張鈺麟，陳泓帆，趙志平,,*，王 衛(wèi)，聶 鑫，程 杰，張 崟，劉達玉，徐躍成，羅淮良

（1.成都大學 肉類加工四川省重點實驗室，四川 成都 610106；2.成都大學食品與生物工程學院，四川 成都 610106；3.成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，四川 成都 610500；4.四川省食品檢驗研究院，四川 成都 610100；5.自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠，四川 自貢 643101）

大頭菜又名芥菜，是一種十字花科蕓苔屬草本植物，常用來制成醬腌菜，因其脆嫩爽口而深受消費者喜愛。大頭菜含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類、維生素以及膳食纖維[1-2]。食用大頭菜可降低某些癌癥、心血管和退行性疾病、免疫功能障礙以及老年黃斑變性的發(fā)生率[3]。新鮮大頭菜因含有辛辣味的異硫氰酸酯而不能直接食用，發(fā)酵后香而微辣。不同工藝條件及不同地區(qū)生產(chǎn)的大頭菜風味具有明顯差異，曾凡坤等[4]利用蒸餾萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析了新工藝大頭菜、傳統(tǒng)腌制大頭菜和脫鹽大頭菜，分別檢測出68、56種和28種揮發(fā)性香氣物質(zhì)。郭壯等[5]利用電子舌分析了四川成都、湖北襄陽和山東菏澤大頭菜的滋味品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)山東菏澤大頭菜的酸味顯著高于其他兩種大頭菜，而咸味、苦味、鮮味和后味-B顯著低于其他兩種大頭菜。大頭菜代謝物與其后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)密切，而目前關于代謝物的研究主要以短期發(fā)酵3～4個月大頭菜為對象，且聚焦于差異代謝物，涉及代謝通路的研究偏少。

通常，大頭菜經(jīng)過3～4個月短期發(fā)酵即可成熟[6-7]，作為佐餐菜食用。自貢市某大頭菜加工企業(yè)采用傳統(tǒng)工藝工業(yè)化生產(chǎn)了3種不同發(fā)酵年限的大頭菜；超長周期發(fā)酵大頭菜主要用于制作菜肴，革新了其作為佐餐菜的傳統(tǒng)食用方式。長期發(fā)酵大頭菜的代謝物組成與其后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)密切相關，目前缺乏關于長期發(fā)酵大頭菜代謝物及關聯(lián)代謝通路的研究報道。代謝組學常用的技術手段包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、核磁共振，通過多元統(tǒng)計分析如主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squaresdiscriminant analysis，OPLS-DA）可進一步篩選出差異代謝物，最后將差異代謝物注釋到京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫中獲得受到擾動的相關代謝通路[8]。

為了研究不同超長周期發(fā)酵大頭菜代謝物差異和主要差異代謝物及其關聯(lián)代謝通路，本研究從自貢市某大頭菜加工企業(yè)采集了工業(yè)化生產(chǎn)的3種不同發(fā)酵年限的大頭菜，利用LC-MS/MS技術分析其差異代謝物，以期為定向調(diào)控大頭菜特征代謝物的生物合成提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)發(fā)酵0、5、10 a大頭菜由自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠提供。

甲醇（≥99.90%）、乙腈（≥99.90%） 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；2-氯苯丙氨酸（98.50%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸（色譜純）、甲酸銨（≥99.90%） 北京伊諾凱科技有限公司；Milli-Q超純水 上海摩速科學器材有限公司。

1.2 儀器與設備

H1850R臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；QL-866旋渦混合器 拓赫機電科技（上海）有限公司；Scientz-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；KW-100TDV高頻超聲波清洗器昆山舒美超聲儀器有限公司；UltiMate 3000基礎液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive Plus LC-MS系統(tǒng) 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大頭菜加工工藝

