劉碧琴，傅 紅，楊 方，劉少明，高晨生，陳 珊

（1.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州 350108；2.福州海關技術中心，福建 福州 350001；3.福建滿堂香茶葉股份有限公司，福建 福州 350001）

酚酸及縮酚酸是茶葉多酚類物質(zhì)中的一種[1]，酚酸是指苯環(huán)上有多個酚羥基取代的芳香族羧酸類化合物，縮酚酸是由酚酸上的羧基與另一酚酸分子上的羥基縮合而成的化合物。酚酸廣泛存在于水果、蔬菜、糧食等植物中，目前已從植物中分離出多種酚酸類化合物，主要包括沒食子酸類、茶多酚類、間苯三酚類、綠原酸及奎寧酸類衍生物、聚黃烷醇多酚及苯丙素類化合物等[2]。近年來，大量研究表明酚酸類化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌等生理活性作用，對防御紫外線輻射和降低多種疾病的發(fā)生等效果顯著[3-5]。

酚酸類化合物在包括茶葉在內(nèi)的各類植物中發(fā)揮重要的生理活性作用[6-8]，酚酸類化合物本身存在形式復雜，在茶葉等植物中少量以游離型酚酸存在，主要是以酯鍵、糖苷鍵、醚鍵與其他物質(zhì)（纖維素、蛋白質(zhì)、黃酮、單糖、有機酸等）結合的形式存在，包括游離酯型、結合型和糖苷型酚酸等[9-10]。由于酚酸結構中有較多的酚羥基取代，結構并不穩(wěn)定，容易受到水分、溫度、光、酶等自然因素的影響而改變，給分析帶來一定困難。

目前，酚酸類化合物的分析方法主要有分光光度法[11-12]、液相色譜法[13-15]、超高效液相色譜-質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）聯(lián)用法[16-18]等。采用UPLC-MS/MS的多重反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行定性定量分析，更適用于多種酚酸類化合物的分離和測定。趙珊等[17]在分析游離型、游離酯型和結合型酚酸的基礎上加入糖苷型酚酸的分析，建立了UPLC-MS/MS測定稻米中19種酚酸類化合物的分析方法，該方法分析時間短、靈敏度高且重復性好；馬帥等[18]利用UPLC-MS/MS法測定了花椰菜和西蘭花中23種酚酸類化合物，該方法簡便、快速。目前稻米、蔬菜等基質(zhì)中酚酸類化合物的測定[17-20]方法相對完善，但關于茶葉中酚酸類化合物測定的報道較少，且涉及的酚酸種類和形態(tài)均較為單一，主要集中在游離型酚酸測定方法的開發(fā)[21-23]，鮮見報道茶葉中結合型酚酸的分析方法。為了更全面、深入地了解酚酸類化合物在茶葉中的組成類型、分布和含量，本實驗在前人研究[17-21,23-25]基礎上，對茶葉中游離型、游離酯型、結合型、可溶性和不溶性糖苷型酚酸的前處理及儀器條件進行優(yōu)化比較，開發(fā)建立方便、快捷的UPLC-MS/MS聯(lián)用的痕量分析檢測方法，為快速全面富集、檢測茶葉中酚酸類化合物提供一種新的思路，同時為其他植物中該類化合物的測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沒食子酸（gallic acid，GA）、綠原酸（chlorogenic acid，CGA）、水楊酸（salicylic acid，OHBA）（純度＞96%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司；咖啡酸（caffeic acid，CFA）、對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid，PHBA）、對香豆酸（p-coumaric acid，PCMA）、鞣花酸（ellagic acid，EGA）、阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)RA）、丁香酸（syringic acid，SRA）、新綠原酸（neochlorogenic acid，NCGA）、香草酸（vanillic acid，VNA）、3-羥基肉桂酸（trans-m-coumaric acid，TMCMA）、2-羥基肉桂酸（trans-o-coumaric acid，TOCMA）、異阿魏酸（isoferulic acid，IFRA）、反式肉桂酸（trans-cinnamic acid，TCNA）（EGA純度＞89%，其他酚酸純度＞98%） 北京曼哈格生物科技有限公司；原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）、2,3-二羥基苯甲酸（2,3-dihydroxybenzoic acid，2,3-diHBA）（純度＞97%） 美國ChromaDex公司；芥子酸（sinapic acid，SNA）、龍膽酸（gentisic acid，GTA）、3,5-二羥基苯甲酸（3,5-dihydroxybenzoic acid，3,5-diHBA）、奎寧酸（quinic acid，QNA）（純度＞98%） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；香豆酸（coumaric acid，CMA）、2,3,4-三羥基苯甲酸（2,3,4-trihydroxybenzoic acid，2,3,4-triHBA）（純度＞97%） 日本TCI公司；乙腈、甲醇（均為色譜純）美國Fisher Scientific公司；甲酸（優(yōu)級純） 美國Merck公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisd，BHA）（均為分析純） 上海麥克林生化科技有限公司；Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL） 美國Waters公司。

