楊 蕾，侯慧芳，王 敏，洪 林，楊海健，王 武，程 楊，譚 平

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，重慶 401329）

血橙（Citrus sinensis(L.) Osbeck），蕓香科柑橘屬植物，是柑橘中唯一含花青素的品種[1]?；ㄇ嗨貫樘烊坏乃苄陨?，屬類黃酮物質(zhì)，大多以花青素苷的形式存在，和糖結(jié)合形成花色苷[2-4]?；ㄇ嗨刂饕? 大類：矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素、天竺葵素、錦葵素、矮牽牛素[5-6]。矢車菊素及芍藥花素呈紫紅色，天竺葵素表現(xiàn)為紅橙色，飛燕草素、錦葵素及矮牽牛素表現(xiàn)為藍(lán)紫色[7-8]?；ㄇ嗨乜寡趸芰O強(qiáng)，具有抗癌、抗炎、降低心血管病、治療糖尿病和降低其他慢性疾病風(fēng)險等多種藥理作用[9-12]。

國內(nèi)外學(xué)者對血橙花青素多年前就已有研究，血橙中花青素組分和含量因品種而異，還受到環(huán)境因素等多種條件的影響。經(jīng)前人研究，血橙花青素主要成分為矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等[13-14]。Dugo等[15]利用微量高效液相色譜-電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)首次鑒定出‘摩洛’、‘塔羅科’和‘桑吉耐洛’血橙中含芍藥花素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花素、矮牽牛素5種少量成分。Hillebrand等[16]研究商業(yè)化血橙果汁花青素組成為2種主要成分：矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-(6-丙二酰葡萄糖苷)，6種次要成分：矢車菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、飛燕草素-3-O-(6-丙二酰葡萄糖苷)、芍藥花素-3-O-(6-丙二酰葡萄糖苷)和矢車菊素-3-(6-二乙二酰葡萄糖苷)。Cebadera-Miranda等[17]鑒定出‘桑吉耐洛’和‘塔羅科’血橙中10種花青素組分，主要包括7種矢車菊素和3種飛燕草素。曹少謙[18]利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定出‘塔羅科’血橙中8種花青素物質(zhì)，2種主要組分及6種次要成分。楊海健等[19]發(fā)現(xiàn)‘塔羅科’血橙果皮中主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3(6''-丙二酰)葡萄糖苷和飛燕草素-3-蕓香糖苷3種花青素。

塔羅科血橙是我國主栽血橙品種，果肉色澤是其關(guān)鍵品質(zhì)指標(biāo)之一，花青素含量高低決定其商業(yè)價值，但在重慶地區(qū)血橙表現(xiàn)出果肉著色淺或不均勻、品質(zhì)下降等問題，制約產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前，高花青素商業(yè)血橙品種匱乏，血橙花青素代謝調(diào)控機(jī)制研究尚不透徹。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因分辨率高、靈敏度高，適合檢測高沸點(diǎn)、高分子質(zhì)量化合物、熱不穩(wěn)定物質(zhì)等，在植物代謝組學(xué)方面的應(yīng)用越來越廣泛[20-21]。本研究基于LC-MS/MS技術(shù)測定‘塔羅科’血橙優(yōu)系和對照品種果肉花青素代謝物的種類和含量，篩選兩者的差異代謝物，為優(yōu)系后續(xù)基礎(chǔ)應(yīng)用研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為‘塔羅科’血橙優(yōu)系，系本實(shí)驗室前期從普通‘塔羅科’血橙中篩選的芽變材料，具有高花青素、高可溶性固形物含量兩大優(yōu)良性狀。供試材料‘塔羅科’血橙優(yōu)系和對照品種‘塔羅科’血橙種植于重慶市開州區(qū)鴻情香橙果園，海拔385 m，基砧均為枳，中間砧為錦橙，高接5年，普通管理水平。2月下旬果實(shí)成熟期采樣，選取‘塔羅科’血橙優(yōu)系（G）和對照品種‘塔羅科’血橙（CK）各9 株樹，內(nèi)膛（N）和外圍（W）分別采集果樣，設(shè)置GN、GW、CKN和CKW 4個實(shí)驗組，每個實(shí)驗組每株采集果實(shí)樣品5個，每3 株樣樹的15個果實(shí)混合為1個生物學(xué)樣品并設(shè)置3個重復(fù)，用于果實(shí)基礎(chǔ)品質(zhì)和花青素代謝物測定。