大頭菜采收后用清水洗凈，去除泥沙和雜質(zhì)，自然風干20～40 d。風干結(jié)束后，添加6%～10%（底層、中層和上層占比分別為10%、30%、60%）食鹽腌制2～6 d后；翻缸添加2%～5%食鹽（每層占比同上）腌制2～5 d后起缸；再次添加2%～15%的黃糖拌勻，入壇密封發(fā)酵5 a以及10 a。

1.3.2 代謝物的提取

將樣本按照等比例凍干處理；移取1 000 μL甲醇復溶凍干粉末于離心管中，渦旋振蕩1 min后12 000 r/min離心10 min，取上清液450 μL至離心管中，用真空濃縮儀濃縮至盡干；加入150 μL 80%甲醇溶液配制的2-氯苯丙氨酸溶液復溶樣品，經(jīng)過0.22 μm膜過濾。自每個待測樣本各取20 μL混合成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，用剩余待測樣本進行后續(xù)檢測。

1.3.3 色譜條件

ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，自動進樣器溫度設為8 ℃，流速0.25 mL/min，柱溫40 ℃，進樣2 μL進行梯度洗脫。流動相：A相為5 mmol/L甲酸銨溶液，B相為乙腈，C相為0.1%甲酸溶液，D相為0.1%甲酸-乙腈；正離子模式C-D，負離子模式A-B。洗脫程序：0～1 min，98% A/C，2% B/D；1～9 min，98%～50% A/C，2%～50% B/D；9～12 min，50%～2% A/C，50%～98% B/D；12～13.5 min，2% A/C，98% B/D；13.5～14 min，2%～98% A/C，98%～2% B/D；14～17 min，負離子模式98% A相，2% B相，14～20 min，正離子模式98% C相，2% D相。

1.3.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣壓力30 arb，輔助氣壓力10 arb。毛細管溫度325 ℃，在m/z81～1 000范圍內(nèi)以70 000的分辨率進行全掃描，并采用高能誘導裂解技術進行二級裂解，碰撞電壓為30 eV，同時采用動態(tài)排除去除不必要的MS/MS信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理以及統(tǒng)計

通過Proteowizard軟件（v3.0.8789）將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式。利用R（v3.3.2）的XCMS程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊，得到包括m/z、保留時間以及峰面積等信息的矩陣，將矩陣進行缺失值填補、歸一化等處理后導入至SIMCA（14.1）進行PCA以及OPLS-DA。根據(jù)代謝物的分子質(zhì)量（分子質(zhì)量誤差＜3×10-5）對差異代謝物定性，然后根據(jù)MS/MS模式下獲得的碎片信息在HMDB、Metlin、Massbank、LipMaps、mzclound以及帕諾米克自建標準品數(shù)據(jù)庫中進一步匹配注釋獲得代謝物準確信息。將篩選到的差異代謝物映射到MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫中（https://www.metaboanalyst.ca/），進行相關代謝通路分析，并用超幾何檢驗的P值確定其顯著性。利用R的pheatmap包進行層次聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大頭菜代謝物的PCA

基于LC-MS/MS結(jié)合多元變量統(tǒng)計方法，以探究3種大頭菜代謝物的差異。為得到高質(zhì)量代謝組學數(shù)據(jù)，通常需要進行QC。QC樣本的聚集程度良好，且分布在原點附近，說明本次實驗數(shù)據(jù)可靠，如圖1所示。0 a組、5 a組與10 a組均分布在不同的區(qū)域內(nèi)，說明3種不同發(fā)酵周期大頭菜代謝物之間存在顯著差異，因此基于PCA得分圖確定3個處理組[9]：0 a與5 a為A1，5 a與10 a為A2，0 a與10 a為A3。和Q2是評判PCA模型的主要參數(shù)，其中、Q2＝0.64表明所建立的PCA模型具有較好的可解釋度。

圖1 發(fā)酵大頭菜樣本的PCA模型得分散點圖Fig. 1 PCA score scatter plot of fermented kohlrabi samples

