趙 萍,劉俊霞,蘭阿峰,裴金金,陳德經(jīng),3,金文剛,3,*
(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室,陜西 漢中 723001;2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中 723001;3.陜西理工大學 陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西 漢中 723001)
大鯢(Andrias davidianus),俗稱“娃娃魚”,屬于動物界脊索動物門有尾目隱鰓鯢科,是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動物[1],迄今約有3.5億 年的歷史。大鯢具有極高的食用和藥用價值,其皮膚、黏液、肌肉、油、骨骼等含有多種生物活性物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗衰老等功效,是公認的寶貴生物資源,有“水中人參”之稱[2]。隨著大鯢養(yǎng)殖和繁殖技術(shù)的成熟,目前我國已在陜西漢中、湖南張家界、河南洛陽、重慶等多個省、市實現(xiàn)了規(guī)?;B(yǎng)殖[3]。近年來,研究人員已從大鯢的營養(yǎng)成分[4]、功能活性物質(zhì)[5]、食用品質(zhì)[6-7]、貯藏品質(zhì)[8]等多方面進行了研究。但在大鯢肉貯藏保鮮方面研究較少,且主要集中在應(yīng)用不同包裝方式[8]、貯藏方式[9]、凍結(jié)方式[10]延長大鯢肉的貨架期。
代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學之后,系統(tǒng)生物學的重要組成部分,它是以高通量檢測技術(shù)和多元數(shù)據(jù)處理為基礎(chǔ),通過研究小分子代謝物的變化,進而探究其代謝機制的新興科學[11]。在食品領(lǐng)域代謝組學的主要分析技術(shù)包括核磁共振技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatographymass spectrometry,LC-MS)聯(lián)用技術(shù)[12]等。其中LC-MS不需要對代謝物進行衍生化處理,即可進行定性和定量分析,具有分辨率高、靈敏度好、分析速度快等優(yōu)點,適合沸點高、極性強的化合物分析[13],是目前通過非靶向確定代謝表型最廣泛使用的方法[14]。超高效液相色譜(ultra-high performance LC,UPLC)是在高效液相色譜分離技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展的,其在制造技術(shù)、擴散體積和耐受壓力方面進行了優(yōu)化,能在很大限度上發(fā)揮色譜柱的效能。其中Yu Qi等[15]基于UPLC-MS非靶向代謝組學揭示電子束輻照中華管鞭蝦在冷藏過程中肌肉代謝的變化,獲得兩種潛在的生物標志物。Stella等[16]采用液相色譜-高分辨率質(zhì)譜非靶向代謝組學技術(shù)對新鮮、冷凍、解凍鱸魚進行研究,確定二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸為最相關(guān)的預測因子,并以此建立模型以達到根據(jù)鱸魚樣品的貯藏條件進行分類的目的。Yu Qianqian等[17]利用LC-MS研究牛腰長肌和大腰肌之間肌肉的能量代謝,從代謝層面揭示肌肉到食用肉轉(zhuǎn)化的內(nèi)在機制。
低溫保藏通常是既經(jīng)濟又實用的生鮮肉保鮮技術(shù),同時也是開發(fā)其他保鮮技術(shù)的基礎(chǔ),降低溫度一方面能減緩微生物的生長繁殖,另一方面可以降低酶活性[18]。但在冷藏過程中伴隨著肌肉的僵直與解僵、蛋白質(zhì)自溶、微生物生長繁殖等生化變化,進而導致肉的品質(zhì)發(fā)生變化。課題組前期探究大鯢肉在冷藏過程中揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen,TVB-N)、菌落總數(shù)等理化特性的變化并明確了冷藏期間主要致腐微生物菌屬為假單胞菌屬、氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium和沙雷氏菌屬[19-20]。在此基礎(chǔ)上,本研究進一步采用UPLCMS非靶向代謝組學技術(shù),結(jié)合多元統(tǒng)計方法篩選大鯢肉在冷藏過程中的差異代謝物,并分析差異代謝物的變化規(guī)律及相關(guān)代謝通路,為大鯢宰后肌肉代謝及冷藏期間品質(zhì)調(diào)控提供一定參考。
鮮活健康子二代大鯢3 尾,體質(zhì)量(2.5±0.36) kg,購自漢中市龍頭山大鯢養(yǎng)殖基地。