1.2 儀器與設備

Nexera X2 LC-30A超高效液相色譜儀 日本島津公司；3200 QTRAP質(zhì)譜儀、Analyst Software 1.5工作軟件 美國AB SCIEX公司；SBHCONC/1氮吹儀英國Stuart公司；低溫高速離心機 美國Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 游離型及游離酯型酚酸的提取

稱取約0.5 g樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 70%甲醇溶液，40 ℃超聲提取30 min，10 000 r/min離心5 min后將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，重復上述提取步驟，合并上清液，用體積分數(shù)0.28%甲酸溶液（pH 2）定容至50 mL得到游離型酚酸提取液，凈化后測定游離型酚酸；取上述收集的上清液，40 ℃氮吹至約2 mL，加入2 mL 4 mol/L NaOH溶液（含1 g/100 mL抗壞血酸和10 mmol/L EDTA），充入氮氣于40 ℃振蕩避光水解4 h，以4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2，3×2 mL乙酸乙酯（含1 g/500 mL BHA）渦旋萃取，合并萃取液于40 ℃氮吹近干，以5 mL 50%甲醇溶液復溶，取1 mL復溶液加入4 mL體積分數(shù)0.28%甲酸溶液得到游離酯型酚酸提取液，凈化后測定游離酯型酚酸。

1.3.2 結合型酚酸的提取

取1.3.1節(jié)離心后殘渣加入3 mL水和3 mL 4 mol/L NaOH溶液（含1 g/100 mL抗壞血酸和10 mmol/L EDTA），充氮于40 ℃振蕩避光水解4 h，以4 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2，以3×2 mL乙酸乙酯（含1 g/500 mL BHA）渦旋萃取，合并萃取液于40 ℃氮吹近干，以5 mL 50%甲醇溶液復溶，取1 mL復溶液加入4 mL體積分數(shù)0.28%甲酸溶液，待凈化。

1.3.3 可溶性糖苷型酚酸的提取

于1.3.1節(jié)游離酯型酚酸提取液中加入1.5 mL 4 mol/L HCl溶液，85 ℃水浴水解1 h，以4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2，3×2 mL乙酸乙酯（含1 g/500 mL BHA）渦旋萃取，合并萃取液于40 ℃氮吹近干，以5 mL 50%甲醇溶液復溶，取1 mL復溶液加入4mL體積分數(shù)0.28%甲酸溶液，待凈化。

1.3.4 不溶性糖苷型酚酸的提取

于1.3.2節(jié)提取液中加入1.5 mL 4 mol/L HCl溶液，85 ℃水浴水解1 h，以4 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2，用3×2 mL乙酸乙酯（含1 g/500 mL BHA）渦旋萃取，合并萃取液于40 ℃氮吹近干，以5 mL 50%甲醇溶液復溶，取1 mL復溶液加入4 mL體積分數(shù)0.28%甲酸溶液，待凈化。

茶葉樣品中不同形態(tài)酚酸提取流程圖見圖1。

圖1 茶葉樣品中不同類型酚酸提取流程圖Fig. 1 Flow chart for the extraction of different types of phenolic acid from tea samples

1.3.5 凈化

HLB SPE凈化[26]：先后以3 mL甲醇、3 mL體積分數(shù)0.28%甲酸溶液（pH 2）活化小柱，取1 mL樣液過柱，6 mL甲醇洗脫，洗脫液氮吹至近干后用1 mL 50%甲醇溶液復溶，過0.22 μm濾膜，待測。

MAX SPE凈化[27]：先后以3 mL甲醇、3 mL去離子水和3 mL體積分數(shù)5%氨水活化小柱，取1 mL樣液過柱，6 mL 5%甲酸-甲醇溶液洗脫，洗脫液氮吹至近干后用1 mL 50%甲醇溶液復溶，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3.6 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.6.1 UPLC條件

