周 琴 董 軍 蔣永海 王偉倩 鄧俊杰

1 紹興市中醫(yī)院 浙江 紹興 312000

2 紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院 浙江 紹興 312071

前胡為傘形科植物白花前胡（Peucedanum praeruptorum Dunn）的干燥根。功能降氣化痰，散風(fēng)清熱，用于痰熱喘滿，咯痰黃稠，風(fēng)熱咳嗽痰多[1]。為了解決中藥材農(nóng)藥殘留問(wèn)題，2020版《中華人民共和國(guó)藥典》2341農(nóng)藥殘留測(cè)定法中新增了第五法，對(duì)中藥藥材及飲片（植物類(lèi)）中禁用農(nóng)藥多殘留做了相關(guān)要求[1]。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）對(duì)浙江臨安、浙江淳安、安徽安國(guó)、四川廣元、貴州畢節(jié)5個(gè)產(chǎn)地前胡中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行測(cè)定，并分析檢測(cè)結(jié)果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Agilent 8890B-7000D氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，Agilent1260-6470高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，超純水儀（美國(guó)Millipore公司），百萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托列多儀器上海有限公司），Auto EVA 80高通量全自動(dòng)平行濃縮儀（?？萍瘓F(tuán)）、移液槍、容量瓶、渦旋混合儀、三號(hào)篩、離心機(jī)。

1.2 試藥：藥材來(lái)源：前胡樣品分別來(lái)源于浙江臨安、浙江淳安、安徽安國(guó)、四川廣元和貴州畢節(jié)，經(jīng)紹興市食品藥品檢驗(yàn)研究院蔣永海主任中藥師鑒定為傘形科植物白花前胡的根，標(biāo)本存放于原藥材標(biāo)本室。試劑：甲酸（CNW V6300090）、甲酸銨（CNW Q7400014）、乙腈（RCI LABSCAN 18 03 0034）、超純水：電阻率18.2MΩ.cm（美國(guó)Millipore公司）；禁用農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液（安譜：D6850065）及相關(guān)化學(xué)品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；HLB固相萃取柱；內(nèi)標(biāo)溶液：磷酸三苯酯（安譜：G172525）。

2 方法

2.1 GC-MS/MS色譜條件：具體如下。

2.1.1 GC色譜條件：用（50%苯基）-甲基聚硅氧烷為固定液的彈性石英毛細(xì)管柱Agilent VF-17MS（柱長(zhǎng)為30m，柱內(nèi)徑為0.25mm，膜厚度為0.25μm）。進(jìn)樣口溫度280℃，不分流進(jìn)樣。載氣為高純氦氣（He）。進(jìn)樣口為恒壓模式，柱前壓力為146kPa。程序升溫：初始溫度80℃，保持1min，以20℃/min升至200℃，再以每分鐘2℃的速率升溫至230℃，最后以每分鐘25℃的速率升溫至320℃，保持3min。

2.1.2 GC質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度250℃。碰撞氣為高純氦氣。質(zhì)譜傳輸接口溫度320℃。質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），各化合物監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）等。見(jiàn)表1。為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各農(nóng)藥。

表1 GC-MS/MS測(cè)定農(nóng)藥的方法學(xué)考察結(jié)果

2.2 LC-MS/MS色譜條件：具體如下。

2.2.1 色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Poroshell 120 EC-C18（柱長(zhǎng)10cm，內(nèi)徑為 2.1mm，粒徑為2.6μm）；以0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）為流動(dòng)相A，以乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）（95：5）為流動(dòng)相B，按下表2進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘0.3mL，柱溫為40℃。

表2 流動(dòng)相梯度

2.2.2 質(zhì)譜條件：以三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)；離子源為電噴霧（ESI）離子源，正離子掃描模式。監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），各化合物參考監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞電壓（CE）見(jiàn)表3。為提高檢測(cè)靈敏度，可根據(jù)保留時(shí)間分段監(jiān)測(cè)各農(nóng)藥。

表3 LC-MS/MS測(cè)定農(nóng)藥的方法學(xué)考察結(jié)果

2.3 對(duì)照溶液的制備：具體如下。

2.3.1 混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取禁用農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液（已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度）1mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2mL，置20mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析用內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取磷酸三苯酯對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈溶解并制成每毫升含l.0mg的溶液，再取1.0mL加乙腈→100.0mL，即得。

2.3.3 空白基質(zhì)溶液的制備：取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液。

2.3.4 基質(zhì)混合對(duì)照溶液的制備：分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0mL（6份），置Auto EVA 80高通量全自動(dòng)平行濃縮儀上，40℃水浴濃縮至約0.6mL，分別加入混合對(duì)照品溶液 10μL、20μL、50μL、100μL、150μL、200μL，加乙腈稀釋至1mL，渦旋混勻，即得。