甲醇、甲酸、乙腈(均為色譜純) 美國賽默飛世爾科技有限公司,L-2-氯苯丙氨酸 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。
JXFSTPRP-24/32全自動樣品快速研磨儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司;F-060SD超聲波清洗機 深圳福洋科技集團有限公司;TGL-16MS臺式高速冷凍離心機上海盧湘儀離心機儀器有限公司;LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器 江蘇蘇州太倉市華美生化儀器廠;QE plus高分辨質(zhì)譜儀、Dionex U3000 UHPLC超高效液相色譜儀美國賽默飛世爾科技有限公司;ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱 美國沃特世公司。
1.3.1 樣品制備
鮮活大鯢經(jīng)放血、熱燙(95 ℃熱水,處理約1 min)、刮黏液、去內(nèi)臟和清洗后,用聚乙烯袋20 min內(nèi)運回實驗室。去頭、皮、四肢、尾,取背肌切成約5.0 cm×2.0 cm×0.5 cm的肉塊,放入黑色托盤中并用保鮮膜密封,置于4 ℃冰箱中冷藏。
以課題組前期對大鯢肉冷藏過程中TVB-N值和菌落總數(shù)等理化指標的研究結(jié)果為基礎(chǔ)[19-20],分別于宰后冷藏第0(新鮮)、2(貨架期之間)、4(貨架期)、8天(腐?。r取樣,每個取樣時間點取6個平行,分別記為D0(D0-1、D0-2、D0-3、D0-4、D0-5、D0-6),D2、D4、D8的標記與D0相似。在取樣時間點將樣品取出,置于超凈工作臺上,去除保鮮膜,用事先滅菌的剪刀將肉樣剪碎,混勻,用鑷子將其放入15 mL離心管中,置于-80 ℃冰箱待用。
1.3.2 樣品前處理
準確稱取30 mg組織樣品于1.5 mL EP管中,加入20 μL內(nèi)標(0.3 mg/mLL-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液)、600 μL甲醇-水溶液(4∶1,V/V),加入兩個小鋼珠。在-20 ℃冰箱中預冷2 min后,放入研磨機中60 Hz研磨2 min,經(jīng)冰水浴超聲提取(40 kHz、10 min)后,于-20 ℃冰箱中靜置30 min。13 000 r/min、4 ℃離心10 min后,用注射器吸取150 μL上清液,使用0.22 μm的有機相針孔過濾器過濾后,轉(zhuǎn)移到進樣小瓶,置于-80 ℃冰箱保存。
質(zhì)控(quality control,QC)樣品由所有樣品的提取液等體積混合制備而成。
1.3.3 UPLC-MS分析條件
UPLC條件:ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);柱溫:45 ℃;流動相:A:水(含0.1%甲酸),B:乙腈(含0.1%甲酸);流速:0.35 mL/min;進樣體積:2 μL。梯度洗脫程序:0~2 min,95% A、5% B;2~4 min,95%~70% A、5%~30% B;4~8 min,70%~50% A、30%~50% B;8~10 min,50%~20% A、50%~80% B;10~14 min,20%~0% A、80%~100% B;14~15 min,0% A、100% B;15~15.1 min,0%~95% A、100%~5% B;15.1~16 min,95% A、5% B。
MS條件:采用電噴霧離子源,在正離子和負離子掃描模式下采集數(shù)據(jù),噴霧電壓分別為3 800 V和-3 000 V,其他參數(shù)正負離子模式下相同。毛細管溫度:320 ℃;輔助器加熱溫度:350 ℃;鞘氣流速:35 arb;輔助氣流速:8 arb;離子透鏡射頻電壓:50 V;質(zhì)量掃描范圍:m/z100~1 200;全MS分辨率:70 000;MS/MS分辨率:17 500;歸一化碰撞能量:10、20、40 eV。
1.4.1 數(shù)據(jù)處理
在進行模式識別之前,原始數(shù)據(jù)使用Progenesis QI v2.3代謝組學處理軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化處理,主要參數(shù)如下:母離子質(zhì)量容差:5×10-6;子離子質(zhì)量容差:10×10-6;子離子閾值:5%(物質(zhì)峰的偏離程度)?;衔锏蔫b定基于精確質(zhì)量數(shù)、二級碎片以及同位素分析,使用EMDB數(shù)據(jù)庫進行定性。對得到的數(shù)據(jù)進行進一步處理,刪除組內(nèi)缺失值(0值)>50%的離子峰,將0值以最小值的一半替換,根據(jù)化合物定性打分,對定性得到的化合物進行篩選,篩選標準為36 分(滿分60 分),36 分以下視為定性結(jié)果不準確并刪除。最后將正負離子數(shù)據(jù)合并成一個數(shù)據(jù)矩陣表,該矩陣包含了從原始數(shù)據(jù)提取到的所有可用于分析的信息。
