喬少婷，代安娜爾，解 敏，孫思霖，聶佳瑩，丹 彤

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）作為唯一通過歐洲安全認(rèn)證的鏈球菌[1-2]，因其活力強、產(chǎn)酸快、安全性高等特點，已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中[3-5]。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是由乳酸菌通過代謝碳源物質(zhì)得到的一種高分子聚合物，分子質(zhì)量一般在104～6×106Da之間[6-7]，包括游離于細(xì)胞之外的黏液多糖和附著于細(xì)胞壁的莢膜多糖[8]。根據(jù)化學(xué)成分，EPS可分為同型多糖和異型多糖（heteropolysaccharide，HePS）兩種，就目前的研究成果而言，乳酸菌的EPS大多均為HePS[9]。EPS對微生物細(xì)胞機械損傷有一定的保護作用，可減緩微生物細(xì)胞水分流失，在惡劣的生存環(huán)境中也可作為微生物的營養(yǎng)[10]，同時具有提高發(fā)酵乳制品黏度、持水性及穩(wěn)定性，改善產(chǎn)品口感的優(yōu)良特性[11-13]。

近年來，隨著乳酸菌基因組學(xué)研究的飛速發(fā)展，國內(nèi)外對于乳酸菌eps基因簇的研究也有了全新的理解。EPS的合成共包括兩個階段，分別為前體物質(zhì)糖核苷酸的合成和eps基因簇指導(dǎo)合成EPS[14-15]。糖核苷酸的合成主要依靠糖酵解途徑完成，而eps基因簇則負(fù)責(zé)參與EPS的重復(fù)單元合成，控制EPS鏈長、聚合以及將EPS運輸?shù)郊?xì)胞外[16-17]。eps基因簇對于EPS的生物合成必不可少[18]。Dertli等[18]對約翰遜乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）FI9785的EPS結(jié)構(gòu)和基因簇進行分析，發(fā)現(xiàn)與野生菌株相比，缺失epsE的突變體只能產(chǎn)生EPS-1而無法產(chǎn)生EPS-2，而當(dāng)整個eps基因簇被敲除后，菌株則無法再產(chǎn)生EPS。Gankhuyag[19]通過研究德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）的eps基因簇后發(fā)現(xiàn)不同菌種的eps基因簇存在顯著差異，進一步研究發(fā)現(xiàn)，來自同一菌種的不同菌株eps基因簇也存在明顯差異，例如L. delbrueckiisubsp.bulgaricus2038和ATCC 11842具有翻轉(zhuǎn)酶基因，而其他L. delbrueckiisubsp.bulgaricus中未發(fā)現(xiàn)此基因。Dipti等[20]通過對比來自27個物種106個乳酸桿菌（Lactobacillus）的eps基因簇后發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase，GT）、翻轉(zhuǎn)酶（O-antigen flippase，Wzx）和聚合輸出酶（O-antigen polymerase，Wzy）的特異性較強，且不同生長環(huán)境下菌株gt、wzx、wzy基因編碼的蛋白質(zhì)家族無法高度共享，這些結(jié)果表明菌株eps基因簇具有較高的可變性，可以適應(yīng)不同的生存環(huán)境。

S. thermophilusIMAU20551分離自蒙古國的傳統(tǒng)發(fā)酵乳，具有產(chǎn)酸速度快、遺傳性狀穩(wěn)定以及EPS產(chǎn)量高（（268.25±5.36）mg/L，數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）等特點，是1 株特性優(yōu)良的發(fā)酵劑菌株。本實驗以S. thermophilusIMAU20551為研究對象，采用Illumina HiSeq技術(shù)對該菌株進行二代基因組重測序，找出和EPS生產(chǎn)相關(guān)的eps基因簇，并利用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）技術(shù)對eps基因簇的表達(dá)進行驗證，旨在為S. thermophilusEPS的研究提供更多參考信息，為之后乳酸菌EPS的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S. thermophilusIMAU20551分離自蒙古國扎布汗省奧特跟蘇木的傳統(tǒng)酸牛奶，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳酸菌菌種資源庫提供，菌株保藏號MGB80-7，GenBank序列號HM058270。

