何 冰，武愛(ài)龍，沈一躍，鄭佳明，吳建陽(yáng)

(1 湛江幼兒師范專(zhuān)科學(xué)校，廣東湛江，524037；2 嶺南師范學(xué)院基礎(chǔ)教育學(xué)院，廣東湛江524037)

香蕉是世界四大水果之一[1]，主要產(chǎn)區(qū)為非洲、拉丁美洲和亞洲，全球117個(gè)香蕉生產(chǎn)國(guó)家和地區(qū)中，中國(guó)香蕉種植面積排名第二，僅次于印度[2-3]。中國(guó)香蕉主產(chǎn)區(qū)為臺(tái)灣、福建、海南、云南、廣西、廣東等省(區(qū))，其中廣東省產(chǎn)量最大。香蕉是呼吸躍變型果實(shí)，果實(shí)一般綠硬期采收，后熟食用[4]。

泛素是一種高度保守的蛋白，通過(guò)和其他蛋白共價(jià)結(jié)合發(fā)揮作用。泛素結(jié)合酶(Ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)在DNA修復(fù)、核糖體合成、細(xì)胞周期調(diào)控等多種真核生物代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。所有E2s蛋白都有UBC保守結(jié)構(gòu)域，里面含有1個(gè)半胱氨酸活性位點(diǎn)[7-8]。泛素結(jié)合酶變體蛋白(Ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant，UEV)[9]，又被稱(chēng)為類(lèi)泛素結(jié)合酶蛋白家族，其結(jié)構(gòu)和序列都與E2s相似，但沒(méi)有半胱氨酸催化位點(diǎn)，所以該蛋白沒(méi)有結(jié)合泛素的活性，但由于UBC可以彼此相互作用，形成同二聚體或異二聚體[10]，進(jìn)而影響這些UBC的活性和底物特異性，而UEV與UBC有非常高的同源性，因此UEV可以與某些UBC形成異二聚體，并對(duì)這些特定的UBC的泛素化作用進(jìn)行負(fù)性或正性調(diào)控，因此UEV蛋白也可能參與對(duì)蛋白泛素化的調(diào)控[11]。

UEV參與激素信號(hào)、DNA 損傷和非生物脅迫等多種生物學(xué)功能[12]，MMS2是酵母芽細(xì)胞中第一個(gè)被鑒定的UEV1基因，參與酵母DNA損傷[13]。擬南芥中4個(gè)UEV1基因都可以補(bǔ)充酵母mms2缺失突變體，UEV1D 缺失減弱了植株對(duì)DNA損傷劑的耐受性[14]。水稻OsUEV1s的表達(dá)可以讓酵母mms2突變體不被DNA損傷劑致死[15]。UEV基因與果實(shí)成熟的關(guān)系研究在香蕉中未見(jiàn)報(bào)道。本研究從香蕉基因組中首次鑒定出VUEV基因家族所有成員，分析其理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進(jìn)化關(guān)系，探析其在香蕉后熟過(guò)程的表達(dá)模式，以期為研究UEV基因在香蕉后熟過(guò)程中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所香蕉園內(nèi)，采摘七至八成熟香蕉，帶回實(shí)驗(yàn)室分成單果指，用清水沖洗干凈，挑選外觀一致的果實(shí)用500 mg/L施保功處理3 min后晾干，待其自然成熟，采摘當(dāng)天標(biāo)記為0 d，分別在采后0、1、4、7、17 d等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣備用(見(jiàn)圖1)。

圖1 香蕉采后不同時(shí)間果實(shí)外觀變化

1.2 擬南芥和香蕉UEV基因序列獲取

先利用TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.arabidopsis.org/index.jsp)獲得擬南芥所有UEV基因序列，接著通過(guò)擬南芥UEV序列在香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//banana-genome-hub.southgreen.fr/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，再將獲得的序列放在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，最終獲得香蕉UEV基因序列。

1.3 香蕉UEV基因家族蛋白基本理化性質(zhì)

利用ExPASy在線(xiàn)軟件獲得UEV蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、親水指數(shù)和不穩(wěn)定系數(shù)，利用SOPMA在線(xiàn)分析軟件對(duì)UEV蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，利用CELLO在線(xiàn)軟件對(duì)UEV蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。

1.4 香蕉UEV家族基因結(jié)構(gòu)、保守基序和進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEME在線(xiàn)軟件對(duì)UEV蛋白的保守基序進(jìn)行分析，基序的最大數(shù)目設(shè)置為10。利用TBtools軟件[16]對(duì)UEV基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用ClustalX進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，利用MEGA 6.0的鄰接法對(duì)UEV蛋白家族的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行構(gòu)建。