1.4.2 數(shù)據(jù)分析
以1.4.1節(jié)的數(shù)據(jù)矩陣為基礎(chǔ),利用SIMCA 14.1軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA);通過t-檢驗和變異倍數(shù)(fold change,F(xiàn)C)分析比較兩組之間代謝物數(shù)量差異;采用SPSS 25軟件進行顯著性分析,其中多重比較采用沃特-鄧肯法,P<0.05表示差異顯著;使用Origin 2021軟件繪圖,并利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)Pathway數(shù)據(jù)庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)進行代謝通路分析。
圖1 QC樣品正離子(A)和負離子(B)基峰圖Fig. 1 Positive ion (A) and negative ion (B) base peak chromatograms of QC samples
在檢測過程中,QC樣品用于評價質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性,以獲得可靠且高質(zhì)量的代謝組學數(shù)據(jù)。如圖1所示,QC樣品的基峰圖基線穩(wěn)定,說明儀器數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性很好。此外,正負離子模式下出峰的響應(yīng)強度、峰面積及峰數(shù)量有所不同。
圖2 QC組和實驗組PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot of QC and experimental groups
對QC樣品進行相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)篩選,刪除QC樣品中RSD>0.4的離子峰,并采用PCA法反映組間和組內(nèi)樣品之間變異度的大小,同時對系統(tǒng)穩(wěn)定性進行評價。如圖2所示,在95%置信區(qū)間冷藏4、8 d樣品組間分離度良好;而冷藏0、2 d樣品出現(xiàn)組間重疊現(xiàn)象,說明冷藏0、2 d樣品組間差異較小。各組內(nèi)樣品之間相互靠攏,表明樣品組內(nèi)變異度較小。QC樣品緊密聚集在一起,表明實驗穩(wěn)定性和重復性較好,滿足繼續(xù)實驗的條件。
2.2.1 不同冷藏時間大鯢肉的PCA
圖3 不同冷藏時間大鯢肉樣品的PCA得分圖Fig. 3 PCA score plot of giant salamander meat samples with different refrigeration time
PCA因無外加人為因素,其模型反映了代謝組學數(shù)據(jù)的原始狀態(tài),有利于掌握數(shù)據(jù)的整體情況并對數(shù)據(jù)從總體上進行把握,尤其有利于發(fā)現(xiàn)和剔除異常樣品,并提高模型的準確性。如圖3所示,說明擬合性較好,Q2=0.724>0.5,且與相差較小,說明模型的穩(wěn)定性較好。與冷藏0、2 d樣品相比,冷藏4、8 d組內(nèi)樣品分散程度較高,說明(0~2)、4、8 d之間樣品差異較大。
2.2.2 不同冷藏時間大鯢肉的PLS-DA
圖4 不同冷藏時間大鯢肉樣品PLS-DA得分圖(A)和響應(yīng)排序檢驗圖(B)Fig. 4 PLS-DA score plot (A) and response permutation test plot (B) of giant salamander meat samples with different refrigeration time
非監(jiān)督的PCA能夠直觀顯示樣品間的分組、變化趨勢和相似性關(guān)系,但差異變量會分布在PC上,無法在后面的分析中將其剔除做更準確的分析,同時對相關(guān)性較小的變量不敏感[21]。PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別統(tǒng)計方法,能實現(xiàn)對樣品類別的預測,加入了分組變量可彌補PCA的不足,模型中分別表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預測能力,這些值越接近于1表示模型的擬合度越好。如圖4A所示,Q2的值分別為0.842、0.984、0.903,證明PLS-DA模型能更好地解釋和預測樣品之間的差異,模型的預測能力較好。為防止模型過擬合,對PLS-DA模型進行7次循環(huán)交互驗證和200次響應(yīng)排序檢驗考查模型的質(zhì)量,其中R2、Q2為回歸直線與y軸的截距值,R2表示模型能夠解釋的方差總和,Q2表示模型的預測能力,使用響應(yīng)排序檢驗時,一般要求Q2小于零。如圖4B所示,R2=0.692,Q2=-0.321,回歸線呈向上的趨勢,沒有出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象,模型可靠,可用于后續(xù)的分析。