M17肉湯培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit（1120）、Invitrogen TRIzol RNA提取試劑盒 美國Promega公司；HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×ChamQ SYBR COLOR qPCR Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2202CN型電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；SX-700型全自動高壓蒸汽滅菌器 日本HIRAYAMA公司；HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海坤天試驗儀器有限公司；SJ-CJ-2FDQ型超凈臺 上海智城分析儀器制造有限公司；BX 50型光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Mix Max型旋渦振蕩器 合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；5810 R型高速控溫離心機 德國Eppendorf公司；Nano-Drop 2000型微量分光光度計 美國Thermo Scientific公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

參照陳海燕等[21]方法，將保藏于-80 ℃的S. thermophilusIMAU20551接種于脫脂乳培養(yǎng)基中，接種量為2%（m/m），37 ℃培養(yǎng)24 h后，以2%（V/V）的接種量接種于M17液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2 代，使菌株活力達(dá)到最大（活菌數(shù)＞109CFU/mL）。

1.3.2 菌株DNA提取

將活化后的IMAU20551以2%（V/V）接種量擴培至50 mL的M17液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，離心除去上清液，用磷酸鹽緩沖溶液清洗2 遍得到干凈菌體，利用Wizard Genomic DNA Purification Kit提取DNA，提取方法參考試劑盒說明書。提取出的DNA通過微型紫外分光光度計測定濃度，并利用1%（m/m）瓊脂糖凝膠電泳判斷其純度和完整度，選取出質(zhì)量合格的DNA進行重測序。

1.3.3 基因組重測序

將通過1.3.2節(jié)得到的DNA采用Illumina HiSeq 4000進行基因組二代重測序，構(gòu)建Illumna PE文庫。

1.3.4 基因組組裝

將原始數(shù)據(jù)raw data通過Illumina HiSeq 4000過濾得到clean data，利用SOPAdenovo軟件對重測序完成后的基因數(shù)據(jù)進行組裝。選取合適的Kmer值組裝拼接基因組數(shù)據(jù)，并對單堿基進行矯正。以基因組大小、scaffold數(shù)量、GC含量、N50值、N90值為指標(biāo)，篩選與參考值接近的基因組拼裝結(jié)果作為最終組裝結(jié)果進行SOAP驗證及校驗。

1.3.5 基因組預(yù)測及注釋

利用prokka軟件預(yù)測基因組基因，獲得開放閱讀框信息。結(jié)合RAST（Rapid Annotation using Subsystem Technology）Server-RAST Annotation Server（http://rast.nmpdr.org/）網(wǎng)上在線工具、基因本體論（Gene Ontology，GO）（http://www.geneontology.org/）、直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/COG/）以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（http://www.genome.jp/kegg/）等數(shù)據(jù)庫完成基因的預(yù)測及功能注釋。

1.3.6 生物信息分析

采用CGview（http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/）軟件繪制S. thermophilusIMAU20551基因組掃描圖，核酸序列相似性比對采用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）軟件在線分析。

1.3.7 總RNA提取

將活化后的S. thermophilusIMAU20551以2%（V/V）接種量接種于M17液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，分別于0、6、12、18、24 h取出離心（4 000 r/min，10 min）收集菌體。利用Invitrogen TRIzol RNA提取試劑盒提取菌體RNA，提取方法參考試劑盒說明書。利用1%（m/m）瓊脂糖凝膠電泳對RNA提取質(zhì)量進行檢測。

1.3.8 cDNA合成

根據(jù)HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行DNA去除反應(yīng)及cDNA模版合成反應(yīng)，方法參考試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為50 ℃，15 min；85 ℃，2 min。

1.3.9 real-time PCR引物設(shè)計及反應(yīng)體系

使用Primer 5軟件設(shè)計real-time PCR引物，引物由上海美吉生物公司合成。具體引物如表1所示。

表1 real-time PCR引物Table 1 Primer sequences used for real-time PCR in this study

以上述設(shè)計的引物為模版，采用gapdh部分序列作為內(nèi)參基因進行real-time PCR。反應(yīng)體系為20 μL：10.0 μL 2× ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix；Primer F（5 μmol/L）、Primer R（5 μmol/L）各0.8 μL；0.4 μL 50× ROX Reference Dye 2；cDNA模板2.0 μL；補水至20.0 μL。參照Livak等[22]的方法使用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，計算基因表達(dá)量并繪圖。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 5、Excel、OMNIC等軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，所有實驗均重復(fù)3次以減少誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 S. thermophilus IMAU20551基因組基本特征