甲醇（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；鹽酸（優(yōu)級純）信陽市化學(xué)試劑廠；標(biāo)準(zhǔn)品：矢車菊素類（矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3,5-O-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6-咖啡酰)-葡萄糖苷、矢車菊素-3-(6-咖啡?；碧擒?-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-阿魏酰槐糖苷-5-葡萄糖苷、矢車菊素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷）、黃酮類（柚皮素-7-O-葡萄糖苷、蘆丁、柚皮素、查耳酮、二氫楊梅黃酮、阿福豆苷、香橙素（二氫山柰酚）、異槲皮苷）、錦葵色素類（錦葵色素-3,5-O-二葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-阿拉伯糖苷、錦葵色素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-半乳糖苷、錦葵色素-3-O-葡萄糖苷、錦葵色素、錦葵色素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-(6''-乙?；咸烟擒?-5-葡萄糖苷、錦葵色素-3-O-蕓香糖苷、錦葵色素-3-O-桑布雙糖苷、錦葵色素-3-O-槐糖苷、錦葵色素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷）、原花青素類（原花青素A1、原花青素A2、原花青素B1、原花青素B2、原花青素B3、原花青素C1）、芍藥花色素類（芍藥花色素-3-(咖啡酰葡萄糖基葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷、芍藥花素-3-O-對羥基苯甲酰槐糖-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-咖啡酰-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-阿魏酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、芍藥花素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷、芍藥花色素、芍藥花色素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-桑布雙糖苷、芍藥花色素-3-O-槐糖苷、芍藥花色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、芍藥花色素-3-(6-p-對香豆酰)-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-半乳糖苷、芍藥花色素-3-O-蕓香糖苷、芍藥花色素-3,5-O-二葡萄糖苷、芍藥花色素-3-O-阿拉伯糖苷）、飛燕草素類（飛燕草素-3-O-乙?；咸烟擒?、飛燕草素-3-O-(6-O-丙二酰基)-葡萄糖苷-3'-葡萄糖基、飛燕草素、飛燕草素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-半乳糖苷、飛燕草素-3-O-蕓香糖苷、飛燕草素-3-O-槐糖苷、飛燕草素-3,5-O-二葡萄苷、飛燕草素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-鼠李糖苷、飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷、飛燕草素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷）、天竺葵素類（天竺葵素、天竺葵素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-(6''-阿魏酰桑布雙糖苷)-5-O-(丙二?；?-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)-二葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-[2-O-葡萄糖基-6-O-p-對香豆酰-葡萄糖苷]-5-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-阿拉伯糖苷、天竺葵素-3-O-半乳糖苷、天竺葵素-3-O-蕓香糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-桑布雙糖苷、天竺葵素-3-O-槐糖苷-5-O-(丙二?；?-葡萄糖苷、天竺葵素-3-(6-咖啡?；碧擒?-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-阿魏酰葡萄糖基葡萄糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3,5,3'-O-三葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-槐糖苷、天竺葵素-3,5-O-二葡萄糖苷）、矮牽牛素類（矮牽牛素-3,5-O-二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-5-O-(6-O-對香豆酰)二葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-阿拉伯糖苷、矮牽牛素-3-O-半乳糖苷、矮牽牛素-3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-桑布雙糖苷、矮牽牛素-3-O-槐糖苷、矮牽牛素-3-O-桑布雙糖苷-5-葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矮牽牛素-3-O-葡萄糖、矮牽牛素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷）（純度＞99%） 上海isoReag公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QTRAP 6500+LC-MS/MS聯(lián)用儀 美國SCIEX公司；5424R離心機(jī) 德國Eppendorf公司；AS 60/220.R2電子天平 波蘭RADWAG公司；MM400球磨儀德國Retsch公司；MIX-200多管渦旋振蕩器 上海凈信公司；KQ5200E超聲清洗儀 昆山舒美公司。

