胡亞平，郭雁君，吉前華，蔣 惠，楊鳳梅，郭麗英

(肇慶學(xué)院果樹研究所/肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東肇慶，526061)

幾丁質(zhì)(Chitin)又稱甲殼素，是由N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4糖苷鍵連接而成的線性多糖，是細(xì)菌、真菌、線蟲、甲殼動(dòng)物、昆蟲等物種外殼細(xì)胞壁的主要成分[1]。植物在受到真菌等病原侵襲時(shí)，其幾丁質(zhì)酶基因被誘導(dǎo)大量表達(dá)，產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶可將真菌等病原的細(xì)胞壁幾丁質(zhì)降解為N-乙酰氨基葡萄糖，破壞病原的細(xì)胞壁，拮抗侵染[2]。電鏡觀察結(jié)果顯示，幾丁質(zhì)酶常作用于菌絲頂端新合成的幾丁質(zhì)壁，使頂端壁合成中的代謝平衡被破壞，使頂端膨脹并融解，從而達(dá)到抑菌效果[3]。幾丁質(zhì)酶被用作基因工程提高植物抗病能力的靶標(biāo)，通過(guò)轉(zhuǎn)入外源幾丁質(zhì)酶基因、提高內(nèi)源幾丁質(zhì)酶表達(dá)水平、改造植物原有的幾丁質(zhì)酶基因或?qū)锥≠|(zhì)酶基因與其他基因聯(lián)合表達(dá)，都有成功提高植物抗病能力的報(bào)道[4-18]。將柑桔的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行整理、歸類和分析，了解每個(gè)基因的特性，清楚其作用，對(duì)利用幾丁質(zhì)酶基因提高柑桔抗病能力、提高柑桔產(chǎn)量和品質(zhì)有積極作用。

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)生物基本信息分析在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)公布的柑桔基因組數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http：//citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)上檢索關(guān)鍵詞“Chitinase”，獲得柑桔的32個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的DNA序列、蛋白質(zhì)序列、染色體位置、內(nèi)含子和外顯子等信息。使用Vector NTI 11.5軟件對(duì)信息進(jìn)行整合，并分析這些基因的分子量、等電點(diǎn)等。

1.2 信號(hào)肽、細(xì)胞定位分析信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移(或定位)的氨基酸序列，長(zhǎng)度5～30個(gè)氨基酸殘基，通常位于N-末端。使用SignalP 4.1和phobius兩種軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽，使用phobius和TMHMM軟件可對(duì)蛋白在細(xì)胞中的定位進(jìn)行分析。

1.3 保守結(jié)構(gòu)域分析保守結(jié)構(gòu)域是指在生物進(jìn)化或者一個(gè)蛋白家族中具有不變或相同的結(jié)構(gòu)域，他們一般具有重要的功能，不能被改變。采用NCBI網(wǎng)站上的Conserved Domain Search軟件對(duì)柑桔幾丁質(zhì)酶蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.4 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹使用Vector NTI 11.5軟件，選取最大似然法得到柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族在柑桔染色體上的位置分布基于全基因組序列，共獲得32個(gè)幾丁質(zhì)酶基因成員。有26個(gè)基因分布在柑桔染色體1、4、5、7、8、9上，在4、5、7、8染色體上部分基因成簇排列、彼此距離非常接近；其余6個(gè)成員(編號(hào)以orange1.1t開頭的基因)未能定位于染色體上(見表1)。

2.2 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的長(zhǎng)度和分子量32個(gè)柑桔幾丁質(zhì)酶基因所編碼蛋白質(zhì)的分子量在14 851.52～72 736.09 Da之間。其中，orange1.1t00476.1編碼蛋白分子量最大，長(zhǎng)達(dá)636 個(gè)氨基酸(aa)；Cs5g21860.1編碼蛋白等電點(diǎn)(9.15)是所有幾丁質(zhì)酶中最高的。Cs5g21890.1編碼蛋白分子量最小，僅134 個(gè)aa，其等電點(diǎn)也是最小的，僅為4.53(見表1)。