對S. thermophilusIMAU20551進行DNA提取后采用Illumina HiSeq 4000測序平臺進行測序，采用CGView軟件繪制菌株基因組掃描圖，結(jié)果如圖1所示。從外到內(nèi)第1圈和第4圈為正鏈、負(fù)鏈上的蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence，CDS），以不同顏色表示不同的COG功能分類；第2圈和第3圈分別為正鏈、負(fù)鏈上的CDS、tRNA和rRNA；第5圈為GC含量，向外的部分表示該區(qū)域GC含量高于全基因組平均GC含量，反之則表示該區(qū)域GC含量低于全基因組的平均GC含量，峰值越高表示與平均GC含量差值越大；第6圈為GC偏移值，具體算法為（GC）/（G+C），可以輔助判斷前導(dǎo)鏈和后滯鏈，一般前導(dǎo)鏈GC偏移值＞0（綠色部分），后滯鏈GC偏移值＜0（紫色部分），也可以輔助判斷復(fù)制起點（累計偏移最小值）和終點（累計偏移最大值），尤其對環(huán)狀基因組最為重要；最內(nèi)一圈為基因組大小標(biāo)識。

基因組全長1 725 107 bp，無質(zhì)粒基因，共56 條scaffold，GC含量為39.08%，N50長度為105 617 bp，N90長度為37 646 bp，包含33個tRNA、3個rRNA和26個重復(fù)單位?；蚪M共編碼1 884個基因，基因長度為1 432 380 bp，占總基因組長度的83.03%。各項數(shù)據(jù)均顯示符合S. thermophilus基本特征，表明基因組測序組裝結(jié)果良好，可進行后續(xù)生物信息分析。

圖1 S. thermophilus IMAU20551基因組掃描圖Fig. 1 CGView results of S. thermophilus IMAU20551

2.2 S. thermophilus IMAU2055基因組COG分析

如圖2所示，比對蛋白COG數(shù)據(jù)庫后發(fā)現(xiàn)，在所有的1 884個基因中，有1 357個基因被分別注釋到19個COG類別中，占總基因數(shù)的81.58%。除去功能未知的345個基因外，被注釋到E類別（氨基酸運輸與代謝）中的編碼基因占比最大，共有195個，其次是J類別（翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源，144個基因）、L類別（復(fù)制、重組與修復(fù)，127個基因）以及G類別（碳水化合物運輸與代謝，94個基因）。另外，eps基因簇中大部分功能基因均被注釋到M類別（細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/細(xì)胞被膜生物合成）中。

圖2 S. thermophilus IMAU20551基因組COG功能分類統(tǒng)計分析Fig. 2 COG function analysis of genomic DNA from S. thermophilus IMAU20551

2.3 S. thermophilus IMAU2055基因組GO分析

圖3 S. thermophilus IMAU20551基因組GO功能注釋結(jié)果Fig. 3 GO function analysis of genomic DNA from S. thermophilus IMAU20551

將S. thermophilusIMAU20551基因組數(shù)據(jù)與GO數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果如圖3所示。共有1 538個基因被分為3 類本體功能，分別為生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能，進一步可細(xì)分為42個二級功能類別。其中，在生物學(xué)過程中的14個二級類別中，有較大一部分基因被注釋到氧化還原過程中，另外被注釋到蛋白水解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯、轉(zhuǎn)運和磷酸化中的編碼基因也數(shù)量較大；在細(xì)胞組成類別中又分為14個二級類別，有418個基因被注釋到細(xì)胞膜組分類別中，占GO總編碼基因的22.19%，其次為細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜，分別注釋到239個基因和110個基因，有極少數(shù)的基因被注釋到胞外基質(zhì)、質(zhì)膜外在組分、信號識別粒子等類別；在分子功能下的14個類別中，有絕大部分的基因被注釋到ATP整合和DNA整合類別中，共397個編碼基因，占GO總編碼基因的21.07%，另外在水解酶、ATP酶和轉(zhuǎn)移酶等酶活性類別中也注釋到較多編碼基因。