1.3 方法

上述4 組果實(shí)樣品中，設(shè)置CKN_vs_CKW、CKN_vs_GN、CKN_vs_GW、CKW_vs_GN、CKW_vs_GW、GN_vs_GW 6個不同的對比組篩選花青素差異代謝物。

1.3.1 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)分析

取10個大小均勻的果實(shí)，單果質(zhì)量使用電子天平測定；可溶性固形物含量用手持糖度折光儀測定；可滴定酸含量采用酸堿滴定法測定；固酸比計算得出；總花青素含量采用試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測定。

1.3.2 樣品前處理

將血橙于液氮條件下剝離的汁胞進(jìn)行真空冷凍干燥，總量約為50 g；球磨儀（30 Hz，1.5 min）研磨至粉末狀；稱取50 mg粉末，溶解于500 μL提取液（50%甲醇溶液，含0.1%鹽酸），渦旋5 min，4 ℃、40 kHz超聲5 min，離心（12 000 r/min，3 min），吸取上清液，重復(fù)操作1次；將2次上清液合并，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為甲醇（含0.1%甲酸）；洗脫梯度：0.0～6.0 min，95%～50% A，5%～50% B；6.0～12.0 min，50%～5% A，50%～95%B；12.0～14.0 min，5% A、95% B；14.0～16.0 min，95%A、5% B；流速0.35 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；溫度550 ℃；正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V；氣簾氣壓力35 psi。在LC-MS/MS聯(lián)用儀中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓和碰撞能進(jìn)行掃描檢測。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣本含量

配制0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，獲取各個質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對應(yīng)定量信號的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)；以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制不同物質(zhì)的標(biāo)注曲線，相關(guān)系數(shù)R大于0.99。樣本中代謝物的含量按下式計算：

式中：c為樣本中色譜峰的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V為提取時所用溶液的體積/μL；m為稱取的樣本質(zhì)量/g。

1.3.6 差異代謝物的篩選

項目計算差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），其表示兩對比組間表達(dá)量的比值，選取FC不小于2和FC不大于0.5的代謝物為最終差異代謝物。

1.4 數(shù)據(jù)處理

基于標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建MWDB（Metware Database）數(shù)據(jù)庫，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析；利用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式完成定量分析。獲得樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，對所有物質(zhì)的色譜峰進(jìn)行積分，并對每種物質(zhì)在不同樣本的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正。利用Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。并對樣本質(zhì)控分析，檢測總離子流圖重疊性，以此判斷項目檢測期間儀器的穩(wěn)定性。代謝組數(shù)據(jù)由武漢邁維代謝公司進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果實(shí)基礎(chǔ)品質(zhì)分析及著色表現(xiàn)

由圖1可見，‘塔羅科’血橙優(yōu)系果肉著色明顯優(yōu)于對照組。品質(zhì)分析數(shù)據(jù)見表1，‘塔羅科’血橙優(yōu)系果實(shí)總花青素與可溶性固形物含量優(yōu)勢顯著。其中，GW組花青素質(zhì)量濃度最高（52.34 mg/L），GN組質(zhì)量濃度次之（46.81 mg/L），CKN組花青素質(zhì)量濃度最低（11.37 mg/L），GW組/CKW組、GW組/CKN組花青素含量比值分別約為2.07和4.60，而GW組/GN組比值約為1.12，表明‘塔羅科’血橙優(yōu)系樹冠外圍和內(nèi)膛果實(shí)中花青素含量均顯著高于對照，且優(yōu)系外部和內(nèi)膛之間差異較小；可溶性固形物含量GW組（14.1%）和GN組（13.4%）顯著高于CKW組和CKN組，優(yōu)系和對照品種樹冠外圍果實(shí)的可溶性固形物含量均高于內(nèi)膛，GW組果實(shí)的可滴定酸含量稍高于GN以及對照組，與對照品種相比，優(yōu)系外圍與內(nèi)膛果實(shí)的固酸比值接近。綜上，‘塔羅科’血橙優(yōu)系果實(shí)關(guān)鍵品質(zhì)性狀優(yōu)良，且樹冠內(nèi)外果實(shí)可溶性固形物、花青素含量高且差異較小。

