王媛，毛瑩瑩，向虹怡，馮耀元，張惠娜，劉宣辰，袁威，賀鑫梅，邢曉婭，韓英浩

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319）

低溫等離子體（Non-thermal Atmospheric Pressure Plasma，NTAPP），作為一種由電子和離子群組成的近電中性電離氣體，因其溫度接近室溫，且在大氣壓下即可產(chǎn)生，也被稱(chēng)作大氣壓低溫等離子體，其組分主要包括活性粒子、紫外輻射、帶電粒子及瞬時(shí)電場(chǎng)[1]。近年來(lái)，因其很容易在空氣中生成，使用時(shí)不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成熱損傷而被廣泛應(yīng)用于血液凝固、傷口愈合、消毒滅菌、牙齒美白和潰瘍治療上[2-3]，可見(jiàn)，NTAPP的臨床應(yīng)用已成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域。

先前關(guān)于NTAPP在人類(lèi)細(xì)胞的臨床應(yīng)用的研究主要集中在其誘導(dǎo)壞死[4]或凋亡[5-7]的能力。一些研究小組已經(jīng)證明，NTAPPs可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-9]，并減少小鼠異種移植模型的腫瘤體積[10]，從而提示NTAPP在癌癥治療中的應(yīng)用。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在低溫等離子體與細(xì)胞作用過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)的ROS等物質(zhì)濃度顯著增加，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[11]，可見(jiàn)，活性氧（ROS）是體外NTAPP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的主要參與者。然而，最近的研究表明，NTAPP也可以促進(jìn)胚胎成纖維細(xì)胞（IMR90）和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（AMSCs）的增殖[12]，此外也有研究人員發(fā)現(xiàn)NTAPPs通過(guò)激活人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCa T細(xì)胞系的NRF2信號(hào)通路，在體外加速傷口愈合[13]。這使得研究人員得出結(jié)論較低劑量的NTAPP可引起體外培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生“正效應(yīng)”，如增殖、分泌細(xì)胞因子和膠原合成增加等，而較高劑量會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)的細(xì)胞出現(xiàn)一系列“負(fù)效應(yīng)”，如細(xì)胞黏附能力降低、細(xì)胞通透性增加、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死等。

MSCs存在于多種組織之中，因其具有多向分化潛能、自我復(fù)制和促進(jìn)受損組織修復(fù)等特點(diǎn)而日益受到人們的關(guān)注[14]。有研究表明，MSCs可分化發(fā)育成某種類(lèi)型組織的細(xì)胞，參與組織的生長(zhǎng)發(fā)育與修復(fù)，此外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用和旁分泌效應(yīng)?？梢?jiàn)MSCs成為治療多種疾病的理想種子細(xì)胞[15]。然而，在體外培養(yǎng)成體干細(xì)胞時(shí)，很難保證它們干性穩(wěn)定存在，并且成體干細(xì)胞在體外會(huì)快速衰老，因此，找到NTAPP誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡與增殖兩者之間的最佳劑量可為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論。

因此，試驗(yàn)采用真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSCs）為研究對(duì)象，利用低溫等離子體活化介質(zhì)處理DMSCs，初步探討低溫等離子體活化介質(zhì)使真皮間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡的條件，闡明低溫等離子體活化介質(zhì)誘導(dǎo)DMSCs凋亡的分子機(jī)制，為豐富低溫等離子體在干細(xì)胞領(lǐng)域的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

小鼠原代真皮間充質(zhì)干細(xì)胞DMSCs（來(lái)自129/SvJ小鼠）

1.1.2 藥品與試劑

DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；F12培養(yǎng)基（Hy－Clone）；青鏈霉素混合液（100×）細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用（P/S）（北京索萊寶公司）；優(yōu)級(jí)胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）不含酚紅（T/E）（北京索萊寶公司）；表皮生長(zhǎng)因子EGF、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF2（金斯瑞公司）。