2.4 S. thermophilus IMAU2055基因組KEGG分析

將S. thermophilusIMAU20551基因組與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果如圖4所示。S. thermophilusIMAU20551基因組中共有1 170個基因在KEGG代謝通路中得到注釋，占到全部編碼基因的62.10%。其中大部分的基因被注釋到新陳代謝、遺傳信息傳遞和生物體系統(tǒng)這3個一級類別中，被注釋到基因數(shù)量分別為719、153個和143個，占到所有被注釋到KEGG通路中的基因數(shù)量的61.45%、13.08%和12.22%。細(xì)胞過程、人類疾病以及環(huán)境信息加工這3個類別中注釋到的基因較少，其中，被注釋到有機系統(tǒng)的基因豐度最低，僅有16個。將6個一級分類細(xì)分為34個二級類別后發(fā)現(xiàn)，被注釋到碳水化合物代謝、氨基酸代謝、膜轉(zhuǎn)運以及翻譯中的基因占大多數(shù)，僅有極少部分的基因被注釋到消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)中。

圖4 S. thermophilus IMAU20551基因組KEGG pathway分類統(tǒng)計Fig. 4 KEGG pathway classification of genomic DNA from S. thermophilus IMAU20551

2.5 S. thermophilus IMAU20551合成糖核苷酸

EPS的合成離不開前體物質(zhì)糖核苷酸的供應(yīng)。本實驗也在KEGG通路中注釋到一些可以將游離糖利用并合成糖核苷酸的酶的相關(guān)基因，如表2所示。這些酶可以將不同的碳源物質(zhì)作為底物，經(jīng)過一系列反應(yīng)最終合成UDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、dTDP-鼠李糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺以及UDP-N-乙酰半乳糖胺等前體糖核苷酸。由這些酶可以推測出S. thermophilusIMAU20551所產(chǎn)EPS可能是由葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸等多種單糖組分組成，為典型的HePS，這與前期測得的S. thermophilusIMAU20551 EPS單糖組成結(jié)果一致（數(shù)據(jù)暫未發(fā)表）。

表2 KEGG注釋S. thermophilus IMAU20551糖核苷酸合成部分過程中關(guān)鍵酶Table 2 Key enzymes in the synthesis of sugar nucleotides in S. thermophilus IMAU20551 annotated to the KEGG pathway

2.6 S. thermophilus IMAU20551 eps基因簇分析

注釋基因組后發(fā)現(xiàn)，S. thermophilusIMAU20551擁有較為完整的eps基因簇，長度為19 376 bp。從圖5可以看出，S. thermophilusIMAU20551的eps基因簇中，除假定蛋白外，與EPS有關(guān)的基因共有18個，其中已確定的糖基轉(zhuǎn)移酶基因4個，分別為epsE、eps1F、eps2F以及epsJ；同時還注釋得到負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)EPS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的基因epsA、epsB，控制EPS鏈長的基因epsC、epsD，控制磷酸化的epsP以及負(fù)責(zé)控制EPS輸出的基因wzx和epsX。另外還注釋到莢膜多糖生物合成蛋白、轉(zhuǎn)座酶、磷酸甘油酸變位酶以及磷酸酶等與EPS合成相關(guān)的功能基因。

圖5 S. thermophilus IMAU20551 eps基因簇Fig. 5 eps gene cluster of S. thermophilus IMAU20551

另外基因簇中還注釋出位于5'端的deo-D和位于3'端的orf 14.9，其中，orf 14.9與eps基因簇中其他基因轉(zhuǎn)錄方向相反。eps基因簇中大部分的功能基因都位于deo-D和orf 14.9之間，只有負(fù)責(zé)磷酸化的epsP和控制EPS輸出的epsX基因位于orf 14.9下游。多數(shù)S. thermophilus的eps基因簇均以orf 14.9結(jié)尾，但也有少部分菌株的eps基因簇結(jié)構(gòu)與本研究類似，例如S. thermophilusMR-1C的eps基因簇中，epsU、epsV以及epsX均位于orf 14.9之后[23]。

以S. thermophilusND 03、ASCC 1275以及IMAU20561作為對照，比較實驗菌株與這3 株菌株eps基因簇的差異（圖6）。發(fā)現(xiàn)4 株S. thermophilus中的epsA、epsB、epsC、epsD以及epsE的位置和順序幾乎沒有改變，說明這幾個基因高度保守，穩(wěn)定出現(xiàn)在所有產(chǎn)eps的S. thermophilus基因組中。而注釋糖基轉(zhuǎn)移酶的基因在不同的菌株eps基因簇中分布的種類、數(shù)量、位置以及順序具有特異性。另外，與其他3 株S. thermophilus不同的是，ASCC 1275eps基因簇中出現(xiàn)了兩對epsC和epsD，這可能與該菌株同時產(chǎn)生黏液多糖和莢膜多糖有關(guān)[24]。

