劉思雯，萬軒辰，徐建芳，于浪潮，韋春波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院/黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319）

防風(fēng)[Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk]是傘形科植物，防風(fēng)的未抽花干燥根，其味辛、甘、微溫，可祛風(fēng)解表，止痛止痙[1-2]。防風(fēng)作為一種傳統(tǒng)的中草藥，含有多糖、色原酮、香豆素等多類活性物質(zhì)，廣泛分布于中國的北部和東北部地區(qū)，并在安徽、山西和甘肅等其他地區(qū)有較大面積栽培，常被用以治療頭痛、中風(fēng)、過敏性鼻炎等臨床癥狀[3-4]?，F(xiàn)代研究表明，防風(fēng)中多糖類成分可有效提高免疫力，具有抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗氧化性等多種理化活性作用，具有廣闊的開發(fā)前景[5-6]。由于多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)較為獨(dú)特，使得防風(fēng)中的多糖類成分難以提取及分離。因此，多糖提取技術(shù)的研究對防風(fēng)藥材資源的開發(fā)利用具有重要意義[7-8]。

防風(fēng)多糖作為一種天然聚合物，在防風(fēng)植物細(xì)胞壁中普遍存在。由于我國嚴(yán)禁在動物體內(nèi)使用抗生素類產(chǎn)品，因此找到和抗生素同等功效的替代品成了當(dāng)下畜牧產(chǎn)業(yè)的熱度之一。在對抗生素替代品的研究過程中，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)證明，防風(fēng)多糖作為一種天然的免疫活性物質(zhì)，有著多種生物學(xué)特性，用在飼料中同樣可提高畜禽的免疫力，因此完全有可能替代抗生素在飼料中的作用[9]。根據(jù)前人大量研究表明，防風(fēng)中的有效成分：防風(fēng)多糖，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，對動物體進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，從而達(dá)到增強(qiáng)自身免疫作用的效果[10]。在小鼠的異種移植模型中，DING J X研究了防風(fēng)多糖對U937、MCF-7以及MDA-MB-231腫瘤生長的影響，其結(jié)果顯示多糖可以促進(jìn)U937生長，并間接抑制MDA-MB-231來源SCID小鼠的腫瘤生長，但體外對MCF-7和MDAMB-231無明顯的抑制作用，據(jù)此推斷防風(fēng)多糖是一種可針對乳腺癌的抗癌藥物[11]。

防風(fēng)中多糖的提取工藝較多，囊括水蒸氣蒸餾法，回流提取法，超聲提取以及微波輔助提取法等。其中，水蒸氣法及回流提取法操作較為簡單方便被廣泛使用，但也存在著提取效率低下、耗時(shí)長等缺點(diǎn)。而更現(xiàn)代化的一些提取工藝，提取效率高，耗時(shí)短，但因其費(fèi)用較大導(dǎo)致并未投入大規(guī)模的生產(chǎn)中，沒有被廣泛使用[12]。目前國內(nèi)外關(guān)于防風(fēng)多糖提取工藝的系統(tǒng)研究較少，傳統(tǒng)方法在提取工藝上略有欠佳，存在耗時(shí)長、提取效率低等亟待解決的瓶頸問題。因此，本研究以黑龍江省關(guān)防風(fēng)為實(shí)驗(yàn)材料，利用響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)優(yōu)化關(guān)防風(fēng)多糖的提取工藝，采用超聲輔助水提醇沉法優(yōu)化篩選最佳提取工藝參數(shù)，為未來防風(fēng)多糖的提取利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備

試驗(yàn)材料：黑龍江省關(guān)防風(fēng)；葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)品）；苯酚（分析純）；濃硫酸（分析純）。

試驗(yàn)主要設(shè)備見表1。

表1 主要儀器Table 1 The main equipment of the experiment

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 關(guān)防風(fēng)多糖的提取方法

試驗(yàn)前先對關(guān)防風(fēng)進(jìn)行清洗，表面無明顯雜質(zhì)后再將洗過的防風(fēng)放入55℃烘箱內(nèi)烘干3 h。烘干后的關(guān)防風(fēng)用植物根莖粉碎機(jī)進(jìn)行打磨粉碎，然后將粉末放入藥典2號篩中備用。

精確稱量關(guān)防風(fēng)粉末5 g（誤差小于0.001），按照液料比例加入一定量的蒸餾水，通過調(diào)整合適的超聲波清洗機(jī)的溫度后，將提取物按照預(yù)定的超聲波溫度和超聲波時(shí)間進(jìn)行提取[13]。超聲結(jié)束后再將提取物轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。將提取物放入50 mL離心管中，隨即進(jìn)行調(diào)平離心，離心轉(zhuǎn)速選擇6 000 r·min-1，離心時(shí)間設(shè)置為10 min，并對離心管上清液進(jìn)行過濾棄渣，過濾時(shí)將紗布加厚至32層，充分過濾之后將提取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至體積濃縮至50 mL。加入1/4體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉處理，靜置時(shí)間不少于12 h[14]。將醇沉后的上清液丟棄之后繼續(xù)進(jìn)行離心。將離心的轉(zhuǎn)速設(shè)置為6 000 r·min-1，離心時(shí)間選擇10 min，離心溫度調(diào)整為25℃，離心結(jié)束后采用55℃烘箱進(jìn)行多次烘干處理達(dá)到恒重，從而得到關(guān)防風(fēng)粗多糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