1.2 方法

1.2.1 DMSCs的提取與培養(yǎng)

取新出生的2 d的小鼠，取75%酒精于50 mL離心管中，將小鼠放入其中2 min，取Hank’s+G于50 mL離心管中，將小鼠放入其中2 min，將小鼠取出，從頸部分離整塊皮膚，將皮膚表皮朝上，真皮朝下平鋪在3.5 cm培養(yǎng)皿中，加入2 m L Hank’s+G，4℃過(guò)夜。第2天將取下的皮膚平鋪至新的3.5 cm培養(yǎng)皿中，向其加入2 mL T/E，平穩(wěn)放入4℃冰箱4 h后，之后用鑷子輕輕摘除皮膚下的脂肪，再置于T/E中，放入37℃培養(yǎng)箱消化1 h后，用鑷子將表皮與真皮分開(kāi)，用剪子將真皮組織盡可能剪碎，置于T/E中37℃水浴鍋消化1 h，用ccm阻斷，進(jìn)行1200 rpm·min-1離心7 min，小心吸除上清，加入DMSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基，吹打混勻后70 μm strainer過(guò)濾，再次1200 rpm·min-1離心7 min，小心棄掉上清，用5 mL DMSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞球，種于6 cm培養(yǎng)皿，放入5%二氧化碳（CO2），37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察形態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，1∶3傳代。

1.2.2 DMSCs的鑒定

利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物：回收細(xì)胞球，6 mL PBS重懸，分為6個(gè)1.5 mL Tube管，5 000 rpm離心3 min，棄上清，1%FCS重懸，分別加入1uL CD44、CD106、CD45、CD34、CD14熒光抗體，4℃孵育30 min，吹打混勻，轉(zhuǎn)移至流式管，通過(guò)表達(dá)CD44和CD106及不表達(dá)CD45、CD34、CD14等指標(biāo)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)對(duì)分離培養(yǎng)的DMSCs進(jìn)行鑒定。

細(xì)胞分化能力檢測(cè)：以DMEM+10% FBS+1 μm地塞米松+0.5 mM IBMX+10 μm牛胰島素的條件下進(jìn)行成脂誘導(dǎo)分化，通過(guò)油紅O染色進(jìn)行鑒定。以DMEM+10%FBS+1 μm地塞米松+10 mM-甘油磷酸鈉的條件下進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，通過(guò)茜素紅染色進(jìn)行鑒定。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將細(xì)胞以每板以1.2×105個(gè)的細(xì)胞濃度種至6孔板皿中。使用低溫等離子體活化介質(zhì)處理分別真皮間充質(zhì)干細(xì)胞0、10、30 s。在終止培養(yǎng)時(shí)，回收每孔中的細(xì)胞上清到做好標(biāo)記的2 mL的Tube管中，隨即加入200 uL胰酶，輕輕敲打6孔板，放入培養(yǎng)箱中孵育3 min，利用已經(jīng)預(yù)熱的DMSCs專(zhuān)用培養(yǎng)基對(duì)進(jìn)行消化的細(xì)胞進(jìn)行每孔1 mL的細(xì)胞阻斷，使其停止消化?；厥障碌募?xì)胞懸液至做好標(biāo)記的1.5 mL的Tube管中，進(jìn)行5 000 rpm·min-1離心5 min，棄去上層液體。先向2.0 mL的Tube管中加入500 uL 1×Binding Buffer用來(lái)懸浮管底細(xì)胞，再將管中的全部溶液加入相同組別的1.5 mL的Tube管中，對(duì)管底細(xì)胞吹打混勻，全部吹打混勻后，分別從每管中取出90 uL，混勻后均分為三等份（將作為空白對(duì)照及單染對(duì)照）。向每管實(shí)驗(yàn)組中加入5 uL的Annexin V-APC染料，25℃避光孵育15 min。在結(jié)束孵育后，向每管補(bǔ)充PBS溶液至500 uL，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至流式管中，注意標(biāo)好每管組別后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀操作。結(jié)束后，拷貝數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS

將細(xì)胞以每板以1.2×105個(gè)的細(xì)胞濃度種至6孔板中。培養(yǎng)12 h后。使用低溫等離子體活化介質(zhì)處理分別真皮間充質(zhì)干細(xì)胞0、10、30 s，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗一遍，加入200 uL TE，輕輕敲打6孔板，放入培養(yǎng)箱中孵育3 min，加入1.8 mL CCM阻斷，做好標(biāo)記，回收至2 mL Tube管中，5 000 rpm·min-1離心3 min，棄去上清液。加入1 mL PBS進(jìn)行重懸，5 000 rpm·min-1離心3 min，再次加入1 mL PBS進(jìn)行重懸，每個(gè)離心管中加入1 uL 5umol·mL-1DCFH-DA染液（空白對(duì)照組不加入任何染料），二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育15 min。用1 mL PBS清洗去除殘留DCFH-DA染液，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平。結(jié)束后，拷貝數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量

利用低溫等離子體活化介質(zhì)分別處理DMSCs細(xì)胞0、10、30 s，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，回收細(xì)胞球進(jìn)行離心，棄去上清后PBS溶液進(jìn)行重懸，再次離心后棄去上清，液氮速凍后，放至-80℃超低溫冰箱中冷凍備用。

將冷凍的樣品取出（在冰上操作），向每管中加入50 uL細(xì)胞裂解液，將底部細(xì)胞吹打均勻，每間隔5 min對(duì)裝有樣品的Tube管進(jìn)行漩渦震蕩，在震蕩6次后，在4℃環(huán)境下12 000 rpm·min-1離心30 min。在離心結(jié)束后，回收每管中的上清液到新的1.5 mL Tube管中并做好標(biāo)記。配置蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)稀釋液（800 uL無(wú)菌去離子水、200 uL考馬斯亮藍(lán)溶液），并每組蛋白質(zhì)樣品加1 uL至稀釋液中。檢測(cè)在595 nm紫外分光光度計(jì)處的吸光值，通過(guò)該機(jī)器的吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，配置蛋白質(zhì)含量/體積為20 ug·15 uL-1，同時(shí)依據(jù)樣品總體積的1/5加入5×SDS上樣緩沖液，補(bǔ)充一定體積的蒸餾水至每組樣品體積相同，進(jìn)行震蕩混勻。在煮沸5 min后立即置于冰上冷卻待用。

