吳 群，孫建城，張姬雯，程慧林

(1 衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，浙江衢州，324000； 2 衢州市農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，浙江衢州，324000)

黃酮類化合物是植物次級(jí)代謝產(chǎn)物中一種分子量較低的多酚類物質(zhì)，在自然界多種植物中廣泛存在，主要分布于植物的根、莖、葉、花、種子等部位，在各種蔬菜、水果和谷物中含量豐富[1]。許多研究證明，黃酮類化合物作為一種高效和副作用小的抗氧化劑，在抗癌、抗病毒、抗炎、抑制血小板凝集以及改善血管脆性等方面具有良好的生理功能[2-3]。迄今已從柑桔中鑒定出250多種黃酮類化合物[4]。根據(jù)黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)、官能團(tuán)種類及位置，柑桔中的黃酮類化合物主要有以下7類：黃烷酮、黃酮、黃酮醇、黃烷醇、多甲氧基黃酮、異黃酮和花色苷[5]。柑桔果皮中富含的胡蘿卜素、精油、果膠、黃酮類化合物、檸檬苦素等生物活性物質(zhì)，具有抗氧化[6]、抗過敏[7]、抗炎[8]、抗癌[9-10]、降血壓[11]、降血脂[11-12]等生物活性。柑桔含有豐富的酚類物質(zhì)，果皮中酚類物質(zhì)的含量比果肉多，果皮中黃酮類化合物的含量比種子多[13]；黃酮/黃酮醇含量最高的部位是葉，其次是外果皮[14]。目前對(duì)成熟胡柚果實(shí)的黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)的研究報(bào)道[15-17]已有不少。利用常山胡柚小青果已經(jīng)開發(fā)出中藥飲片[18]，利用胡柚、椪柑、日本加工型香橙的青果挖除果肉烘干制成的桔胎茶產(chǎn)品比較受市場歡迎，但對(duì)這3種青果的最佳采摘期和黃酮類化合物變化研究不多。通過研究椪柑、胡柚和新發(fā)展的加工用香橙3種柑桔青果黃酮類物質(zhì)的變化和差異，對(duì)青果的加工利用有較大指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料在衢州市衢江區(qū)蓮花鎮(zhèn)十里豐農(nóng)場統(tǒng)一管理的柑桔園，選香橙(Citrusjunos)、胡柚(Ciritusparadisi‘Changshanhuyou’)、椪柑(Critusreticulata‘Ponkan’)第二次生理落果結(jié)束后不同時(shí)期的青果，即從2021年7月26日到8月23日(幼果膨大期)每隔7 d從選定的植株上采果(果實(shí)橫徑在35～60 mm之間)。每個(gè)品種選3株樹，每株樹每次采10個(gè)果，要求隨機(jī)選取無明顯病蟲斑、大小均勻的果實(shí)，對(duì)半橫切，挖除囊衣和果肉部分，留下果皮部分待測。

1.2 儀器與主要試劑儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀，Compass C18(2)反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，超聲波清洗器，湘儀高速冷凍離心機(jī)，旋渦混合器。試劑：蕓香柚皮苷(CAS：14259-46-2)、橙皮苷(CAS：520-26-3)、新橙皮苷(CAS：13241-33-3)、甜橙黃酮(CAS：2306-27-6)、川皮苷(CAS：478-01-3)和蘆丁(CAS：153-18-4)標(biāo)準(zhǔn)品(源葉，純度≥98%)，HPLC級(jí)乙腈(OCEANPAK，純度≥99.9%)，HPLC級(jí)甲醇(OCEANPAK，純度≥99.9%)，磷酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，≥85.0%)，鹽酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純，36.0%～38.0%)，超純水。

1.3 檢測方法樣品前處理操作。蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川皮苷樣液制備：稱取約2 g果皮樣本，加入10 mL 80%甲醇水溶液，研磨成漿，超聲1 h后過夜浸提，離心取上清，過濾器過濾后待測。蘆丁(又稱蕓香苷)樣液制備：稱取約0.2 g果皮樣本，加入1.5 mL甲醇-鹽酸混合液(V甲醇∶V25%鹽酸=4∶1)研磨成漿后轉(zhuǎn)入EP管中，80 ℃水解1 h，超聲1 h，離心取上清液，定容至1.5 mL，過濾器過濾后待測。

液相色譜分析條件：Agilent1100高效液相色譜儀，波長為287 nm(檢測蘆丁波長為360 nm)。Compass C18(2)反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。柱溫為30 ℃。流速為0.8 mL/min。進(jìn)樣體積為10 μL。流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，B為乙腈，按表1進(jìn)行梯度洗脫(檢測蘆丁時(shí)，VA∶VB=80∶20)。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)間和比例(體積比)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定精確稱取蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川皮苷和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配置成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件，依次檢測各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算得到蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川皮苷、蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，線性范圍與相關(guān)系數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析通過各物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程將樣品液測得的色譜峰面積轉(zhuǎn)換為質(zhì)量濃度，再根據(jù)樣品制備樣品液過程中稀釋倍數(shù)關(guān)系求得樣品中各物質(zhì)含量。采用SAS軟件進(jìn)行差異顯著性(α=0.05)和極顯著性(α=0.01)檢驗(yàn)分析，檢驗(yàn)方法為鄧肯氏新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線在本試驗(yàn)條件下，蕓香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甜橙黃酮、川皮苷、蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，線性范圍與相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 檢測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和保留時(shí)間