圖1 ‘塔羅科’血橙優(yōu)系與對照品種果實(shí)著色情況Fig. 1 Flesh color of the superior strain common ‘Tarocco’ blood orange

表1 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)測定結(jié)果Table 1 Fruit quality indexes of the superior strain common ‘Tarocco’blood orange

2.2 花青素定量定性分析

圖2 樣本總離子流色譜圖（A）、提取離子流色譜圖（B）、樣本總離子流色譜重疊圖（C）Fig. 2 Total ion current chromatogram (A), extracted icon chromatogram (B), and overlapped total ion current chromatograms (C)of anthocyanidins

如圖2所示，樣本質(zhì)控總離子流色譜圖重疊性高，保留時間和峰強(qiáng)度均一致，表明檢測期間此儀器穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可信。

由表2可以看出，本實(shí)驗檢出的花青素代謝物分為矢車菊素（9種）、飛燕草素（6種）、芍藥花素（6種）、天竺葵素（3種）、矮牽牛素（3種）、錦葵素（2種）以及花青素合成前體物質(zhì)黃酮（4種）7個類別?！_科’血橙優(yōu)系共檢測出33種花青素代謝物，GN組和GW組數(shù)量一致；而對照品種‘塔羅科’血橙外圍和內(nèi)膛果檢測出的花青素代謝物數(shù)量不一，CKW組和CKN組分別檢測出30種和27種，外圍果實(shí)檢出數(shù)量多于內(nèi)膛。4 組果實(shí)共同存在的花青素代謝物為27種，相比對照品種‘塔羅科’血橙，芍藥花素-3-O-半乳糖苷、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和柚皮素為GN和GW組特有的種類；4 組果實(shí)中主要花青素代謝物均為矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，兩者為血橙果肉呈色和色澤深淺的關(guān)鍵因子，在GN、GW、CKN和CKW組中含量分別為22.40（42.30%）、27.60（41.00%）、6.10（39.50%）、13.10 μg/g（41.00%）和21.50（40.60%）、27.90（41.40%）、5.68（36.80%）、13.00 μg/g（40.60%），矢車菊素類花青素總量在GN、GW、CKN和CKW組中分別為48.68（91.90%）、62.16（92.28%）、12.79（82.89%）、28.16 μg/g（88.03%），‘塔羅科’血橙優(yōu)系果實(shí)中矢車菊素類花青素絕對含量和占比均顯著高于對照品種，飛燕草素、芍藥花素以及黃酮類代謝物絕對含量也高于對照品種，但占比低于對照品種。GN和GW組矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素以及黃酮4 類代謝物占各自花青素總量的百分比相近?；ㄇ嗨亟^對定量結(jié)果顯示，GW和GN組的花青素代謝物含量均顯著高于CKW和CKN組，GW組花青素代謝物含量最高，約67.37 μg/g，為CKN組的4.37 倍，GN組次之，CKW組約為CKN組的2.07 倍，與總花青素測定結(jié)果吻合。

表2 絕對定量結(jié)果Table 2 Anthocyanidin metabolite contents in blood organge

2.3 聚類分析

圖3 聚類熱圖分析Fig. 3 Heatmap of cluster analysis

采用極差法對代謝物含量數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，通過R語言對4 組果實(shí)花青素代謝物進(jìn)行聚類熱圖分析。如圖3所示，顏色越紅表示含量越高，各組間差異明顯。GW組整體以紅色為主，矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素、天竺葵素、矮牽牛素、錦葵素等花青素含量較高；而CKN組偏向于綠色，總體含量較低，上述結(jié)果表明‘塔羅科’血橙優(yōu)系花青素含量較對照品種高，與果實(shí)品質(zhì)分析結(jié)果一致。然而，并非檢測出的所有物質(zhì)均以GW組含量最高，如CKN組山柰酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，CKW組最低；GN組芍藥花色素-3-O-蕓香糖苷、矮牽牛素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷含量最高，CKN組未檢出；蘆丁、錦葵色素-3-O-對香豆酰葡萄糖苷在CKW組含量最高，GN組最低。