2.2 大頭菜代謝物的OPLS-DA

對3個處理組，采用OPLS-DA進一步分析均得到了較好的分離，如圖2A1～C1所示。每個處理組中兩兩組別均顯著分離，說明發(fā)酵周期的不同導致大頭菜代謝物種類及含量產(chǎn)生顯著差異，這可能與長期發(fā)酵大頭菜中耐鹽微生物活力一直處于較高水平有關，如乳酸菌可產(chǎn)生多種氨基酸，通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)生丙酸、乳酸；酵母菌可產(chǎn)生有機醇，基于利用還原糖能力強的特點，使其更能適應發(fā)酵過程的高鹽、高酸環(huán)境[10]，加之代謝物之間的相互作用使得組別間差異較明顯。OPLS-DA模型參數(shù)為均大于0.5，且＝0.988說明該模型可以解釋和預測兩種大頭菜代謝物之間的差異。

為了進一步驗證模型是否出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，采用200次循環(huán)迭代置換檢驗，結(jié)果如圖2A2～C2所示。Q2回歸線與Y軸交點都在負半軸，表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 發(fā)酵大頭菜OPLS-DA模型得分散點圖與置換檢驗結(jié)果Fig. 2 Scatter plots and permutation test of OPLS-DA model for fermented kohlrabi samples

2.3 大頭菜差異代謝物的篩選與鑒定

差異代謝物的篩選往往依托于OPLS-DA模型變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）值大于1且學生式t檢驗的P值小于0.05[11]，本研究以VIP＞1.3且P＜0.05為篩選標準。如圖3A所示，3個處理組差異代謝物主要以有機酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和核酸及其衍生物為主，發(fā)酵時間的延長使得微生物通過酶促反應利用大頭菜中底物能力增強。研究顯示，隨著發(fā)酵的進行，鹽厭氧菌屬、鹽單胞菌屬和色鹽桿菌屬逐漸成為相對豐度較高的優(yōu)勢菌群[12]；在高鹽的環(huán)境下，優(yōu)勢耐鹽菌群充分利用能源物質(zhì)，使得大分子營養(yǎng)物質(zhì)被降解成小分子物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸等[13]，這體現(xiàn)在A3較A2及A1組差異代謝物種類及個數(shù)均更加豐富。利用Venn圖對各處理組的差異代謝物分析表明，A1、A2、A3共鑒定到53、113種和174種差異代謝物，如圖3B所示。取3個處理組共有的19種差異代謝物定義為主要差異代謝物，包括3種氨基酸及其衍生物（L-苯丙氨酸、N-乙酰亮氨酸、4-乙酰氨基丁酸），5種有機酸（6-羥基煙酸、3-(2-羥基苯基)丙酸、2-氨基苯磺酸、L-3-苯乳酸、煙酸），3種核酸及其衍生物（N-D-核糖嘌呤、鳥嘌呤、7-甲基腺嘌呤），2種脂肪酸（辛酸、癸二酸），2種酮糖（β-D-果糖-6-磷酸、D-核酮糖），1種黃酮類物質(zhì)（根皮苷），1種酚類物質(zhì)（苯酚），1種酚酸（水楊酸），1種生物堿（β-咔啉）。

圖3 大頭菜差異代謝物分類信息（A）及Venn圖（B）Fig. 3 Classification information (A) and Venn diagram (B) for differential metabolites of fermented kohlrabi

氨基酸及其衍生物在植物中發(fā)揮各種功能，除了參與合成蛋白質(zhì)外，還與能量代謝、植物的脅迫反應等有關。發(fā)酵周期的不同使得微生物代謝功能基因表達程度不同，尤其是氨基酸的相關代謝活動[14]。氨基酸的種類直接決定發(fā)酵蔬菜的滋味，Xiao Yangsheng等[15]通過對四川泡菜、江西鹽菜和東北酸菜研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵蔬菜都富含谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸，均在本研究中被檢出。徐亞洲等[16]研究證實，泡菜發(fā)酵過程中氨基酸含量變化趨勢并非一致，這在本研究中體現(xiàn)在天冬氨酸為上調(diào)的差異代謝物，而絲氨酸與丙氨酸為下調(diào)的差異代謝物。多種氨基酸共同作用有助于大頭菜滋味的形成，賦予大頭菜鮮辣等味覺特征。