2.2 不同采摘期椪柑青果皮6種黃酮類化合物含量變化在7月26日至8月23日期間，蕓香柚皮苷含量先短期(7月26日至8月2日)上升，此后基本不變。8月16日，橙皮苷含量(859.45 μg/g)和蘆丁含量(46.02 μg/g)達(dá)到最高值。8月9日，新橙皮苷含量(36.84 μg/g)、甜橙黃酮含量(1 371.27 μg/g)和川皮苷含量(7 035.90 μg/g)達(dá)到最高值。總體上，椪柑青果黃酮類化合物含量在8月9日至8月16日達(dá)高峰(見表3)。

表3 不同采摘期椪柑青果皮6種黃酮類化合物含量變化 μg/g

2.3 不同采摘期胡柚青果皮6種黃酮類化合物含量變化在7月26日至8月23日期間，蕓香柚皮苷和橙皮苷含量呈下降趨勢。新橙皮苷含量在8月2日后呈下降趨勢。甜橙黃酮和川皮苷含量先升后降再略升，在8月9日達(dá)到最高。蘆丁含量則逐漸升高。總體上，蕓香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量在7月下旬至8月初較高；甜橙黃酮和川皮苷含量在8月上旬較高，蘆丁含量隨果實(shí)膨大而一直增加(見表4)。

表4 不同采摘期胡柚青果皮6種黃酮類化合物含量變化 μg/g

2.4 不同采摘期香橙青果皮6種黃酮類化合物含量變化在7月26日至8月16日期間，蕓香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量持續(xù)下降，8月23日又有所回升，以7月26日的含量最高。甜橙黃酮和川皮苷含量先降后升，含量最低值分別出現(xiàn)在8月2日和8月9日。蘆丁含量隨果實(shí)膨大而升高，且從7月26日到8月2日變化幅度大(見表5)。

表5 不同采摘期香橙青果皮6種黃酮類化合物含量變化 μg/g

2.5 相同時(shí)期不同柑桔青果皮黃酮類化合物含量差異選取8月9日樣品進(jìn)行對(duì)比的結(jié)果表明，不同柑桔品種青果間黃酮類化合物含量存在較大差異。同期，香橙青果皮的蕓香柚皮苷、橙皮苷和蘆丁含量高，與椪柑和胡柚都有極顯著差異；胡柚青果皮的新橙皮苷含量最高，與香橙、椪柑有極顯著差異，其中，椪柑青果皮的新橙皮苷含量很低；椪柑青果的甜橙黃酮和川皮苷含量高，與胡柚和香橙有極顯著差異(見表6)。

表6 椪柑、胡柚、香橙青果皮6種黃酮類化合物含量對(duì)比 μg/g

3 討論與結(jié)論

衢州是浙江省重點(diǎn)柑桔產(chǎn)區(qū)，以椪柑和胡柚等為主栽品種。近幾年隨著全國柑桔產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，晚熟柑桔沃柑和春見等發(fā)展迅速。由于與這些品種的銷售期重疊，衢州椪柑的貯藏優(yōu)勢喪失，春節(jié)后市場受到嚴(yán)重沖擊[19]。為了應(yīng)對(duì)市場變化，衢州柑桔產(chǎn)業(yè)加快轉(zhuǎn)型力度，柑桔加工產(chǎn)業(yè)逐漸成熟，青果也逐步被開發(fā)利用。衢州地區(qū)有明顯的梅雨期，梅雨期結(jié)束進(jìn)入高溫干旱少雨的時(shí)期，這與幼果的膨大期基本一致。鄭雪良等[20]在胡柚小青果的黃酮類化合物含量和抗氧化活性的研究中指出，胡柚小青果的黃酮類化合物絕大部分以黃烷酮糖苷形式存在，主要為柚皮苷，其次為新橙皮苷，還含有蕓香柚皮苷等。胡柚富含黃酮類化合物、檸檬苦素等生物活性物質(zhì)，有清除自由基、提高人體免疫力、抗菌、消炎以及預(yù)防腫瘤的功效[21]，胡柚果皮中的黃酮類化合物含量也非?？捎^，胡柚果皮粗提物清除自由基的能力并不比黃酮類化合物單體弱，有的甚至強(qiáng)于單體化合物[16]。目前，國內(nèi)柑桔青果皮利用較為成功的案例是廣東利用茶枝柑青果皮加工成柑普茶。在廣東，5—9月茶枝柑果皮中的總黃酮含量隨著采收期的延遲而逐漸下降，以5月的含量最高，12月成熟時(shí)含量最低，說明隨著成熟度的增加總黃酮成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化或者總黃酮成分的積累速度低于果皮質(zhì)量的積累速度，以致總黃酮的相對(duì)含量呈降低趨勢[22]。同一品種，不同采收期黃酮類化合物含量變化差異較大[23]。不同柑桔品種，同一采收期青果的黃類酮化合物含量對(duì)青果加工也有較大影響。

本研究表明，第二次生理落果后，胡柚、椪柑、香橙青果(幼果)果皮的6種黃酮類化合物含量隨著膨大過程變化而變化，增減不一。8月16日的檢測數(shù)據(jù)有些異常，推測可能與前一天雨后采樣有關(guān)。8月上旬(8月9日)，香橙青果皮的蕓香柚皮苷、橙皮苷、蘆丁含量高于椪柑和胡柚青果皮，胡柚青果皮的新橙皮苷含量高于香橙和椪柑青果皮，椪柑青果皮甜橙黃酮和川皮苷含量高于胡柚和香橙青果，因而在其加工產(chǎn)品也就存在口感差異。目前國內(nèi)對(duì)加工用香橙青果的研究不多，通過檢測椪柑、胡柚和香橙青果6種黃酮類化合物含量及變化能對(duì)今后生產(chǎn)利用起到一定指導(dǎo)意義。