2.4 差異代謝物篩選

如表3所示，CKN_vs_GN和CKN_vs_GW對比組的差異代謝物最多，同為14種，且差異代謝物的種類相同，分屬矢車菊素、飛燕草素、芍藥花色素、天竺葵素和黃酮5 類物質(zhì)；CKW_vs_GN對比組中差異代謝物為6種，分屬矢車菊素和天竺葵素2 類物質(zhì)；CKW_vs_GW對比組差異代謝物為12種，分屬矢車菊素和芍藥花色素2 類物質(zhì)；CKN_vs_CKW對比組差異代謝物為9種，分屬矢車菊素、飛燕草素、芍藥花色素和黃酮4 類物質(zhì)；GN_vs_GW對比組中無差異代謝物。上述結(jié)果表明該‘塔羅科’血橙優(yōu)系中花青素的合成可能不受空間的影響。此外，除GN_vs_GW對比組外，其余對比組差異代謝物均上調(diào)。

表3 差異代謝物統(tǒng)計數(shù)目Table 3 Statistics of differential metabolites between different groups

圖4 不同對比組差異代謝物差異倍數(shù)條形圖Fig. 4 Fold changes of differential metabolites between different groups

如圖4所示，除GN_vs_GW組外，其他對比組差異代謝物均上調(diào)。CKN_vs_CKW對比組中，柚皮素-7-O-葡萄糖苷和芍藥花素-3-O-葡萄糖苷上調(diào)明顯，差異倍數(shù)為8.98和5.76（圖4A）。CKN_vs_GN和CKN_vs_GW兩個對比組中，上述2種物質(zhì)也均上調(diào)，F(xiàn)C分別為11.88、10.38和16.70、13.22（圖4B、C）。CKW_vs_GN和CKW_vs_GW對比組中，上調(diào)倍數(shù)前兩位的物質(zhì)為芍藥花素-3-O-葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷，上調(diào)倍數(shù)分別為4.72、3.60和8.65、4.46（圖4D、E）。

進(jìn)一步將6個對比組進(jìn)行組間共有和特有的差異代謝物信息分析，見圖5。CKN_vs_GN和CKW_vs_GW對比組共有矢車菊素、芍藥花素、天竺葵素類差異代謝物11種，其中矢車菊素有8種（圖5A）；CKN_vs_GW和CKW_vs_GN對比組共有差異代謝物5種，均為矢車菊素類（圖5B）；CKN_vs_CKW和GN_vs_GW對比組沒有交集（圖5C）。以上結(jié)果說明了矢車菊素是‘塔羅科’血橙優(yōu)系與對照‘塔羅科’血橙果肉呈色的花青素主要差異代謝物質(zhì)基礎(chǔ)，同時也表明了2個品種花青素的積累特性存在明顯差異。

圖5 不同對比組共有差異代謝物Venn圖Fig. 5 Venn charts showing shared differential metabolites between different groups

2.5 KEGG通路分析

差異代謝物在生物體內(nèi)相互作用，形成不同的通路。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對不同對比組的差異代謝物進(jìn)行注釋，CKN_vs_CKW、CKN_vs_GN、CKN_vs_GW對比組中在花青素合成途徑中分別被注釋6、9、9種物質(zhì)，占比為85.71%、90%、90%（圖6A、B）；CKW_vs_GN在植物代謝、次生生物代謝及花青素合成途徑注釋的代謝物數(shù)目分別為1、1、4，所占比例為20%、20%、80%；CKW_vs_GW對比組中上述3 條途徑注釋數(shù)目為1、1、8，所占比例為11.11%、11.11%和88.89%（圖6C、D）。