圖5 不同冷藏時間大鯢肉樣品中差異代謝物火山圖Fig. 5 Volcano diagrams of differential metabolites between giant salamander meat samples with different refrigeration time
單變量分析主要集中在單變量的描述(描述樣品數(shù)據(jù)的集中和離散趨勢)和統(tǒng)計推斷(從樣品資料推斷總體情況)兩個方面,用t-檢驗和FC分析比較兩組之間的代謝產(chǎn)物數(shù)量差異。以P<0.05,log2FC絕對值>1為標準,篩選差異代謝產(chǎn)物。如圖5所示,紅色圓點代表在比較組中顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物,綠色圓點代表顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物,藍色圓點代表不顯著的代謝產(chǎn)物。篩選結(jié)果顯示,冷藏0 d與2 d、2 d與4 d、4 d與8 d的樣品中差異表達代謝物分別為1 223(上調(diào)和下調(diào)代謝物分別為603、620個)、1 780(上調(diào)和下調(diào)代謝物分別為1 379、401個)、16 761個(上調(diào)和下調(diào)代謝物分別為9 676、7 085個),顯著差異代謝物的個數(shù)隨冷藏時間的延長呈增加的趨勢;3 組對比組樣品中上調(diào)代謝物分別占其顯著差異代謝物總數(shù)的49.30%、77.47%、57.73%,下調(diào)代謝物分別占其顯著差異代謝物總數(shù)的50.70%、22.53%、42.27%。
采用多維分析和單維分析相結(jié)合的方法,篩選組間差異代謝物。PLS-DA中,變量投影重要性指標(variable importance in projection,VIP)值可用來衡量各代謝物表達模式對各組樣品分類判別的影響強度和解釋能力。以PLS-DA模型PC1的VIP值≥2,t-檢驗的P≤0.001為標準進行進一步篩選,最終共得到125種差異代謝物,如表1所示。同時利用Origin繪制125種差異代謝物的熱圖,如圖6所示,熱圖聚類分析可將冷藏0、2 d組聚為一類,4 d組聚為一類,8 d組聚為一類,冷藏8 d樣品與其他組樣品有明顯差異。
圖6 不同冷藏時間大鯢肉樣品中差異代謝物熱圖Fig. 6 Heatmap of differential metabolites between meat samples of giant salamander with different refrigeration time
從表1觀察到17種有機酸類及其衍生物,其中肌酸的VIP值最高為23.13,其次為葡萄糖酸(VIP 8.95)、2,3-二氨基水楊酸(VIP 8.66),其余有機酸類及其衍生物的VIP值均小于6。將17種代謝物劃分為A1、B1兩類,其中A1類化合物在冷藏8 d明顯降低;與冷藏0 、2 d相比,Bl類化合物在冷藏4 d和8 d明顯增加。對A1、B1類化合物進行累積統(tǒng)計分析,其變化趨勢如圖7所示,A1類化合物累積豐度在冷藏0~2 d出現(xiàn)小幅度的上升,冷藏2~4 d出現(xiàn)小幅度的下降,冷藏4~8 d快速下降;B1類化合物累積豐度在整個冷藏過程中較A1類化合物波動小,但在冷藏4 d明顯向上波動。由表1可知,肌酸在脊柱動物體內(nèi),能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細胞提供能量,由精氨酸、甘氨酸及甲硫氨酸合成,其豐度在冷藏0、2、4 d較高,在冷藏8 d顯著下降(P<0.05)。葡萄糖酸是磷酸肌醇代謝的終產(chǎn)物,能進入磷酸戊糖途徑參與代謝,其豐度在冷藏4 d達到最大值。課題組前期的實驗結(jié)果表明,大鯢肉在冷藏后期(6、8 d)的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬[20],由表1可以看出,在冷藏8 d絕大部分有機酸類及其衍生物(A1類化合物)和氨基酸類及其衍生物(A3類化合物)豐度明顯降低,可能是由于假單胞菌屬的首選碳源為有機酸和氨基酸,而不是葡萄糖[22]。
表1 不同冷藏時間大鯢肉樣品差異代謝物篩選結(jié)果Table 1 Results of screening of differential metabolites in giant salamander meat samples with different refrigeration time