首先對(duì)凝膠需要的玻璃板和陶瓷板進(jìn)行清洗，并安裝在其配套的模具中進(jìn)行夾板操作并加入蒸餾水對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)漏操作，確保其密封程度后，加入剛配置好的12%濃度的分離膠（已確保在旋渦振蕩器上進(jìn)行震蕩均勻）每板6 mL，并在板中上方的空余位置緩慢加入蒸餾水，確保膠面水平。靜置40 min左右（確保分離膠完全凝固）后，倒去上層蒸餾水，并插入相對(duì)應(yīng)的梳子。在梳子和玻璃板的空隙處加入剛剛配置好的5%濃度的濃縮膠后，將梳子下壓至梳子上端和玻璃板上端水平即可，靜置20 min左右（確保濃縮膠完全凝固）。拔出梳子，并將固定的模具打開(kāi)取出膠板，清洗后將膠板固定在電泳槽中，向每組電泳槽中加入200 mL電泳液后，準(zhǔn)備進(jìn)行點(diǎn)樣操作。首先向第一個(gè)孔內(nèi)加入蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染Marker 5 μL，再向后續(xù)的孔中分別加入目的蛋白樣品（點(diǎn)樣過(guò)程盡量勻速而緩慢，從而避免樣品彌散或產(chǎn)生氣泡）。在加樣完畢后，接通電泳槽電源（保持電壓在140 V下進(jìn)行電泳），在發(fā)現(xiàn)樣品處于距離膠板下端0.5 cm時(shí)即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜需要準(zhǔn)備濾紙和NC膜，取下膠板，用清水進(jìn)行輕輕沖洗后取出中間的膠。以三明治結(jié)構(gòu)（濾紙、硝酸纖維素膜、膠、濾紙）夾在夾子中，裝入轉(zhuǎn)膜桶。連接好電源，放入4℃冰箱中，在130 mA的電流下轉(zhuǎn)膜6 h。轉(zhuǎn)膜完成取出已經(jīng)轉(zhuǎn)上蛋白質(zhì)的NC膜，并把膜放入0.1%的麗春紅染液中預(yù)染3 min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需的位置進(jìn)行剪裁，利用TBST溶液5 min·次-1清洗3次，洗凈麗春紅染液在膜上的殘留。配制適當(dāng)體積5%的脫脂奶粉，洗膜盒中加入5%的脫脂奶粉進(jìn)行封閉，放到搖床進(jìn)行低速搖晃，孵育1 h。將脫脂乳棄去后，再利用TBST進(jìn)行洗膜，每次5 min一共清洗5遍，最后一遍時(shí)棄去TBST加入相應(yīng)一抗并做好對(duì)應(yīng)標(biāo)記，放在搖床上，4℃孵育12 h。一抗孵育結(jié)束后棄去一抗，用TBST進(jìn)行洗膜5遍，每遍5 min。最后一遍時(shí)棄去TBST加入5 mL的5%的脫脂奶粉，置于搖床上封閉10 min后，向脫脂奶粉中加入相對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后去掉脫脂奶粉，利用TBST進(jìn)行洗膜，每次5 min，一共洗5遍。并配制ECL超敏發(fā)光化學(xué)底物（A液與B液1∶1混合后震蕩混勻，按照每張膜200 μl的體積進(jìn)行配置），避光保存。利用美國(guó)GEAI 600超敏多功能成像儀，進(jìn)行顯影曝光，保存數(shù)據(jù)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)均以′x±s表示，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每組試驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞（DMSCs）的分離培養(yǎng)及鑒定

根據(jù)2006年間充質(zhì)組織干細(xì)胞委員會(huì)規(guī)定的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，所提取的細(xì)胞不表達(dá)CD34，CD45，CD14，但所提取的細(xì)胞CD44，CD106強(qiáng)烈表達(dá)（圖1A）。同時(shí)為了鑒定所提取的細(xì)胞是否具有分化能力，采用成脂分化及成骨分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，油紅O和茜素紅染色結(jié)果表明，所提取的細(xì)胞可以定向分化為脂肪細(xì)胞（圖1B）及骨細(xì)胞（圖1C），證明所提取的細(xì)胞具有分化潛能。結(jié)合以上結(jié)果表明提取的細(xì)胞為純度較高的真皮間充質(zhì)干細(xì)胞，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定Fig.1 Isolation，culture and identification of DMSCs

2.2 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM誘導(dǎo)DMSCs細(xì)胞凋亡

為了探究低溫等離子體照射對(duì)DMSCs的影響，采用NTAPP射流裝置如圖A所示，處理?xiàng)l件為放電電壓16 kV，高純氬氣流量1 L·min-1，培養(yǎng)基液面與NTAPP管口距離1.3 cm。試驗(yàn)將裝有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿放置在NTAPP射流下方分別處理10、30，處理后的培養(yǎng)基即為PAM，使用PAM培養(yǎng)DMSCs，12 h后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（圖2B、C），結(jié)果表明，與未處理組相比，PAM處理10、30 s后，DMSCs細(xì)胞凋亡明顯升高。圖D是圖C的定量分析。