1.5 香蕉MaUEV熒光定量表達(dá)分析

香蕉總RNA利用植物RNA提取試劑盒提取(華越洋)，cDNA利用TaKaRa公司的M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在RoChe Light Cycler 480Ⅱ儀器上進(jìn)行，利用TaRaKa公司熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果查找在采后成熟過(guò)程中有表達(dá)差異的UEV基因，共計(jì)10個(gè)，依據(jù)其基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物，引物序列見(jiàn)表1，以香蕉Actin基因?yàn)閮?nèi)參，香蕉UEV基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT方法計(jì)算。

表1 香蕉UEV引物

2 結(jié)果與分析

2.1UEV基因家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

試驗(yàn)結(jié)果看出，在香蕉基因組中共鑒定UEV基因13個(gè)，根據(jù)它們?cè)谌旧w上的位置分別命名為MaUEV1～MaUEV13，MaUEV基因分布在1、3、4、5、7、9、10、11號(hào)染色體上，其中9號(hào)染色體上分布的UEV基因數(shù)量最多，為3個(gè)，1、3、4號(hào)染色體上分布的UEV基因數(shù)量次之，為2個(gè)。MaUEV基因開(kāi)放閱讀框介于471～1 637 bp，編碼氨基酸數(shù)量127 ～495個(gè)，分子量14 212.34～56 209.83 Da，13個(gè)MaUEV基因的等電點(diǎn)均小于7；8個(gè)MaUEV基因?yàn)榉€(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，5個(gè)MaUEV基因?yàn)椴环€(wěn)定蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)均大于40；13個(gè)MaUEV基因的總平均疏水指數(shù)均小于0，為親水性蛋白(見(jiàn)表2)。

表2 香蕉UEV基因家族成員理化性質(zhì)

2.2 UEV蛋白家族二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位分析

試驗(yàn)結(jié)果看出，13個(gè)MaUEV蛋白均由無(wú)規(guī)則卷曲、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角、α-螺旋組成，但不同基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例差異較大，β-轉(zhuǎn)角在所有基因占比最低。其中MaUEV1、MaUEV2、MaUEV7、MaUEV13等4個(gè)蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)次之，α-螺旋再次之；MaUEV3、MaUEV4、MaUEV8、MaUEV12等4個(gè)蛋白中α-螺旋所占比例最大，無(wú)規(guī)則卷曲次之，擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)再次之；MaUEV5、MaUEV6、MaUEV9、MaUEV10、MaUEV11等5個(gè)蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，α-螺旋次之，擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)再次之。除MaUEV3蛋白定位在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核外，其他基因編碼蛋白都定位在細(xì)胞核(見(jiàn)表3)。

表3 香蕉UEV蛋白家族二級(jí)結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位

2.3UEV基因家族結(jié)構(gòu)、保守基序和進(jìn)化分析

試驗(yàn)結(jié)果看出，除了MaUEV4無(wú)內(nèi)含子外，其余12個(gè)MaUEV基因均由內(nèi)含子和外顯子組成，內(nèi)含子數(shù)量介于1～12之間，外顯子數(shù)量介于1～13之間。其中，MaUEV8基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)量最多，有12個(gè)內(nèi)含子和13個(gè)外顯子(見(jiàn)圖2)。利用MEME軟件對(duì)UEV基因保守基序分析發(fā)現(xiàn)，MaUEV8只有1個(gè)保守基序，MaUEV1、MaUEV2、MaUEV7、MaUEV13具有3個(gè)相同的基序，MaUEV3和MaUEV12具有6個(gè)相同的基序，MaUEV5和MaUEV6具有1個(gè)相同的基序，MaUEV9和MaUEV11具有4個(gè)相同的基序(見(jiàn)圖3)。構(gòu)建了香蕉、擬南芥、水稻UEV的進(jìn)化樹(shù)，香蕉UEV與水稻的親緣關(guān)系更近，且MaUEV1和MaUEV13、MaUEV9和MaUEV11、MaUEV3和MaUEV12聚類(lèi)在一起，這與它們基因結(jié)構(gòu)和保守基序數(shù)量相同(見(jiàn)圖4)。

圖2 香蕉UEV家族基因結(jié)構(gòu)

圖3 香蕉UEV基因家族保守基序

圖4 香蕉、擬南芥和水稻UEV蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 香蕉后熟過(guò)程中UEV基因表達(dá)分析