續(xù)表1
續(xù)表1
圖7 大鯢肉冷藏期間各類差異代謝物的變化Fig. 7 Changes in abundance of differential metabolites in giant salamander meat during cold storage
圖8 不同冷藏時間大鯢肉樣品差異代謝物中6 類酯類化合物豐度Fig. 8 Abundance of six differential ester compounds in giant salamander meat samples at different cold storage time
酯類及其衍生物共53種,是不同冷藏時間大鯢肉樣品中差異代謝物數(shù)量最多的一類化合物。所有酯類及其衍生物主要包括14種溶血磷脂酰膽堿類化合物(lysophosphatidylcholine,LysoPC)、13種磷脂酰膽堿類化合物(phosphatidyl choline,PC),2種磷脂酰乙醇胺類(phosphatidyl ethanolamine,PE),2種鞘磷脂類(sphingomyelin,SM),1種磷脂酸(phosphatidic acid,PA),1種溶血鞘磷脂(LysoSM)及一些其他的酯類化合物。如圖8所示,PC、PE、SM的豐度隨著冷藏時間的延長呈降低的趨勢,其中,PC類的豐度在6 類酯類化合物中占有絕對優(yōu)勢;LysoPC類冷藏4 d豐度最高,其次為8 d, 0、2 d豐度較低。所有酯類化合物中PC(14:1(9Z)/20:0)、LysoPC(18:1(11Z))的VIP值最大,分別為37.23、30.63,其次為LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))(VIP 22)、PC(18:1(9Z)/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))(VIP 18.52)、LysoPC(16:0)(VIP 16.48)、PC(20:1(11Z)/18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))(VIP 16.24)、LysoPC(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z))(VIP 15.93)、PC(16:1(9Z)/P-18:0)(VIP 15.55)、PC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z)/15:0)(VIP 14.08)、PC(14:1(9Z)/20:1(11Z))(VIP 13.06)、PC(14:0/20:2(11Z,14Z))(VIP 12.86),其余酯類及其衍生物的VIP值均小于10。將53種酯類及其衍生物劃分為A2、B2兩類,其中A2類化合物在冷藏8 d明顯降低;與冷藏0 d和2 d相比,B2類化合物在冷藏4、8 d明顯增加。如圖7所示,A2類化合物累積豐度在0~4 d緩慢下降,4~8 d快速下降;B2類化合物累積豐度在0~2 d波動不明顯,2~4 d顯著上升,4~8 d顯著下降。
脂質(zhì)氧化是導致肉類中脂肪組織惡化的主要原因,在生物系統(tǒng)中,脂質(zhì)通過光氧化、酶氧化和自氧化3種途徑氧化[23]。PC又稱卵磷脂,是生命體中分布最廣泛的磷脂,由表1可知,PC(18:1(9Z)e/2:0)在冷藏4、8 d豐度較0、2 d高且變化明顯(P<0.05);其他PC類化合物在冷藏0、2、4 d豐度較高,在冷藏8 d豐度顯著下降(P<0.05),與Yu Qi等[15]的研究結(jié)果相似,PCs作為所有質(zhì)膜的一部分,發(fā)揮著重要的作用,對新細胞的生長至關(guān)重要[24-25],多數(shù)PC在冷藏8 d顯著下降(P<0.05)標志著大鯢肉品質(zhì)的顯著下降。同時由于PCs分子中常有軟脂酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸等,因此,大鯢肉冷藏過程中,PC能在酶的作用下分解產(chǎn)生花生四烯酸參與沒食子酸的代謝,也可直接在酶的作用下分解為α-亞麻酸、亞油酸等物質(zhì)[15]。LysoPC是PC代謝的中間產(chǎn)物,除LysoPC(18:0)在冷藏0、2、4 d豐度較冷藏8 d高且變化顯著(P<0.05),其余LysoPC冷藏4、8 d豐度較高。PE俗稱腦磷脂,分子中的脂肪酸常有軟脂酸、硬脂酸、油酸及少量花生四烯酸,PE與PC的性質(zhì)相似,變化趨勢也與PC相似,在冷藏0、2、4 d豐度較高,在冷藏8 d豐度顯著下降(P<0.05)。PA是最簡單的二酰基甘油磷脂,細胞膜的組成成分,在冷藏0、2、4 d豐度較高,在冷藏8 d豐度顯著下降(P<0.05)。脂質(zhì)氧化主要發(fā)生在脂肪酸中,而存在于細胞膜和亞細胞結(jié)構(gòu)中的磷脂是脂質(zhì)氧化的良好底物,這可能是多數(shù)PC、PA、PE等磷脂類化合物在冷藏8 d顯著下降的主要原因[26]。SM是細胞膜與細胞生長、存活、死亡相關(guān)的結(jié)構(gòu)中普遍存在的組成部分,同時也是控制免疫效應(yīng)的信號代謝物[27],在冷藏0、2 d豐度顯著高于冷藏4、8 d(P<0.05),表明隨著冷藏時間的延長,大鯢肉逐漸喪失自身的免疫、抗菌等功能特性。