圖6 4 株S. thermophilus eps基因簇對比Fig. 6 Comparison of eps gene clusters from four S. thermophilus strains

通過NCBI BLAST比對S. thermophilusIMAU20551eps基因簇中功能性基因的同源性，結(jié)果如表3所示。

表3 S. thermophilus IMAU20551 eps基因簇功能Table 3 Functions of eps gene cluster from S. thermophilus IMAU20551

位于5'端的deo-D基因編碼嘌呤核苷酸化酶，參與糖核苷酸的合成與分解反應(yīng)[25]，與S. thermophilusS9中的deo-D基因相似性極高，達(dá)99.58%。

epsA與epsB為eps基因簇中的保守基因，epsA編碼為LytR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控EPS產(chǎn)生，Dertli等[26]通過敲除L. johnsoniiFI9785中的epsA基因后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面EPS-1和EPS-2完全缺失，表明epsA是EPS產(chǎn)生的積極調(diào)節(jié)因子。epsB編碼為酪氨酸蛋白磷酸酶，有研究發(fā)現(xiàn)乳酸乳球菌EPS合成受磷酸調(diào)節(jié)系統(tǒng)的控制，由epsB的非磷酸化形式驅(qū)動[27]。本實驗注釋得到的epsA和epsB與S. thermophilusACA-DC 2（GenBank：LT604076.1）的epsA和epsB的相似性較高，分別為98.39%和97.94%。

epsC和epsD負(fù)責(zé)控制EPS鏈長。epsC基因編碼酪氨酸蛋白激酶跨膜調(diào)節(jié)劑，有報告稱epsC可以與磷酸化激酶相互作用以控制EPS聚合物延伸鏈的長度[28]。本研究得到的epsC與S. thermophilusSTCH_20中的epsC具有較高的同源性；epsD編碼酪氨酸蛋白激酶，與S. thermophilusSTH_CIRM_30中epsD基因序列最為相似。有研究表明，epsD可以控制epsE的活性，從而影響EPS合成過程中一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)[29]。

epsE、eps1F、eps2F以及epsJ均編碼糖基轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運不同的糖核苷酸到脂質(zhì)攜帶體，在EPS合成過程中發(fā)揮重要功能。其中epsE編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，是S. thermophilusIMAU20551eps基因簇中第一個糖基轉(zhuǎn)移酶，稱為引發(fā)糖基轉(zhuǎn)移酶[30]。本實驗中注釋出的epsE與S. thermophilusSTCH_15中引發(fā)糖基轉(zhuǎn)移酶的同源性最高，達(dá)到98.68%；eps1F編碼己糖基轉(zhuǎn)移酶，與S. thermophilusACA-DC 2中的epsF具有較高同源性（相似性98.93%）；eps2F注釋得到編碼甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，和基因epsJ均與L. plantarum中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因最為相似。Pandey等[31]發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶可以具有廣泛的底物選擇范圍。因此，本實驗中引發(fā)糖基轉(zhuǎn)移酶EpsE將UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運到與細(xì)胞膜相連的脂載體上，其他糖基轉(zhuǎn)移酶Eps1F、Eps2F、EpsJ負(fù)責(zé)將UDP-葡萄糖、dTDP-葡萄糖、dTDP-鼠李糖、UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺等糖核苷酸轉(zhuǎn)按照一定的順序和規(guī)律運到與脂載體相連的糖核苷酸上，不斷延伸形成脂載體焦磷酸化重復(fù)單元（Und-PP-糖重復(fù)單元）。

wzx編碼翻轉(zhuǎn)酶，負(fù)責(zé)將EPS的重復(fù)單元進行易位，本實驗中S. thermophilusIMAU20551基因組中注釋出的wzx基因序列與L. plantarumSHY 21-2中的寡糖翻轉(zhuǎn)酶家族所編碼的基因相似性較高（95.5%）。目前，已知的EPS生物合成模式有4種，分別為Wzx/Wzy-dependent途徑、ABC transporter-dependent途徑、Synthase-dependent途徑和使用單一蛋白酶進行胞外合成途徑[32]，除第四種途徑外，其他3種途徑均為HePS合成途徑。在IMAU20551的eps基因簇中注釋出Wzx翻轉(zhuǎn)酶，推測S. thermophilusIMAU20551合成EPS的模式為Wzx/Wzydependent途徑，與大多數(shù)乳酸菌HePS的合成模式相同。Wzx翻轉(zhuǎn)酶是O-抗原生物合成途徑的重要組成部分，負(fù)責(zé)寡糖O單元在革蘭氏陰性菌中跨膜轉(zhuǎn)運[33]。Wzx/Wzydependent途徑是O-抗原生物合成途徑，同時也作為HePS合成模型。