試驗(yàn)結(jié)果看出，香蕉后熟過(guò)程中，UEV基因家族成員表達(dá)趨勢(shì)差異較大。MaUEV2、MaUEV5、MaUEV7、MaUEV10、MaUEV12等5個(gè)基因在采后0～7 d表達(dá)差異不大且稍有下調(diào)，但是在采后17 d顯著上調(diào)。MaUEV3在采后0～4 d表達(dá)量稍有增加，在采后4～17 d稍有下降。MaUEV6和MaUEV9在后熟過(guò)程中逐漸下降，MaUEV6表達(dá)量變化不大，采后17 d的表達(dá)量下降至最低，僅為采后0 d的63%；而MaUEV9顯著下降，采后17 d的表達(dá)量下降至最低，是0 d的32%。MaUEV11在采后0～4 d表達(dá)量逐漸下降，采后4～17 d表達(dá)量逐漸增加。MaUEV13基因在后熟過(guò)程中逐漸增加，采后17 d表達(dá)量達(dá)到峰值，約為采后0 d表達(dá)量的3倍(見(jiàn)圖5和圖6)。

注：不同小寫(xiě)字母表示差異顯著，p<0.05。圖6同。

圖6 香蕉后熟過(guò)程中4個(gè)MaUEV基因熒光定量表達(dá)比較

3 結(jié)論與討論

UEV基因參與激素信號(hào)、DNA損傷和非生物脅迫等多種生物學(xué)功能，在番茄、藻類(lèi)、苔蘚、山楂等植物中都有報(bào)道[17]，玉米[18]和可可[19]中有UEV基因6個(gè)，擬南芥中有8個(gè)[20]。本研究在香蕉中共鑒定UEV基因13個(gè)，MaUEV基因編碼區(qū)域471～1 637 bp，編碼氨基酸數(shù)量127～495個(gè)，分子量14 212.34～56 209.83 Da，等電點(diǎn)均小于7；8個(gè)MaUEV基因編碼蛋白為穩(wěn)定蛋白，5個(gè)MaUEV基因編碼蛋白為不穩(wěn)定蛋白；13個(gè)MaUEV基因編碼蛋白均為親水性蛋白，其編碼蛋白均由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、擴(kuò)展鏈結(jié)構(gòu)、無(wú)規(guī)則卷曲組成；除MaUEV3定位在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核外，其他基因都定位在細(xì)胞核。前人對(duì)UEV基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，番茄UEV基因外顯子數(shù)量1～5個(gè)[12]，可可UEV基因外顯子數(shù)量1～9個(gè)[19]，本研究發(fā)現(xiàn)香蕉中MaUEV基因外顯子數(shù)量1～13個(gè)。

UEV是一類(lèi)在結(jié)構(gòu)和功能上都非常保守的蛋白，盡管沒(méi)有半胱氨酸催化位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和序列都與E2s相似，UEV蛋白也可能參與對(duì)蛋白泛素化的調(diào)控。在擬南芥中COP10屬于UEV蛋白，該蛋白在植物光形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用[21]。UEV蛋白在香蕉中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究在香蕉后熟過(guò)程中分析了UEV基因家族的表達(dá)情況，根據(jù)其表達(dá)模式可以分為5種類(lèi)型。第一類(lèi)基因在采后0～7 d表達(dá)差異不大且稍有下降，采后17 d顯著上調(diào)，包括MaUEV2、MaUEV5、MaUEV7、MaUEV10、MaUEV12等5個(gè)基因。第二類(lèi)基因表達(dá)量先增加后下降，但變化幅度不大，MaUEV3屬于這種類(lèi)型。第三類(lèi)基因在整個(gè)后熟過(guò)程中呈下調(diào)表達(dá)，MaUEV6和MaUEV9屬于這種類(lèi)型，但MaUEV6表達(dá)量變化不大，MaUEV9顯著下調(diào)。第四類(lèi)基因表達(dá)量先下降后增加，但變化幅度不大，MaUEV11屬于這種類(lèi)型。第五類(lèi)基因表達(dá)量在整個(gè)后熟過(guò)程中逐漸增加，并在成熟時(shí)顯著上調(diào)，MaUEV13屬于這種類(lèi)型。鑒于MaUEV9 和MaUEV13在香蕉后熟過(guò)程中表達(dá)差異顯著且表達(dá)趨勢(shì)相反，推測(cè)不同MaUEV基因在香蕉后熟過(guò)程中作用不同。