氨基酸類及其衍生物共25種,L-色氨醇的VIP值最高為17.67,其次為谷胱甘肽(VIP 10.12),L-組氨酸(VIP 9.10)、L-正亮氨酸(VIP 7.22),其他氨基酸類及其衍生物的VIP值均小于7。將25種代謝物劃分為A3、B3兩類,其中A3類化合物在冷藏8 d明顯降低,B3類化合物在冷藏0、8 d豐度較高。如圖7所示,A3類化合物與A1類化合物累積豐度變化趨勢相似,即在冷藏0~2 d緩慢上升,2~4 d緩慢下降,4~8 d迅速下降;B3類化合物即亮氨酰-亮氨酸,在整個冷藏過程中波動幅度不大。
除亮氨酰-亮氨酸外,其余氨基酸類化合物在冷藏8 d豐度較低,表明大鯢肉在冷藏過程中營養(yǎng)流失。在冷藏前期內(nèi)源性蛋白水解酶活性較高,肌原纖維蛋白被肌肉蛋白酶(鈣蛋白酶、催化蛋白酶等)分解成多肽片段,然后由肽基肽酶(二肽基肽酶、三肽基肽酶、氨基肽酶等)分解產(chǎn)生游離氨基酸[28],在冷藏后期豐度顯著下降,可能是由于以假單胞菌屬為主的致腐菌屬生長繁殖消耗[22]。通過KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn),L-精氨酸、鳥氨酸、L-谷氨酸主要參與必需氨基酸精氨酸的生物合成和分解代謝,在冷藏0、2 d豐度最高(表1);L-組氨酸、L-鵝肌肽主要參與組氨酸代謝,其中鵝肌肽為肌肽的甲基化衍生物,為組氨酸二肽,具有顯著的抗氧化作用,是肉類的內(nèi)源性抗氧化劑,對保持肉類品質(zhì)[29]、形成良好的風味和細嫩的質(zhì)地具有重要作用[30],這些物質(zhì)的豐度隨著冷藏時間的增加而降低(表1),表明大鯢肉自身抗氧化性降低;大部分氨基酸主要參與氨酰-tRNA生物合成和ABC-轉(zhuǎn)運器。所有篩選出來的氨基酸類及其衍生物中沒有明顯的代謝物導致大鯢肉品質(zhì)惡化,但游離氨基酸可能是細菌的生長促進劑[31]。
核苷酸類及其衍生物13種,別嘌呤醇核糖苷的VIP值最大為15.76,其次為次黃嘌呤(VIP 12.07)、阿糖肌苷(VIP 11.77)、肌苷(VIP 11.16),其余核苷酸類及其衍生物的VIP值均小于7。將13種核苷酸類及其衍生物分為A4、B4兩類,其中A4類化合物在冷藏8 d明顯降低,與冷藏0、2 d相比,B4類化合物在冷藏4、8 d明顯上升。如圖7所示,A4類化合物累積豐度在冷藏過程中呈降低的趨勢,且趨勢接近線性,而B4類化合物在冷藏4、8 d出現(xiàn)波動,但波動幅度不大。
核苷酸類及其衍生物中二磷酸腺苷和2'-脫氧鳥苷-5'-二磷酸三鈉鹽在冷藏0、2、4 d豐度無顯著差異(P>0.05),在冷藏8 d顯著降低(P<0.05)(表1)。在冷藏過程中三磷酸腺苷主要由磷酸肌酸途徑和無氧糖酵解途徑產(chǎn)生,隨后三磷酸腺苷逐漸降解,降解的一般過程為[32]:三磷酸腺苷→二磷酸腺苷→單磷酸腺苷→次黃嘌呤核苷酸→肌苷→次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸。
隨著三磷酸腺苷的降解,二磷酸腺苷、2'-脫氧鳥苷-5'-二磷酸三鈉鹽的豐度逐漸增加,并分別在冷藏2、4 d豐度達到最大值后逐漸降低。次黃嘌呤、肌苷、5'-肌苷酸在冷藏0 d豐度最高,之后顯著降低(P<0.05),在冷藏8 d達到最小值;而黃嘌呤隨著冷藏時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,在冷藏4 d達到最大值后降低,但冷藏8 d豐度仍大于冷藏0、2 d。次黃嘌呤已被確定為水產(chǎn)品新鮮度的潛在生物標志物[33],次黃嘌呤是一種與炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝標志物,能通過增加內(nèi)源性黃嘌呤氧化酶活性提高抗菌性能,但在本實驗中次黃嘌呤下調(diào)可能是大鯢肉細胞的抗菌特性減弱,同時作為三磷酸腺苷的分解產(chǎn)物,其下調(diào)也可能與三磷酸腺苷總量的減少有關(guān)[34]。