圖2 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM誘導(dǎo)DMSCs細(xì)胞凋亡Fig.2 PAM induced apoptosis of DMSCs

2.3 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM可以增加DMSCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平

眾所周知，活性氧（ROS）是體外NTAPP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的主要參與者，為了確定PAM是否是通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的。通過(guò)不同時(shí)間的PAM（0、10、30 s）處理DMSCs細(xì)胞24 h，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS表達(dá)水平，利用DCFH-DA單染檢測(cè)DMSCs細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平（圖3A、B）。結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，DCFH-DA發(fā)出的綠色熒光強(qiáng)度顯著增加這證明了細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加。圖C是圖B的定量分析。

圖3 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM可以增加DMSCs細(xì)胞內(nèi)ROS水平Fig.3 PAM increased the ROS level in DMSCs

2.4 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM處理DMSCs后凋亡蛋白和抗氧化蛋白的表達(dá)情況

為了進(jìn)一步證明PAM誘導(dǎo)DMSCs發(fā)生凋亡，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同時(shí)間（0、10、30 s）PAM處理DMSCs細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl2表達(dá)水平（圖4A）。結(jié)果表明，與未處理組相比，PAM處理后Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)伴隨著抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)水平明顯下降。進(jìn)一步通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)不同時(shí)間（0、10、30 s）PAM處理DMSCs細(xì)胞抗氧化相關(guān)蛋白Prx I、Prx V、GPX表達(dá)水平，結(jié)果表明，與未處理組相比，PAM處理后Prx I、Prx V、GPX表達(dá)水平明顯升高（圖4A）。圖B是圖A的定量分析。

圖4 低溫等離子體活化介質(zhì)PAM處理DMSCs后凋亡蛋白和抗氧化蛋白的表達(dá)情況Fig.4 Expression of apoptotic proteins and antioxidant proteins after PAM treatment of DMSCs

3 討論

近年來(lái)，人們對(duì)NTAPP的臨床應(yīng)用進(jìn)行了研究，特別是在癌癥治療和滅菌方面[16]。雖然已知NTAPP可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡，但其抗腫瘤作用的分子機(jī)制仍不明確。NTAPP引起NTAPP源性ROS增高而致細(xì)胞損傷是目前關(guān)注的焦點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)被ROS過(guò)度消耗導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)失衡是細(xì)胞損傷的主要原因，且ROS導(dǎo)致DNA和線粒體損傷[17-21]，也有研究顯示，NTAPP在保持脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞ASCs干細(xì)胞特性的同時(shí)，可以促進(jìn)ASCs的增殖。且NTAPP生成的一氧化氮（NO）通過(guò)激活A(yù)kt和ERK1/2通路在NTAPP誘導(dǎo)的ASCs增殖增加中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[22]?？梢?jiàn)，NTAPP對(duì)細(xì)胞的作用是一種多因素的綜合效應(yīng)。

在研究中，使用了一種氬氣介質(zhì)放電型NTAPP裝置，采用PAM間接處理DMSCs，探究PAM對(duì)DMSCs活性的影響，研究結(jié)果顯示，一定劑量的PAM可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)DMSCs發(fā)生凋亡，并且發(fā)現(xiàn)在這過(guò)程中抗氧化酶Prx I、Prx V、GPX表達(dá)水平明顯升高，在之前的研究中，沉默Prx V基因能夠促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的HepG2凋亡[23]，此外，Prx I敲除通過(guò)ROS-p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)皮膚腫瘤模型中角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡[24]，可見(jiàn)抗氧化蛋白在PAM誘導(dǎo)的DMSCs細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，試驗(yàn)初步證明了PAM可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)DMSCs發(fā)生凋亡，為今后篩選PAM誘導(dǎo)DMSCs增殖的最佳條件提供前期結(jié)果，也為臨床干細(xì)胞移植治療阿爾茲海默癥、糖尿病、急性肺損傷等疾病提供基礎(chǔ)理論。