Torus 1-AA色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流動相：A為乙腈，B為0.02%甲酸溶液；流速0.5 mL/min；梯度洗脫程序：0～1.0 min，10% A、90% B；1.0～1.5 min，10%～15% A、90%～85% B；1.5～3.5 min，15%～25% A、85%～75% B；3.5～4.0 min，25%～28% A、75%～72% B；4.0～5.0 min，28%～30% A、72%～70% B；5.0～5.5 min，30%～90% A、70%～10% B；5.5～7.5 min，90% A、10% B；7.5～8.0 min，90%～10% A、10%～90% B；8.0～12.0 min，10% A、90% B。

1.3.6.2 MS條件

電噴霧離子源；MRM模式；掃描模式：TCNA為正離子模式，其他酚酸為負離子模式；霧化電壓4 500 V；離子化溫度400 ℃；霧化氣壓力345 kPa；輔助氣壓力345 kPa；碰撞氣為Medium；氣簾氣壓力207 kPa；具體參數(shù)見表1。

表1 酚酸類化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for phenolic acid compounds

2 結果與分析

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

采用UPLC-MS/MS的MRM模式進行定性定量分析，比較C18色譜柱、HHS T3色譜柱、Torus 1-AA色譜柱對23種酚酸的分離效果及峰形的影響，結果表明Torus 1-AA色譜柱可實現(xiàn)23種酚酸的分離，且峰形優(yōu)于前兩者。文獻[17]報道流動相中添加少量甲酸可改善峰形，提高分離效果。本實驗比較在水相中添加體積分數(shù)0.01%、0.02%、0.05%和0.1%甲酸對酚酸化合物分離效果的影響，結果表明若水相中甲酸含量過高（當增至0.05%時），PCA和3,5-diHBA、PCMA和TMCMA分離效果不佳，甲酸過低（0.01%）則效果不明顯。最終采用乙腈-0.02%甲酸溶液作為流動相，可獲得較好的分離效果，混合對照品中酚酸類化合物的總離子流色譜圖見圖2，樣品中酚酸類化合的總離子流色譜圖見圖3。

取100 ng/mL 23種酚酸化合物標準溶液，分別在全掃描模式下進行質(zhì)譜條件優(yōu)化。結果除肉桂酸外，其余目標化合物在負離子模式下響應更高。通過子離子掃描得到目標物碎片離子信息，選擇響應最強的產(chǎn)物離子作為23種酚酸化合物的定量離子和定性離子，并對去簇電壓和碰撞能量等進行優(yōu)化，結果見表1。

圖2 23種酚酸類化合物標準品的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of mixture of 23 phenolic acid standards

圖3 茶樣中酚酸類化合物的總離子流色譜圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of phenolic acid compounds in tea samples

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 游離型酚酸提取條件的優(yōu)化

酚酸類化合物為極性化合物，易溶于水和甲醇[24]，現(xiàn)有報道[17-20]采用甲醇-水溶液提取游離型酚酸。本實驗比較去離子水、甲醇和不同比例的甲醇溶液（甲醇體積分數(shù)分別為50%、70%和90%）對茶葉中游離型酚酸提取效率的影響。結果表明，除GA外，甲醇溶液對大部分酚酸類化合物的提取效果優(yōu)于純水和純甲醇，其中70%甲醇溶液的提取效率總體最佳（圖4），因此最終選用70%甲醇溶液作為提取溶劑。

圖4 提取溶劑對提取效率的影響Fig. 4 Effects of different solvents on the extraction efficiency

2.2.2 堿水解、酸水解條件的優(yōu)化

2.2.2.1 堿水解對酚酸類化合物的提取效率

對游離型酚酸提取液及提取后的樣品殘渣分別進行堿水解，可分別釋放茶葉基質(zhì)中存在的游離酯型酚酸和結合型酚酸。以往研究表明[17,28]，酚酸類化合物在堿水解過程中會產(chǎn)生不同程度的損失。通過對比不同堿水解條件，發(fā)現(xiàn)在未加保護劑的情況下，GA、2,3,4-triHBA、3,5-diHBA、PCA、CFA、2,3-diHBA和GTA等均發(fā)生一定程度的降解，回收率均低于51%；QNA、CMA、CGA和NCGA降解嚴重，均無法測定回收率（圖中未顯示）。嘗試在堿水解過程中添加抗壞血酸和EDTA等保護劑，結果表明除嚴重降解的QNA、CGA、NCGA和CMA外，其余19種酚酸類化合物的回收率均有所提高，回收率提高至75.3%～108.9%（圖5），可見加入一定的保護劑能有效防止部分酚酸類化合物的降解。研究報道[29-30]QNA和CMA在堿水解過程中極易發(fā)生氧化降解和熱分解，CGA和NCGA在堿性條件下完全水解為QNA和CFA，因此上述4種酚酸類化合物即使在添加保護劑條件下水解，其降解現(xiàn)象并未得到改善。在此基礎上，進一步比較堿水解濃度和時間對酚酸類化合物回收率的影響，經(jīng)比較，在2 mol/L NaOH溶液中添加1 g/100 mL抗壞血酸和10 mmol/L EDTA、水解4 h的效果最佳。