orf 14.9注釋得到編碼VanZ家族蛋白，存在于大部分S. thermophilus eps基因簇的3'端，orf 14.9與富產(chǎn)EPS的S. thermophilusASCC 1275菌株中的orf 14.9基因同源性最高，為99.48%。Tyvaert等[34]對不含orf 14.9的S. thermophilusNST2280和A054進行基因突變使之具有orf 14.9，對比后發(fā)現(xiàn)具有orf 14.9基因的突變體與原菌株的EPS產(chǎn)量差異不明顯，但生長參數(shù)有明顯區(qū)別，推測orf 14.9不影響S. thermophilusEPS的產(chǎn)量但與細(xì)胞生長有關(guān)。

epsP編碼組氨酸磷酸酶，負(fù)責(zé)EPS磷酸化，目前對epsP的相關(guān)研究較少，本實驗中epsP與S. thermophilusASCC 1275中的epsP基因相似性較高，為96.49%。

epsX編碼蛋白為跨膜蛋白，負(fù)責(zé)將EPS轉(zhuǎn)運至胞外。與S. thermophilusIMAU20551中epsX的基因序列最為接近的是S. thermophilusCNCM I-1630基因組中的epsX基因，相似性為99.65%。

2.7 S. thermophilus IMAU20551 EPS合成途徑

通過實驗所得結(jié)果，可以推測S. thermophilusIMAU20551 EPS的合成途徑（圖7）。果糖、蔗糖、纖維二糖以及甘露糖利用磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿峄癄顟B(tài)并進入細(xì)胞，其中纖維二糖會轉(zhuǎn)化為6-磷酸纖維二糖，隨后在6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的作用下轉(zhuǎn)換為6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖可以相互轉(zhuǎn)化，而6-磷酸蔗糖和6-磷酸甘露糖則可以單向轉(zhuǎn)化為6-磷酸果糖，6-磷酸果糖最終可以轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡萄糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺，6-磷酸葡萄糖則最終轉(zhuǎn)化為UDP-葡萄糖糖和dTDP-鼠李糖；乳糖、葡萄糖利用滲透酶進入細(xì)胞內(nèi)，乳糖被β-半乳糖苷酶分解為葡萄糖和半乳糖，一部分半乳糖會通過滲透酶的作用被排出細(xì)胞外，另一部分被醛糖1-差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化為a-D-半乳糖，隨即進行磷酸化成為1-磷酸半乳糖，1-磷酸半乳糖會通過Leloir途徑轉(zhuǎn)化為u1-磷酸-葡萄糖，也可以在UDP葡萄糖-半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為UDP-半乳糖，另外，UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖也是可以相互轉(zhuǎn)化的。經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的UDP-N-乙酰葡萄糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、dTDP-鼠李糖、dTDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖以及UDP-半乳糖經(jīng)過糖基轉(zhuǎn)移酶的作用轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)載體上成為Und-PP-糖重復(fù)單元，形成利用聚合酶將其聚合并形成特定的結(jié)構(gòu)，再由翻轉(zhuǎn)酶和跨膜蛋白共同作用將EPS轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外。另外，根據(jù)圖7可以推測得出磷酸化作用是將糖分子轉(zhuǎn)化為核苷酸的基礎(chǔ)。

圖7 S. thermophilus IMAU20551 EPS合成途徑Fig. 7 Exopolysaccharide synthesis pathway of S. thermophilus IMAU20551

2.8 real-time PCR分析

2.8.1 RNA提取結(jié)果

real-time PCR技術(shù)可以對基因的表達(dá)量進行較為準(zhǔn)確的描述，已成為常用的基因表達(dá)檢測方法。S. thermophilusIMAU20551 RNA提取后質(zhì)檢結(jié)果如表4、圖8所示。所有樣品RNA條帶清晰明亮，無色素、蛋白、糖類等雜質(zhì)污染，無DNA污染，28/23S亮度大于18/16S，OD260/280≥1.8，OD260/230≥1.0，質(zhì)量濃度≥400 ng/μL，總量≥4 μg，可以進行后續(xù)實驗。