為明確不同液料比、超聲溫度和超聲時(shí)間對關(guān)防風(fēng)多糖提取率的影響情況，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行研究，每個(gè)因素設(shè)置五個(gè)水平，每個(gè)水平重復(fù)試驗(yàn)3次。試驗(yàn)全程控制變量，來探究單個(gè)因素對關(guān)防風(fēng)多糖提取率的影響。其默認(rèn)提取參數(shù)為液料比40∶1、超聲溫度60℃、超聲時(shí)間40 min。具體因素及水平選取情況見表2所示。

表2 單因素水平表Table 2 Level table of single factor

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，比較各水平提取率的大小關(guān)系。選定各因素中多糖提取率最大的水平進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。其中每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，響應(yīng)面優(yōu)化因素水平編碼表見表3所示。根據(jù)表3編碼情況，使用Design Expert 12中Box-Behnken法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化[15]。

表3 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平編碼表Table 3 Response surface optimization factor level coding table

1.2.4 關(guān)防風(fēng)多糖提取率的測定

由于防風(fēng)粗多糖中含有較多雜質(zhì)，采用苯酚-硫酸法測定關(guān)防風(fēng)粗多糖的含量，并構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算防風(fēng)多糖的提取率[16]。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

精確稱取10 mg無水葡萄糖，精確定容至100 mL，搖勻后備用。

準(zhǔn) 確 量 取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其分別置于10 mL的具塞試管中，各加入蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，再加入6%的苯酚試樣0.5 mL，濃硫酸5.0 mL，充分搖勻后靜置冷卻至室溫[17]。在最大吸收波長490 nm波長下進(jìn)行各溶液吸光度的測定[18]。橫坐標(biāo)為葡萄糖的濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），再將數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下：

圖1 總糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of total sugar

（2）計(jì)算提取率

精確稱取關(guān)防風(fēng)粗多糖10 mg于100 mL容量瓶中，定容后從容量瓶內(nèi)準(zhǔn)確吸取1 mL溶液加入具塞試管中，向其依次加入6%的苯酚溶液0.5 mL和濃硫酸5.0 mL，搖勻后冷卻至室溫，測定490 nm波長下的吸光度。按照公式（2）計(jì)算關(guān)防風(fēng)中多糖的含量：

式中Mp為多糖含量，單位g；Me為粗多糖含量，單位g；Mcv為100 mL定容多糖用量，單位mg；Ms為取樣的防風(fēng)重量，單位g；A表示吸光度，a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對關(guān)防風(fēng)多糖的提取率的影響

固定超聲溫度為60℃和超聲時(shí)間40 min下，液料比對關(guān)防風(fēng)多糖提取率的影響如圖2所示。

由圖2可以看出，關(guān)防風(fēng)中多糖的提取率會根據(jù)溶劑量的加大而產(chǎn)生明顯的提高，在液料比不斷增大的情況下，液料比在40∶1時(shí)關(guān)防風(fēng)多糖的提取率在1.045%達(dá)到最大，隨后出現(xiàn)回落。原因可能是在溫度的不斷升高的情況下多糖會產(chǎn)生不耐受現(xiàn)象，進(jìn)而影響對關(guān)防風(fēng)多糖的提取。

圖2 液料比對關(guān)防風(fēng)多糖提取率的影響Fig.2 Effects of different liquid solid ratio on extraction rate of SDP

2.1.2 超聲溫度對關(guān)防風(fēng)多糖的提取率的影響

在固定液料比40∶1和超聲溫度60℃下，超聲溫度對多糖提取率的影響如圖3所示，從圖中可以看出，在超聲溫度不斷升高的情況下，關(guān)防風(fēng)多糖的提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，但是防風(fēng)多糖提取率在各組之間并未存在顯著差異。其中超聲溫度為60℃下關(guān)防風(fēng)多糖的提取率最高為0.907%。

圖3 超聲溫度對防風(fēng)多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on extraction rate of SDP

2.1.3 超聲時(shí)間對關(guān)防風(fēng)多糖提取率的影響

固定液料比40∶1和超聲溫度60℃下，超聲時(shí)間對黑龍江關(guān)防風(fēng)多糖的提取率影響如圖4所示。

圖4 超聲時(shí)間對防風(fēng)多糖提取率的影響Fig.4 Effects of different ultrasonic time on extraction rate of SDP