圖5 堿水解溶液對酚酸類化合物提取效率的影響（n=3）Fig. 5 Effects of different alkaline solutions on the extraction efficiency of phenolic acids (n = 3)

2.2.2.2 酸水解對酚酸類化合物的提取效率

為釋放茶葉基質(zhì)中存在的可溶性和不溶性糖苷型酚酸，需在堿水解的基礎上進一步酸水解。通過對比不同酸水解條件，發(fā)現(xiàn)在未添加保護劑的情況下，GA、PCMA、FRA、OHBA、EGA、CFA和TCNA等均發(fā)生降解，回收率均低于67%；QNA、CGA、NCGA和CMA等降解嚴重，均無法測得回收率，這一結果與Maria[28]和Mattila[31]等的研究一致。在酸水解過程中添加抗壞血酸和EDTA等保護劑，但酚酸類化合物的降解現(xiàn)象未能得到明顯的改善（圖6）。

圖6 酸水解溶液對酚酸類化合物提取效率的影響（n=3）Fig. 6 Effects of different acid solutions on the extraction efficiency of phenolic acids (n = 3)

2.2.2.3 酸水解濃度和時間對酚酸類化合物的提取效率

通過對比不同酸水解條件，發(fā)現(xiàn)隨著酸濃度的增加和水解時間的延長，除VNA和GTA外，其余酚酸類化合物降解越來越嚴重（圖7），其原因在于酚酸類化合物在不同酸水解條件下的降解敏感性不同，較高的酸濃度和較長的水解時間均加重了酚酸類化合物的氧化降解[31]；而較低酸濃度（低于0.5 mol/L）和較短的水解時間（小于0.5 h）均無法釋放糖苷型酚酸，綜合考慮酸水解條件選擇1 mol/L HCl溶液水解1 h。

圖7 酸水解濃度和酸水解時間對酚酸類化合物提取效率的影響（n=3）Fig. 7 Effects of different acid concentrations and hydrolysis times on the extraction efficiency of phenolic acids (n = 3)

2.2.3 凈化方式的選擇

茶葉樣品基質(zhì)較為復雜，前期實驗結果表明，若將茶葉提取液直接上機分析，各化合物絕對基質(zhì)效應[32]為44.1%～79.7%，存在明顯基質(zhì)抑制。比較HLB和MAX SPE柱的凈化效果，結果表明，2種SPE柱均有較好的凈化效果，凈化后23種酚酸化合物的絕對基質(zhì)效應分別為84.9%～108.2%和83.6%～110.8%，基質(zhì)效應得到明顯改善。鑒于MAX SPE柱在凈化時需調(diào)節(jié)溶液pH值[27]，操作相對繁瑣，最終采用HLB SPE柱凈化。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性、檢出限、定量限、精密度、穩(wěn)定性結果

配制不同質(zhì)量濃度梯度的酚酸標準溶液，按已建立的方法進樣分析，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）繪制標準曲線，計算標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)。結果表明，23種酚酸類化合物在50～1 000 μg/L范圍內(nèi)線性良好（r≥0.996 0），可以滿足定量分析的要求。以3 倍信噪比計算檢出限（limits of detection，LOD），質(zhì)量濃度范圍為0.03～8.34 μg/L；以10 倍信噪比計算定量限（limits of quantification，LOQ），質(zhì)量濃度范圍為0.10～25.00 μg/L，具體結果見表2。

表2 23種酚酸的線性方程、相關系數(shù)、LOD、LOQ、精密度和穩(wěn)定性（n=6）Table 2 Linear equations, correlation coefficients, limits of detection,limits of quantification, precision and stability for 23 phenolic acids (n = 6)