表1 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的特征

2.3 柑桔幾丁質(zhì)酶基因家族的信號(hào)肽及細(xì)胞學(xué)定位使用SignalP，Phobius和TMHMM 3種軟件分析柑桔幾丁質(zhì)酶家族蛋白的信號(hào)肽以及細(xì)胞定位，由此可以將它們分為4種類型。23個(gè)幾丁質(zhì)酶屬于第1種類型(圖1A、B、C)：有信號(hào)肽且定位在細(xì)胞外，說(shuō)明這些蛋白在信號(hào)肽的介導(dǎo)下輸出到細(xì)胞外執(zhí)行生物功能。6個(gè)幾丁質(zhì)酶屬于第2種類型(圖1D、E、F)：有信號(hào)肽，是跨膜蛋白，大部分位于細(xì)胞外，中間有一小段跨膜區(qū)域，C端位于細(xì)胞內(nèi)。2個(gè)幾丁質(zhì)酶屬于第3種類型(圖1G、H、I)：無(wú)信號(hào)肽，定位在細(xì)胞外。1個(gè)幾丁質(zhì)酶(orange1.1t00476.1)屬于第4種類型(圖1J、K、L)：無(wú)信號(hào)肽，是跨膜蛋白。

注：使用Phobius(圖A、D、G、J)，TMHMM(圖B、E、H、K)和SignalP(圖C、F、I、L)三種軟件對(duì)幾丁質(zhì)酶家族蛋白進(jìn)行分析的結(jié)果。圖A、B、C以Cs1g26330.1為例，圖D、E、F 以Cs5g21890.1為例，圖G、H、I 以Cs4g01410.2為例，圖J、K、L是orange1.1t00476.1。

2.4 柑桔幾丁質(zhì)酶家族基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平在柑桔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)，可以得到每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。在葉子中，基因Cs5g24680.1相對(duì)表達(dá)量最高，其次是orange1.1t05124.1、Cs9g18700.1、Cs8g01810.1和Cs8g01810.2，其他的基因相對(duì)表達(dá)量較少；在果實(shí)中，基因cs5g24680.1相對(duì)表達(dá)量最高，其他的基因相對(duì)表達(dá)量都較低；在愈傷組織中，基因Cs9g18700.1相對(duì)表達(dá)量最高，其次是Cs5g24680.1，Cs5g21860.1 、Cs9g14710.1等基因，其他基因的相對(duì)表達(dá)量較低；在花朵中，基因Cs8g01840.1的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是cs5g24680.1，Cs8g01810.1、Cs8g01810.2、orange1.1t05124.1，Cs8g01850.1，其他基因相對(duì)表達(dá)較低(見表2)。

表2 柑桔幾丁質(zhì)酶的家族基因在植物愈傷組織、花、葉、果實(shí)中的轉(zhuǎn)錄水平(相對(duì)表達(dá)量)

2.5 柑桔幾丁質(zhì)酶家族基因保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育樹將這些幾丁質(zhì)酶的蛋白序列用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2A所示。用NCBI Conserved Domain Search分析這32個(gè)基因的結(jié)構(gòu)域，并將它們放在一起進(jìn)行比較，結(jié)果見圖2B所示。將基因信號(hào)肽、細(xì)胞學(xué)定位分析的結(jié)果做成簡(jiǎn)圖，結(jié)果如圖2C所示。綜合三者的分析結(jié)果，可以將32個(gè)柑桔幾丁質(zhì)酶分為4類。

第Ⅰ類(圖2A藍(lán)色線條，5個(gè))：都含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有糖基水解酶的功能(圖2B)，都含信號(hào)肽且定位在細(xì)胞外(圖2C)。

第Ⅱ類(圖2A綠色線條，10個(gè))：都含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有糖基水解酶的功能，大部分基因除此之外還含有一個(gè)絲氨酸/蘇氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域(圖2B)，多數(shù)是含有信號(hào)肽的跨膜蛋白(圖2C)。

第III類(圖2A紅色，16個(gè))：都含有GH19幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，它同時(shí)具有溶菌酶的活性，部分基因還含有幾丁質(zhì)結(jié)合域(圖2B)，都有信號(hào)肽且定位在細(xì)胞外(圖2C)。

第IV類(圖2A黑色，1個(gè))：含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有糖基水解酶的功能，此外還含有一個(gè)PPR重復(fù)，是抗病蛋白中一個(gè)常見的結(jié)構(gòu)域，功能未知(圖2B)，是個(gè)無(wú)信號(hào)肽的跨膜蛋白(圖2C)。

注：圖左是基于基因編碼蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，中間是對(duì)應(yīng)基因的保守結(jié)構(gòu)域簡(jiǎn)圖，圖右是這些基因編碼的信號(hào)肽和細(xì)胞定位，左側(cè)箭頭代表有信號(hào)肽，中間箭頭代表定位在細(xì)胞外部分，右側(cè)箭頭代表定位在細(xì)胞內(nèi)的部分。