有機酸是植物光合及呼吸作用的中間產(chǎn)物，其含量直接反映植物的代謝活性[17]。本研究鑒定的大部分有機酸含量隨著發(fā)酵周期延長而增加。研究顯示，發(fā)酵蔬菜中有機酸主要來源于蔬菜原料及發(fā)酵過程中微生物的代謝作用。隨著發(fā)酵周期的增加，乳酸及乙酸等有機酸由于糖代謝作用逐漸積累增加[18-19]，郝懿[20]研究發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵香椿泡菜乳酸及乙酸含量變化也有著相同結(jié)果，且加鹽量4%香椿泡菜乳酸桿菌隨發(fā)酵周期延長逐步成為優(yōu)勢菌群；肖陽生[14]通過監(jiān)測四川泡菜發(fā)酵過程中有機酸，發(fā)現(xiàn)有機酸含量逐漸升高，且與乳桿菌屬呈正相關。煙酸也被稱為VB3，存在于各種植物組織中，其是一種水溶性的維生素，具有舒張血管的作用。L-3-苯乳酸被認為是一種可逆的混合型多酚氧化酶抑制劑[21]，其在大頭菜發(fā)酵過程中起抗褐變作用，為后續(xù)有關產(chǎn)品護色以及延長貨架期提供一定理論支持。

次生代謝物以產(chǎn)量較大的初生代謝物為前體，通過糖代謝、莽草酸延伸、氨基酸延伸、乙酸延伸途徑所合成的結(jié)構(gòu)復雜的化合物。次生代謝物種類很多，包括生物堿、色素、抗生素等。由于色素含量的不同，0、5 a和10 a大頭菜的色澤表現(xiàn)出顯著差異，如圖4所示。酚酸及其衍生物廣泛分布在植物中[22]，發(fā)酵過程中酚酸的積累有助于大頭菜口感、酸度、風味的形成[23]，如在芥菜和客家擦菜中可檢測出40余種酚酸[24]，與本研究檢出的大多數(shù)酚酸變化趨勢一致，但主要差異代謝物水楊酸與傳統(tǒng)發(fā)酵的芥菜變化趨勢不一致。傳統(tǒng)芥菜水楊酸含量隨發(fā)酵周期延長含量逐漸下降，而本研究水楊酸含量呈上升趨勢。與水楊酸代謝有關的酶為苯丙氨酸解氨酶，其通過介導肉桂酸途徑從而合成水楊酸。鄒同雷等[25]發(fā)現(xiàn)龍須菜中苯丙氨酸解氨酶在高鹽濃度下活性增加，而5 a和10 a大頭菜的食鹽含量高于0 a，因此5 a和10 a大頭菜水楊酸含量顯著高于0 a。生物堿主要為植物中的一類含氮的堿性有機化合物，其種類很多，主要包括有機胺類、異喹啉類、吡啶類等，通常具有抗腫瘤[26]、鎮(zhèn)痛[27]的作用。本研究鑒定到的主要差異生物堿為β-咔啉，其含量呈先上升后下降的趨勢，β-咔啉生物堿在新藥開發(fā)上具有廣闊的前景，基于其在長期發(fā)酵大頭菜中的含量變化規(guī)律，后續(xù)可針對5 a大頭菜進行相關功能性代謝物的生物合成調(diào)控。

圖4 發(fā)酵0（A）、5 a（B）及10 a（C）大頭菜剖面圖Fig. 4 Cross-sectional views of kohlrabi samples fermented for 0 (A),5 (B) and 10 years (C)