在超聲時(shí)間的不斷延長的情況下，關(guān)防風(fēng)多糖的提取率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并且超聲時(shí)間在60 min和70 min組的提取率明顯高于其他組。當(dāng)超聲時(shí)間為60 min時(shí)，提取率最高為0.7699%。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化關(guān)防風(fēng)多糖提取工藝參數(shù)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過軟件設(shè)計(jì)并開展了以提取率（Y）為考察指標(biāo)，以液料比（A）、超聲溫為自變量的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 4 Design scheme and results of response surface test

通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立提取率（Y）與液料比（A）、超聲溫度（B）超聲時(shí)間（C）之間的二次多項(xiàng)式：Y=1.03+0.02334-0.0202B-0.0129C-0.0008AB+0.0166AC-0.0386BC-0.1475A2-0.1683B2-0.0405C2

通過對響應(yīng)面模型進(jìn)行方差分析，具體結(jié)果見表5，可知多項(xiàng)式模型中F＝31.06（P＜0.01），說明了不同因素與響應(yīng)值之間存在非常明顯的線性關(guān)系，顯著度較高。失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05），說明該模型通過失擬檢驗(yàn)，擬合程度較好可以用于后續(xù)最佳提取參數(shù)的預(yù)測。其中，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9756，矯正系數(shù)為0.9442，即該模型的擬合程度較好。

表5 關(guān)防風(fēng)多糖提取工藝響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 5 ANOVA of response surface regression model for extraction of SDP

由圖5所示，響應(yīng)面圖像開口均向下，表明該模型有中心最高點(diǎn)，這與試驗(yàn)結(jié)果一致。通過對響應(yīng)面模型中鋒面的陡峭程度以及對等高線的形狀進(jìn)行判斷，各因素之間交互作用的強(qiáng)弱可以被看出，其中因素AB、AC等高線接近于圓形，表明交互作用較弱，與方差分析結(jié)果吻合（P>0.05）。

圖5 響應(yīng)面交互作用圖及等高線圖Fig.5 Response surface interaction diagram and contour map

2.2.2 優(yōu)化提取參數(shù)

采用Design-Expert 12.0軟件，按照表6設(shè)置參數(shù)限制并求出關(guān)防風(fēng)多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)。得出最優(yōu)工藝條件為：液料比40.7∶1、超聲溫度59.539℃、超聲時(shí)間58.780 min。在優(yōu)化后的提取條件下，提取率達(dá)到了1.036%，置信度為96.1%。因此，在實(shí)際操作下選取液料比41∶1、超聲溫度為60℃、超聲時(shí)間59 min作為最優(yōu)提取參數(shù)。

表6 參數(shù)優(yōu)化限制Table 6 Parameter optimization limitation

3 討論

通過比較不同比例、超聲溫度和超聲時(shí)間對關(guān)防風(fēng)提取率影響的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)防風(fēng)中多糖的提取率會根據(jù)溶劑量的加大而產(chǎn)生明顯的提高，由圖2可以看出液料比例在40∶1時(shí)多糖的提取率達(dá)到峰值，隨后又逐漸降低。通過分析可知溶劑中蒸餾水所占比例偏高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流出，進(jìn)而提取率出現(xiàn)回落。而溫度達(dá)到50℃后隨著溫度的增高，多糖提取率不增加，很有可能是溫度過高破壞了多糖的活性，使多糖出現(xiàn)分解[19]。由于影響超聲提取的因素較多，因此在試驗(yàn)過程中操作要精確，超聲提取時(shí)溫度不可過高[20]。同時(shí)，通過查閱大量資料表明，由于防風(fēng)的品種及產(chǎn)地不同可導(dǎo)致最佳提取參數(shù)出現(xiàn)差異性，試驗(yàn)以關(guān)防風(fēng)為實(shí)驗(yàn)材料，采用響應(yīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定出最優(yōu)工藝參數(shù)，為防風(fēng)多糖的高效提取奠定了科學(xué)理論依據(jù)。

4 結(jié)論

基于單因素試驗(yàn)的結(jié)果，將響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)與黑龍江關(guān)防風(fēng)多糖的提取試驗(yàn)相結(jié)合，建立了其數(shù)學(xué)模型，該模型為二次多項(xiàng)式，且擬合程度較好。根據(jù)模型可以看出，在三個(gè)不同因素中，液料比對關(guān)防風(fēng)多糖的提取率有著影響效果最明顯，其次是超聲時(shí)溫度，而超聲時(shí)間不同對提取率的影響不大。經(jīng)過優(yōu)化后關(guān)防風(fēng)多糖的最佳工藝參數(shù)為液料比41∶1、超聲溫度為60℃、超聲時(shí)間59 min。在此條件下得到關(guān)防風(fēng)多糖的提取率為1.036%，置信度為96.1%,證明該模型有較高的可信度。該試驗(yàn)為今后進(jìn)一步研究防風(fēng)多糖的抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效提供了前期基礎(chǔ)。