2.4 供試品溶液的制備：具體如下。

2.4.1 提取：取供試品粉末（過(guò)三號(hào)篩）5g，精密稱定，加氯化鈉1g，立即搖散，再加入乙腈50mL，勻漿處理2min（轉(zhuǎn)速不低于每分鐘12000轉(zhuǎn)），離心（每分鐘4000轉(zhuǎn)），分取上清液，沉淀再加乙腈50mL，勻漿處理1min，離心，合并兩次提取的上清液，減壓濃縮至3～5mL，放冷，用乙腈稀釋至10.0mL，搖勻，即得。

2.4.2 凈化：量取直接提取法制備的供試品溶液3～5mL，通過(guò)親水親油平衡材料（HLB SPE）固相萃取柱（200mg，6mL）凈化，收集全部?jī)艋?，混勻，即得?/p>

2.5 測(cè)定：①氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對(duì)照溶液和供試品溶液各1mL，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.3mL，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1μL，注入氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，按內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，即得。②高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：分別精密吸取上述的基質(zhì)混合對(duì)照溶液和供試品溶液各1mL，精密加入水0.3mL，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。分別精密吸取上述兩種溶液各1μL，注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，按外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，即得。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察：具體如下。

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限：取不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（8～200ng/mL）進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，各農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品在各自線性范圍內(nèi)與測(cè)定值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99，取信噪比（S/N）約為3，計(jì)算檢測(cè)限（LOD）,結(jié)果見(jiàn)表1及表3。

3.1.2 加樣回收試驗(yàn)：取空白樣品粉末5g，加入混合對(duì)照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果低、中、高濃度（0.02、0.04、0.1mg/kg）的平均回收率在70.56%～138.99%，RSD在0.2%～6.3%，見(jiàn)表1及表3。

3.1.3 精密度試驗(yàn)：取20ng/mL基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度，結(jié)果RSD在0.2%～9.2%，見(jiàn)表1及表3。

3.2 樣品中殘留農(nóng)藥測(cè)定：對(duì)5批前胡進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算農(nóng)藥殘留量。結(jié)果5批樣品中有檢出部分農(nóng)藥測(cè)得值均在檢測(cè)限附近，判定結(jié)果為均未檢出禁用農(nóng)藥。

4 討論

4.1 基質(zhì)效應(yīng)：基質(zhì)指的是樣品中除分析物以外的組分，由于基質(zhì)效應(yīng)的存在，基質(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程中產(chǎn)生顯著干擾，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，前胡提取液所得的化學(xué)成分復(fù)雜，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)農(nóng)藥液相色譜質(zhì)譜基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，氣相色譜質(zhì)譜基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)明顯，前胡基質(zhì)效應(yīng)不可忽視。試驗(yàn)中，除了標(biāo)準(zhǔn)曲線采用前胡農(nóng)藥空白基質(zhì)配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液外，對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理也有助于減少基質(zhì)效應(yīng)。農(nóng)藥殘留檢測(cè)的常用凈化方式有直接提取法、QuEChERS法、SPE法、磺化法等。課題組以回收率為指標(biāo)，考察了不同凈化處理對(duì)農(nóng)藥的影響，其中直接提取法大多禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)大，好多禁用農(nóng)藥離子對(duì)檢測(cè)不到，但沒(méi)干擾的禁用農(nóng)藥回收率普遍較高；QuEChERS法禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)明顯小，但沒(méi)干擾的禁用農(nóng)藥回收率也會(huì)偏低；SPE法禁用農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)更小，禁用農(nóng)藥回收率普遍會(huì)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求；最終選用HLB柱凈化效果最佳[2-4]。

4.2 小結(jié)：隨著中藥的廣泛應(yīng)用，中藥材的質(zhì)量安全性是影響中藥產(chǎn)品質(zhì)量和藥效的關(guān)鍵因素,同時(shí)也嚴(yán)重制約著中藥的現(xiàn)代化和國(guó)際化發(fā)展。在中藥材種植過(guò)程中農(nóng)藥的使用對(duì)防治病蟲(chóng)害,提高中藥材產(chǎn)量和保證中藥產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益起到了積極的促進(jìn)作用,但是農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用和濫用不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染,帶有農(nóng)藥殘留的中藥材進(jìn)入人體后,使得中藥材本身的藥效降低,同時(shí)農(nóng)藥本身嚴(yán)重?fù)p害著人體健康[5,6]。

依據(jù)2020版中國(guó)藥典2341第五法，對(duì)五個(gè)不同產(chǎn)地的前胡進(jìn)行研究，確保方法的行之有效，對(duì)中藥禁用農(nóng)藥殘留的質(zhì)量保障提供有力的研究依據(jù)，同時(shí)對(duì)不同產(chǎn)地及不同基質(zhì)的中藥項(xiàng)目提供了有力的支持。