2.4 大頭菜主要差異代謝物熱圖分析

為了更好地判斷主要差異代謝物在發(fā)酵大頭菜中的代謝模式，以大頭菜主要差異代謝物的相對含量做層次聚類分析，結(jié)果以熱圖的形式展示，如圖5所示，主要差異代謝物在各個組別中含量分布具有一定的規(guī)律特征。0 a中3種下調(diào)的主要差異代謝物與其他兩組差別明顯，其中以3-(2-羥基苯基)丙酸和β-D-果糖-6-磷酸變化最為顯著。5 a組中含量較高的有β-咔啉、癸二酸、辛酸、苯酚，它們多為脂肪酸、生物堿和酚類物質(zhì)，可能對大頭菜發(fā)酵前期褐色的形成起重要作用。10 a中含量較高的有根皮苷、L-苯丙氨酸、2-氨基苯磺酸、L-3-苯乳酸、煙酸、6-羥基煙酸、N-D-核糖嘌呤。

圖5 發(fā)酵大頭菜中主要差異代謝物層級聚類分析熱圖Fig. 5 Heatmap for hierarchical clustering analysis of major differential metabolites in fermented kohlrabi samples

2.5 主要差異代謝物通路分析

植物的生長過程是一個復雜的代謝過程，不能僅僅從單一物質(zhì)表達量的高低進行整體判斷[28]，因此需要對主要差異代謝物所富集的代謝通路進行分析。將主要差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，主要富集到苯丙氨酸代謝（Impact＝0.47）、磷酸戊糖途徑（Impact＝0.13）、果糖和甘露糖代謝（Impact＝0.21）3 條代謝通路上，如圖6所示。芳香族氨基酸除了作為蛋白質(zhì)的組成成分外，還是許多次生代謝物生物合成的前體[29]，通過莽草酸途徑在質(zhì)體內(nèi)部合成。由于缺乏完整的糖酵解過程，使其只能通過磷酸烯醇式丙酮酸特異性的磷酸轉(zhuǎn)運體從胞漿導入。L-苯丙氨酸是許多酚類化合物的前體物質(zhì)，包括木質(zhì)素、縮合單寧以及苯丙烷類物質(zhì)。在一些植物中，苯丙氨酸生物合成的主要途徑是芳香酸途徑[30]。β-D-果糖-6-磷酸作為連接磷酸戊糖途徑與果糖和甘露糖代謝的主要代謝產(chǎn)物，其含量隨著發(fā)酵周期的延長而下降，可能是由于6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶活性減弱，使來源于糖酵解過程的α-D-葡萄糖-6-磷酸向其轉(zhuǎn)化能力減弱；作為呼吸作用的底物，通過三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑及果糖和甘露糖代謝途徑轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷以維持正常的生命活動[31]。

圖6 主要代謝通路整合分析圖Fig. 6 Integrated analysis of major metabolic pathways

3 結(jié) 論

基于LC-MS/MS探究了工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵0、5 a和10 a的傳統(tǒng)大頭菜代謝物的差異，差異代謝物主要以有機酸、氨基酸和核苷酸衍生物為主?；赩enn圖得到3個處理組共有的19種主要差異代謝物，將主要差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫檢索出3 條最顯著的代謝通路，為基于代謝通路定向調(diào)控大頭菜代謝物合成提供一定的理論基礎。

大頭菜在發(fā)酵過程中發(fā)生復雜的生物化學反應，代謝物種類繁多。深入解析長期發(fā)酵大頭菜代謝物組成及變化規(guī)律是大頭菜后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)的前提，也是未來的主要研究方向之一。此外，微生物是影響發(fā)酵大頭菜代謝物組成最為關鍵的因素之一，利用宏基因組學、宏轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學及代謝組學等多組學技術深度揭示工業(yè)化生產(chǎn)長期發(fā)酵大頭菜的微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)，明確功能微生物及活性基因，闡明微生物調(diào)控長期發(fā)酵大頭菜代謝物合成的機理是未來的研究方向。同時，基于代謝通路利用定向調(diào)控技術加速特征代謝產(chǎn)物生物合成進程也是工業(yè)化生產(chǎn)亟需解決的技術問題。