醇類及其衍生物3種,均在冷藏8 d豐度最低且變化顯著(P<0.05);反-2-戊醇的VIP值最大為3.95,其次為氧化芳樟醇(VIP 3.04),雄甾烷-3α,17β-二醇(VIP 2.29)。其他類化合物共14種,以去甲基西酞普蘭的VIP值最大為5.10,其余化合物的VIP值均小于4。尸胺(1,5-二氨基戊烷)在冷藏2 d開始被檢出,與冷藏0 d無顯著差異(P>0.05),在冷藏4 d顯著增加(P<0.05)并達到最大值。這可能與該冷藏期微生物的種類和豐度有關(guān),王純純等[35]研究表明,尸胺的產(chǎn)生與沙雷氏菌屬、短乳桿菌、片球菌等菌屬密切相關(guān),同時假單胞菌屬、乳酸桿菌等可促進尸胺等生物胺的形成,課題組前期對微生物多樣性的研究結(jié)果揭示[20],在冷藏4 d沙雷氏菌屬的豐度最高,除此之外假單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium等也有相對較高的豐度,這些菌屬在冷藏4 d的變化有利于尸胺的形成。尸胺是一種對人體有害的化合物,但是它對人體健康的危害需要達到一定的量,同時尸胺作為一個單一的生物胺代謝物,不能單獨作為評價大鯢肉品質(zhì)的指標,仍需結(jié)合多個指標綜合進行判定,但該物質(zhì)在冷藏后期的增加,表明大鯢肉的品質(zhì)發(fā)生了劣變。
大鯢肉冷藏過程中品質(zhì)的變化受多種物質(zhì)和反應(yīng)共同調(diào)控,不能僅從某一物質(zhì)含量的高低進行整體判斷,因此仍需進一步對其代謝通路進行分析。通過KEGG數(shù)據(jù)庫比對,富集到80 條代謝通路中的差異代謝物共144種,其中差異顯著(P<0.05)的代謝通路共19 條,富集到這19 條代謝通路的差異代謝物共54種,基本信息如表2所示,差異代謝通路的總體情況如圖9所示。
表2 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝通路基本信息Table 2 Basic information of differential metabolic pathways in giant salamander meat at different cold storage time
續(xù)表2
圖9 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝通路富集氣泡圖Fig. 9 Enrichment analysis of differential metabolic pathways in giant salamander meat at different refrigeration time
氣泡圖中,顏色由黃到藍表示P值依次降低;氣泡越大,表明富集到該通路的差異代謝物數(shù)目越多。由表2及圖9可知,差異極顯著的前5 條通路分別為組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、嘌呤代謝、精氨酸生物合成、鞘脂類代謝;富集差異代謝物數(shù)量最多的5 條通路分別為嘌呤代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、組氨酸代謝、賴氨酸降解、鞘脂代謝;富集的差異代謝物中L-谷氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、組氨酸、鳥氨酸、酮戊二酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷等參與多條差異代謝通路。所有代謝通路中氨基酸類代謝通路最多,為7 條。
2.6.1 代謝通路與微生物、理化指標進行相關(guān)性分析
對19 條差異顯著(P<0.05)的代謝通路與課題組之前的研究結(jié)果(大鯢肉在相同冷藏條件下的致腐微生物菌屬、TVB-N值、菌落總數(shù))進行Pearson相關(guān)性分析[19-20],結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明,磷酸戊糖途徑與其他代謝途徑之間均無顯著相關(guān)(P>0.05);與鐵死亡、谷胱甘肽代謝、壞死性凋亡、嘌呤代謝通路呈顯著相關(guān)(P<0.05)的代謝通路較少;而與氨基酸類代謝通路(組氨酸代謝、精氨酸代謝、賴氨酸降解、?;撬岷痛闻;撬岽x、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成)和翻譯通路(氨酰-tRNA生物合成)顯著(P<0.05)相關(guān)的代謝通路較多。除嘌呤代謝、壞死性凋亡、谷胱甘肽代謝、鐵死亡代謝通路、磷酸戊糖途徑以外,其余代謝通路與TVB-N值均顯著(P<0.05)負相關(guān)。除溶酶體、鐵死亡、促性腺激素信號通路、磷酸戊糖途徑以外,其余代謝通路與菌落總數(shù)均顯著(P<0.05)負相關(guān)。致腐微生物總體與代謝通路之間的相關(guān)性較差,僅壞死性凋亡與氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium之間顯著(P<0.05)負相關(guān),但菌落總數(shù)與多條代謝通路的相關(guān)性較強,可能是由于代謝物的富集受多種微生物共同作用,單一微生物發(fā)揮的作用較小。綜上并結(jié)合表2,組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成、賴氨酸降解、?;撬岷痛闻;撬岽x、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、鞘脂類代謝、細胞間隙連接、神經(jīng)活性配體-受體相互作用代謝通路與大鯢肉品質(zhì)的變化關(guān)系密切,目前,也有研究指出嘌呤代謝和組氨酸代謝是與腐敗顯著相關(guān)的代謝通路[15,36]。