取100 μg/L的混合標準溶液連續(xù)進樣6次，計算23種目標成分峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察其精密度；取同一樣品分析溶液，分別在0、2、4、8、12 h和24 h進樣6次，測定目標化合物峰面積的RSD，考察其穩(wěn)定性。結果見表2，23種酚酸類化合物精密度的RSD范圍為0.50%～4.58%，穩(wěn)定性的RSD范圍為0.53%～8.84%，具有較高的精密度和較好的穩(wěn)定性。

2.3.2 準確度結果

按照1.3.1節(jié)方法稱取試樣并進行樣品制備，根據(jù)樣液中酚酸質(zhì)量濃度加入不同質(zhì)量濃度的標準物質(zhì)，進行茶葉中游離型酚酸的回收實驗，結果見表3。茶葉樣品中游離型酚酸的回收率為71.14%～105.43%，RSD為4.09%～7.25%。

取1.3.1節(jié)收集的上清液，根據(jù)樣液中酚酸質(zhì)量濃度加入不同質(zhì)量濃度的標準物質(zhì)，按照1.3.1節(jié)中游離酯型酚酸的提取方法進行樣品制備，以及茶葉中游離酯型酚酸的回收實驗；另取1.3.1節(jié)游離酯型酚酸提取液，根據(jù)樣液中酚酸質(zhì)量濃度加入不同質(zhì)量濃度的標準物質(zhì)，按照1.3.3節(jié)方法進行樣品制備，以及茶葉中可溶性糖苷型酚酸的回收實驗，結果見表3。結果表明，茶葉樣品中游離酯型和可溶性糖苷型酚酸的回收率分別為82.81%～108.93%、39.09%～102.25%，RSD分別為4.04%～9.01%、3.93%～11.63%；此外如2.2.2節(jié)所述，QNA、CMA、CGA和NCGA在水解過程中降解嚴重，無法進行回收率驗證。

2.4 實際樣品檢測

采用本法對市售綠茶、白茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶（熟茶）共15 份進行檢測，每個樣品重復測定3次，結果見圖8。每種茶葉樣品均鑒定出14種酚酸類化合物，GA、QNA和PCMA的含量相對較高，分別為6.52～10.41、0.19～0.85 mg/g和0.19～0.40 mg/g；VNA、EGA和FRA的含量較低，均低于0.08 mg/g。每種茶葉樣品均鑒定出9種游離型酚酸，分別為GA、CGA、QNA、PCMA、FRA、OHBA、PCA、NCGA、PHBA；8種游離酯型酚酸和8種結合型酚酸，分別為GA、PHBA、PCMA、PCA、FRA、OHBA、TCNA、CFA；9種可溶性糖苷型酚酸和9種不溶性糖苷型酚酸，分別為GA、PCMA、PHBA、PCA、EGA、VNA、CFA、IFRA、OHBA，各形態(tài)酚酸中游離型和游離酯型酚酸含量較高（圖9），分別為1.93～3.58 mg/g和2.35～5.15 mg/g，約占酚酸總量的16.40%～35.21%和30.02%～45.50%。不同茶葉樣品酚酸總含量由高到低依次為白茶＞綠茶＞烏龍茶＞紅茶＞普洱茶，酚酸總含量范圍為7.84～12.90 mg/g，其中白茶中酚酸類化合物含量最高，酚酸類化合物總含量為12.90 mg/g，白茶經(jīng)自然干燥制成，其酚酸類化合物的種類和含量較為豐富。

表3 23種酚酸在茶葉樣品中的加標回收率（n=6）Table 3 Recoveries of 23 phenolic acids in spiked tea samples (n = 6)

圖8 不同茶葉樣品酚酸化合物的組成和含量（n=3）Fig. 8 Composition and content of phenolic acids in different tea samples (n = 3)

圖9 不同類型酚酸在茶葉中的分布情況Fig. 9 Distribution of different types of phenolic acid in tea

3 結 論

建立UPLC-MS/MS測定茶葉中的23種酚酸類化合物的分析方法。在前處理的堿水解過程中加入保護劑，有效改善了部分酚酸類化合物的降解，在測定中增加游離酯型、結合型、可溶性糖苷型和不溶性糖苷型酚酸的鑒定和分析，使茶葉中酚酸的鑒定更加全面。通過方法學驗證，證明該法具有分析時間短、靈敏度高且重復性好等特點，可應用于實際茶葉樣品中酚酸類化合物的直接測定，方法的建立為快速全面富集、檢測茶葉中多酚類化合物提供一種新的思路，為其他植物中該類化合物的測定提供有價值的參考，同時為進一步開展茶葉營養(yǎng)功能及品質(zhì)研究提供技術手段。