圖6 不同對比組差異代謝物KEGG分類圖Fig. 6 KEGG classification of differential metabolites between different groups

不同對比組篩選的差異代謝物映射到3 條通路：ko00942花青素合成、ko01100植物代謝和ko01110次生代謝合成。代謝通路共映射14種物質(zhì)，分別為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-槐糖苷、矢車菊素-3-O-桑布雙糖苷、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-O-木糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、飛燕草素-3-O-丙二酰葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-丙二酰葡萄糖苷和芍藥花素-3-O-葡萄糖苷。其中ko00942通路的差異代謝物最多，共有14種物質(zhì)，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷參與了3 條代謝通路。

3 討 論

血橙作為柑橘類唯一含花青素的品種，具有較高的營養(yǎng)與保健價值，已成為育種者關(guān)注的熱點(diǎn)品種之一?；ㄇ嗨赜捎谄渥匀唤鐏碓磸V、生理功能豐富和抗病機(jī)理獨(dú)特的特性，具有很高的研究價值[6,22]。比如矢車菊素-3-葡萄糖苷，是自然界最常見的花色苷，進(jìn)入體內(nèi)后較容易被吸收，其降解代謝產(chǎn)物多達(dá)41種，可減少體內(nèi)炎性物質(zhì)的產(chǎn)生，降低心血管疾病等慢性疾病的風(fēng)險[23]。此外，花青素還可應(yīng)用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)，花青素在抗癌和抗氧化[22]、抗炎和抗肥胖[24]、治療青光眼和保護(hù)視力[25]等方面也具有作用，深受醫(yī)藥工作者青睞。馬越等[26]發(fā)現(xiàn)由黑加侖濃縮汁、蘋果濃縮汁調(diào)配而成的花青素飲料，可有效緩解視疲勞。

已有研究表明低溫易促進(jìn)花青素苷的合成，高溫加速花青素苷的分解[27]。黃冬華等[28]發(fā)現(xiàn)適宜低溫刺激可促進(jìn)富貴籽果實(shí)的著色，方鵬[29]研究發(fā)現(xiàn)‘紅陽’獼猴桃在高溫脅迫下花青素易降解，果實(shí)難以著色。血橙是以冷誘導(dǎo)的方式在果肉中積累花青素，其果皮在充足的光照條件下也能積累花青素。血橙Ruby1啟動子是花青素合成的關(guān)鍵激活子，同時與光和低溫誘導(dǎo)相關(guān)，CsRuby1啟動子中的反轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)在低溫誘導(dǎo)血橙果實(shí)花青素積累的過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用[13]。短時低溫刺激也能促進(jìn)血橙采后貯藏期間花青素合成通路相關(guān)基因CHS、DFR、ANS、UFGT、GST的表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)花青素的合成[30]。相較樹體外圍而言，內(nèi)膛的溫度較高且變化幅度較小。本實(shí)驗中對照品種‘塔羅科’血橙內(nèi)膛（11.37 mg/L）和外圍（25.21mg/L）果實(shí)總花青素含量差異顯著，其受到溫度的影響較大，而‘塔羅科’血橙優(yōu)系的可溶性固形物和總花青素含量明顯高于對照品種，其外圍（52.34 mg/L）與內(nèi)膛（46.81 mg/L）果實(shí)的花青素含量接近，且內(nèi)外果實(shí)中矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素以及黃酮4 類代謝物占各自花青素總量的比例相當(dāng)，與對照品種也有明顯差異，充分展現(xiàn)了‘塔羅科’血橙優(yōu)系果實(shí)花青素積累的獨(dú)特性，推測其果實(shí)中花青素合成對于低溫的響應(yīng)機(jī)制可能不同于對照品種。