3 討論

植物幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)可以分為N-端信號(hào)肽區(qū)、主結(jié)構(gòu)區(qū)(催化區(qū))和C-端延伸區(qū)三部分，有的在N-端信號(hào)區(qū)之后有富含半胱氨酸的幾丁質(zhì)結(jié)合域，它與主結(jié)構(gòu)區(qū)之間有一段可變交聯(lián)區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)，柑桔幾丁質(zhì)酶家族全部帶有催化功能區(qū)，該區(qū)主要負(fù)責(zé)催化功能，切斷幾丁質(zhì)以達(dá)到抗病作用；其中，第Ⅰ、Ⅱ、IV類柑桔幾丁質(zhì)酶含有GH18幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，含有GH18結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶廣泛存在于病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲、節(jié)肢動(dòng)物、植物和哺乳動(dòng)物中，其主要功能是分解周圍環(huán)境中的幾丁質(zhì)，以滿足其自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求，而對(duì)真菌的抑制能力較弱；第III類柑桔幾丁質(zhì)酶含GH19幾丁質(zhì)酶結(jié)構(gòu)域，含GH19結(jié)構(gòu)域的幾丁質(zhì)酶主要存在于植物中，有糖基化水解酶功能，其功能主要是抑制病原真菌的生長(zhǎng)，進(jìn)行自我防御，可能在植物抗病過(guò)程中具有較為重要的功能[19]。

不同類型的幾丁質(zhì)酶及其在細(xì)胞中定位的不同，使其在抗真菌中的作用也不同[1，20]。體外抑菌試驗(yàn)中，堿性幾丁質(zhì)酶具有最高抗菌活性，而其他的幾丁質(zhì)酶則幾乎無(wú)抑菌活性。本研究對(duì)柑桔幾丁質(zhì)酶等電點(diǎn)進(jìn)行分析顯示(表1)，等電點(diǎn)大于8的幾丁質(zhì)酶有11個(gè)，可能具有較高的抗菌活性。多數(shù)細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶等電點(diǎn)為酸性，放線菌的幾丁質(zhì)酶等電點(diǎn)一般為中性或堿性，而植物的幾丁質(zhì)酶等電點(diǎn)往往為較強(qiáng)酸性或較強(qiáng)堿性[19]。柑桔[15]絕大多數(shù)幾丁質(zhì)酶(26個(gè))帶有信號(hào)肽(長(zhǎng)度在20～30氨基酸殘基)，表明這部分酶是在信號(hào)肽介導(dǎo)下輸出到細(xì)胞外發(fā)揮作用；部分酶(7個(gè))帶有C端延伸區(qū)，以跨膜蛋白形式存在。在植物體內(nèi)，細(xì)胞間隙定位的幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為與宿主早期防御反應(yīng)有關(guān)，它可以間接地釋放真菌誘導(dǎo)因子從而激發(fā)進(jìn)一步的防衛(wèi)反應(yīng)[5]。在本研究鑒定出的第Ⅱ類幾丁質(zhì)酶中，有7個(gè)為跨膜蛋白，可能與宿主早期防御反應(yīng)有關(guān)。

正常情況下，植物中的幾丁質(zhì)酶活性很低，但在受到病原物及其激發(fā)子、乙烯、水楊酸、紫外線及重金屬等的誘導(dǎo)下，其活性迅速提高[21]。許多植物在感染病毒后幾丁質(zhì)酶活性急劇升高，而且會(huì)同時(shí)產(chǎn)生多種幾丁質(zhì)酶[22]。TMV病毒不僅能誘導(dǎo)黃瓜幾丁質(zhì)酶局部活性達(dá)600倍，而且還能誘導(dǎo)整個(gè)系統(tǒng)獲得此酶活性[23]。真菌及其激發(fā)子可誘導(dǎo)植物中幾丁質(zhì)酶的活性急劇增加，在番茄、豌豆、油菜、菜豆等受到病原真菌侵染時(shí)均可產(chǎn)生較高的幾丁質(zhì)酶活性，且多種類型的幾丁質(zhì)酶共存；當(dāng)用真菌細(xì)胞壁或激發(fā)子處理胡蘿卜和馬鈴薯時(shí)也發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶活性增加[20]。植物幾丁質(zhì)酶還可受一些物理及化學(xué)因素誘導(dǎo)，在鹽溶液噴灑、受傷、紫外輻射、升汞處理時(shí)，幾丁質(zhì)酶活性也會(huì)被誘導(dǎo)[24，25]。