表4 S. thermophilus IMAU20551總RNA提取結(jié)果Table 4 Amount of total RNA extracted from S. thermophilus IMAU20551

圖8 S. thermophilus IMAU20551 RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 8 Electrophoretogram of RNA from S. thermophilus IMAU20551

2.8.2 real-time PCR分析結(jié)果

對S. thermophilusIMAU20551eps基因簇中的epsA、epsB、epsE、eps1F、eps2F以及epsX的相對表達(dá)量進行測定，結(jié)果如圖9所示。可以看出，除eps2F、epsJ外，其他被測基因均在6 h達(dá)到最大表達(dá)量，說明在菌株生長到6 h是菌株代謝EPS的關(guān)鍵階段；12 h時，eps2F、epsJ的表達(dá)量有一定增長，eps2F的表達(dá)量達(dá)到最大（1.022），但其余基因的表達(dá)量均有不同程度的下降，說明這段時間內(nèi)菌株仍繼續(xù)生產(chǎn)EPS，但合成速率減緩；菌株培養(yǎng)18 h，epsE、eps1F和負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運EPS的epsX相對表達(dá)量出現(xiàn)回升，基因epsJ表達(dá)量繼續(xù)增長，達(dá)到峰值（0.576），推測此時S. thermophilusIMAU20551正處于平臺期，在不間斷產(chǎn)出EPS的同時也產(chǎn)出其他豐富的次級代謝物；除epsA外，其他被測基因在菌株生長到24 h相對表達(dá)量繼續(xù)下降，說明24 hS. thermophilusIMAU20551已經(jīng)處于衰亡期，基因的表達(dá)能力下降，無法產(chǎn)生更多的EPS或其他代謝產(chǎn)物。

圖9 eps基因簇部分基因的相對表達(dá)量Fig. 9 Relative expression of key genes in the eps gene cluster

3 討 論

大部分S. thermophilus的基因組大小在1.85 Mbp左右，編碼大約2 000個基因，涉及菌株生長代謝等各個方面[4]。S. thermophilusEPS的生物合成是由eps基因簇調(diào)控的。王俊滬等[35]認(rèn)為S. thermophiluseps基因簇幾乎全部位于染色體DNA上，在傳代過程中eps基因簇丟失的概率較低，保證了菌株產(chǎn)EPS的穩(wěn)定性。而其他乳酸菌eps基因簇大多位于質(zhì)粒上，在傳代或進化過程中容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失現(xiàn)象從而失去產(chǎn)EPS能力。通過基因組重測序和生物信息學(xué)分析，本實驗在S. thermophilusIMAU20551染色體DNA上發(fā)現(xiàn)了完整的eps基因簇，該基因簇共有18個基因，全長19 376 bp，負(fù)責(zé)調(diào)控EPS生物合成、輸出以及聚合等過程。

本實驗利用real-time PCR對S. thermophilusIMAU20551eps基因簇中關(guān)鍵基因的相對表達(dá)量進行了檢測分析，之后將繼續(xù)利用基因敲除及回補實驗驗證eps基因簇表達(dá)能力的準(zhǔn)確性，以及基因之間的互作關(guān)系，另外，有部分研究認(rèn)為eps基因簇中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因數(shù)量會影響菌株的EPS產(chǎn)量，后續(xù)實驗也將利用基因克隆或基因過表達(dá)實驗等驗證eps基因簇中糖基轉(zhuǎn)移酶數(shù)量以及與糖核苷酸代謝相關(guān)酶類與EPS產(chǎn)量之間的聯(lián)系。

4 結(jié) 論

利用Ilummina HiSeq、SOPAdenovo、prokka等對產(chǎn)EPS的S. thermophilusIMAU20551基因組進行測序、組裝及注釋后發(fā)現(xiàn)，S. thermophilusIMAU20551基因組中各代謝通路基因豐度較高，且擁有一條完整的eps基因簇，涵蓋負(fù)責(zé)調(diào)控、組裝、轉(zhuǎn)運以及輸出EPS。real-time PCR結(jié)果顯示，S. thermophilusIMAU20551eps基因簇中的關(guān)鍵基因在菌株各個生長時段均可順利表達(dá)，且在菌株培養(yǎng)6 h時eps基因簇中的部分基因表達(dá)量達(dá)到最高，是菌株代謝產(chǎn)生EPS的關(guān)鍵性階段。