2.6.2 代謝物與微生物、理化指標進行相關(guān)性分析
選取19 條差異代謝途徑中VIP值≥3、P<0.05的代謝物與課題組之前的研究結(jié)果(大鯢肉在相同冷藏條件下的致腐微生物菌屬、TVB-N值、菌落總數(shù))進行Pearson相關(guān)性分析[19-20],結(jié)果如圖11所示。
圖10 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝通路、微生物及理化指標Pearson相關(guān)性分析Fig. 10 Pearson correlation analysis of differential metabolic pathways, microorganisms and physicochemical indexes in giant salamander meat at different refrigeration time
圖11 不同冷藏時間大鯢肉中差異代謝物、微生物及理化指標Pearson相關(guān)性分析Fig. 11 Pearson correlation analysis of differential metabolites, microorganisms and physicochemical indexes in giant salamander meat at different refrigeration time
由圖11可知,次黃嘌呤、肌苷、谷胱甘肽、5'-肌苷酸、鳥苷之間相關(guān)性較強;肌酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、組氨酸、1-甲基-L-組氨酸、鳥氨酸、L-精氨酸、植物鞘氨醇、L-脯氨酸、二磷酸腺苷之間相關(guān)性較強,其都與TVB-N值顯著(P<0.05)負相關(guān),以肌酸、L-組氨酸、組氨酸、1-甲基-L-組氨酸、植物鞘氨醇的相關(guān)性最強;(3S)-3,6-己酸二氨基酯、SM(d18:1/18:1(11Z))、2-哌啶甲酸、鳥嘌呤之間相關(guān)性較強。L-谷氨酸與菌落總數(shù)之間具有極顯著(P<0.01)相關(guān),肌酸、L-組氨酸、組氨酸、鳥氨酸、L-精氨酸、植物鞘氨醇、(3S)-3,6-己酸二氨基酯、SM(d18:1/18:1(11Z))、2-哌啶甲酸與菌落總數(shù)之間具有顯著(P<0.05)相關(guān)。與理化指標相比,致腐微生物與差異代謝物之間的相關(guān)性不強,其中鳥嘌呤與假單胞菌屬之間具有顯著(P<0.05)負相關(guān),(3S)-3,6-己酸二氨基酯、SM(d18:1/18:1(11Z))、2-哌啶甲酸、鳥嘌呤與氣單胞菌屬、Hafnia-Obesumbacterium之間具有顯著(P<0.05)負相關(guān)。綜上并結(jié)合表2,肌酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、組氨酸、鳥氨酸、L-精氨酸、植物鞘氨醇可作為大鯢肉冷藏過程中品質(zhì)變化的潛在生物標記物。
采用UPLC-MS非靶向代謝組學技術(shù)對大鯢肉冷藏過程中(4 ℃,0、2、4、8 d)肌肉小分子代謝物進行研究。通過多元統(tǒng)計分析表明,在冷藏過程中,冷藏0、2 d組間和組內(nèi)差異較小,冷藏4、8 d組間和組內(nèi)差異相對較大;單變量統(tǒng)計分析表明,隨著冷藏時間的延長,上調(diào)代謝物的個數(shù)呈增加趨勢,下調(diào)代謝物的個數(shù)呈先減少后增加的趨勢;以VIP值≥2、P≤0.001為篩選標準,共篩選出125種差異代謝物,包括有機酸類及其衍生物(17種)、酯類及其衍生物(53種)、氨基酸類及其衍生物(25種)、核苷酸類及其衍生物(13種)等;對差異代謝物的變化規(guī)律進行分析發(fā)現(xiàn),大部分差異代謝物在冷藏8 d豐度明顯下降;代謝通路富集及Pearson相關(guān)性分析表明,組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、精氨酸生物合成、賴氨酸降解、牛磺酸和次?;撬岽x、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、氨酰-tRNA生物合成、鞘脂類代謝、細胞間隙連接、神經(jīng)活性配體-受體相互作用代謝通路與大鯢肉品質(zhì)的變化關(guān)系顯著;肌酸、L-組氨酸、L-谷氨酸、組氨酸、鳥氨酸、L-精氨酸、植物鞘氨醇可作為大鯢肉冷藏過程中品質(zhì)變化的潛在生物標記物。該研究為大鯢肉宰后肌肉代謝及冷鮮肉品質(zhì)控制提供了參考。