通過測定分析結(jié)果表明，本實(shí)驗中‘塔羅科’血橙優(yōu)系和對照品種果實(shí)花青素組分主要為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷，與前人研究結(jié)果一致[15-16]。相比對照，‘塔羅科’血橙優(yōu)系果實(shí)中矢車菊素類物質(zhì)絕對含量和總花青素占比均顯著提高，其內(nèi)膛和外圍果實(shí)矢車菊素類花青素總量為48.68 μg/g（91.90%）和62.16 μg/g（92.28%）。在優(yōu)系中矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷與矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量比值接近1，而在對照品種中，內(nèi)膛果矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷含量約為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的1.07 倍，外圍果實(shí)比值約為1；而在‘桑吉耐洛’、‘T. Ippolito’和‘T. Rosso’血橙上研究發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷含量約為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的1.09～1.75 倍[17]，曹少謙[18]則發(fā)現(xiàn)‘塔羅科’血橙上發(fā)現(xiàn)上述2種矢車菊素類物質(zhì)含量比值約為0.82，與本實(shí)驗2個品種的結(jié)果有差異，這可能與品種特性或是栽培條件差異緊密相關(guān)?！_科’血橙優(yōu)系樹體內(nèi)膛和外圍果實(shí)無差異代謝物，對照品種內(nèi)膛和外圍果實(shí)中有9種差異代謝物且均為上調(diào)代謝物，上述結(jié)果表明該‘塔羅科’血橙優(yōu)系中花青素的合成可能不受果實(shí)在樹體中著生方位的影響。芍藥花素-3-O-半乳糖苷、柚皮素、錦葵色素-3-O-丙二酰葡萄糖苷3種物質(zhì)是優(yōu)系較對照品種特有的花青素相關(guān)代謝物質(zhì)。值得關(guān)注的是，本實(shí)驗中在對照品種中內(nèi)膛與外圍果實(shí)花青素合成前體物質(zhì)黃酮在總花青素含量中的比例（分別為7.76%和4.80%）明顯高于優(yōu)系品種，推測相比對照品種，優(yōu)系花青素合成通路的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)水平更高，其下游合成轉(zhuǎn)化能力更強(qiáng)。此外優(yōu)系中還特有的芍藥花色素、錦葵色素，這可能是優(yōu)系果肉呈現(xiàn)更深紫紅色的原因。

根據(jù)KEGG通路結(jié)果顯示，不同對比組篩選的差異代謝物參與植物代謝、次生代謝、花青素合成3 條途徑，共14種差異代謝物，主要分為矢車菊素、飛燕草素、芍藥花素和天竺葵素類物質(zhì)。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)天竺葵素-3-O-葡萄糖苷參與到三條代謝通路中，但該物質(zhì)含量甚少。先前研究表明天竺葵素-3-O-葡萄糖苷為草莓中主要的色素，可依據(jù)該物質(zhì)的有無，對草莓進(jìn)行分類[31]。此外，天竺葵素-3-O-葡萄糖苷還可影響金花茶組植物花色的鮮艷程度[32]。目前該物質(zhì)在柑橘中尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的細(xì)致研究。植物代謝途徑網(wǎng)絡(luò)交錯復(fù)雜，不同對比組所篩選的差異代謝物在代謝途徑扮演的角色還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

利用LC-MS/MS技術(shù)共檢測出‘塔羅科’血橙優(yōu)系及對照品種果實(shí)花青素代謝物共33種，主要成分均為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-丙二酰葡萄糖苷。‘塔羅科’血橙優(yōu)系較普通品種花青素含量高且代謝物種類多，優(yōu)系的內(nèi)膛和外圍果實(shí)分別檢測出33種花青素代謝物，且二者無差異代謝物，上述結(jié)果表明該‘塔羅科’血橙優(yōu)系中花青素的合成可能不受空間的影響；而對照品種‘塔羅科’血橙內(nèi)膛和外圍果實(shí)花青素代謝物分別檢測出27種和30種，差異代謝物達(dá)9種且均為上調(diào)代謝物。相比對照，‘塔羅科’血橙優(yōu)系具有花青素和可溶性固形物含量高、內(nèi)外膛著色差異小的顯著優(yōu)勢，該品種花青素的合成機(jī)制及開發(fā)利用仍有待后續(xù)深入研究。