提供了新的治療靶點(diǎn)。而清熱解毒中藥通過HIF-1α/miR-210正反饋回路調(diào)控腫瘤細(xì)胞能量代謝重編程過程具體作用機(jī)制目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為癌癥多為內(nèi)虛邪擾，陰陽嚴(yán)重失調(diào)，瘀、毒、虛、六淫等諸多因素均與癌癥相關(guān)。治療上一般采取扶正祛邪，調(diào)理各臟腑機(jī)能，增強(qiáng)體質(zhì)和免疫力。而解毒消癥飲入肝經(jīng)，方中白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇、苦參四藥性味均屬苦、甘、寒，是清熱解毒法中藥驗(yàn)方，可通過疏泄癌腫堵塞的肝經(jīng)，化解日久化熱所致小便短赤、大便干結(jié)、舌紅苔厚等熱證。

本研究通過建立低氧和常氧細(xì)胞模型，對比模擬肝癌細(xì)胞生長環(huán)境，證明低氧和常氧條件下腫瘤細(xì)胞能量代謝重編程的應(yīng)答機(jī)制在形態(tài)及功能方面的顯著差異，同時(shí)探討JXY通過HIF-1/miR-210回路調(diào)控肝癌細(xì)胞能量代謝重編程的具體作用機(jī)制。結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞在低氧條件下的增殖活性較常氧條件下明顯增強(qiáng)，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長而不斷升高。其中，Huh7和HepG2肝癌細(xì)胞在低氧條件下24 h細(xì)胞增殖活性達(dá)到最高，Hep3B細(xì)胞增殖活性在24 h仍在緩慢上升，至36 h達(dá)到峰值。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取低氧24 h為JXY干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。肝癌細(xì)胞在低氧條件下HIF-1α蛋白表達(dá)量較常氧條件下明顯上調(diào)，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長蛋白表達(dá)量也逐漸升高。而在JXY干預(yù)后，其在低氧和常氧條件下均能抑制肝癌細(xì)胞增殖，且在低氧條件下的抑制效果顯著高于常氧條件組，呈時(shí)間和劑量依賴性。同樣地，JXY干預(yù)在低氧條件下促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡作用顯著。低氧條件下JXY干預(yù)對肝癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變、侵襲遷移能力和能量代謝重編程過程中所需的葡萄糖攝取，以及相關(guān)因子HIF-1α、GLUT-1、HK、PFK和MCT-4蛋白表達(dá)量和HIF-1α調(diào)控的miR-210 mRNA表達(dá)水平均有顯著的抑制作用。由此猜想，JXY可能通過抑制HIF-1/miR-210正反饋回路，抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解過程，從而抑制糖酵解過程中所需葡萄糖攝取和ATP生成，進(jìn)而抑制GLUT-1、HK、PFK、MCT-4的表達(dá)。最終調(diào)整整個(gè)能量代謝重編程過程，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等目的。