高穎，張弘弢，陳媛媛

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

黃曲霉毒素（aflatoxin，簡(jiǎn)稱AF）是主要由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種二氫呋喃香豆素的化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，具有高致癌性。黃曲霉毒素耐熱性強(qiáng)，在光、熱等條件下以及酸、中性溶液中都較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸溶液中或氧化劑存在時(shí)少部分可發(fā)生分解[1]。目前，已分離鑒定出黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2等20余種[2]。其中，黃曲霉毒素B1（AFB1）最為常見(jiàn)且毒性最強(qiáng)，它的毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。由于產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌在自然界中廣泛存在，因而土壤、食品、飼料等受到污染的情況極為普遍[3-4]。

目前，傳統(tǒng)的霉菌毒素脫毒方法主要包括物理法和化學(xué)法[5-7]。然而，這些方法在實(shí)際生產(chǎn)運(yùn)用中存在諸多缺陷，如脫毒效率低下、易降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、毒素二次污染、影響飼料適口性等；同時(shí)由于部分脫毒工藝昂貴，難以規(guī)?；慨a(chǎn)，難以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)[8-9]。因此控制霉菌毒素的污染急需一種高效率、特異性強(qiáng)以及對(duì)飼料和環(huán)境沒(méi)有污染的技術(shù)。

近年來(lái)，利用微生物降解法去除AFB1已經(jīng)成為較為安全有效的新方法，也是去除AFB1的新研究方向之一。微生物降解法不但處理?xiàng)l件溫和，不會(huì)破壞產(chǎn)品品質(zhì)，而且有些還能增加產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究從小鼠糞便中初篩分離到15株能夠在初篩培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好的菌株，經(jīng)復(fù)篩從中篩選到一株能夠高效降解AFB1的菌株SM2，并對(duì)菌株SM2培養(yǎng)物的不同組分進(jìn)行脫毒活性研究表明，不同組分對(duì)AFB1的降解率不同。上清液的脫毒能力最強(qiáng)，活菌體懸液脫毒能力下降明顯，滅活菌體懸液脫毒能力最差，細(xì)菌培養(yǎng)上清液的脫毒效果與發(fā)酵液基本相同，無(wú)顯著差異，由此確定枯草芽胞桿菌SM2的脫毒能力主要來(lái)源于上清液中的某種活性物質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果可為在實(shí)踐中使用枯草芽孢桿菌解決AFB1污染問(wèn)題提供理論依據(jù)，同時(shí)為后續(xù)微生物脫毒制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株來(lái)源

從哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康小鼠糞便分離獲得。

1.2 試驗(yàn)試劑

普通營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；Ex Taq DNA聚合酶、Ex Taq Buffer、DNA Marker（2 000）、6×Loading Buffer、d NTP Mixture、溴化乙錠（EB）、瓊脂糖，購(gòu)自TaKaRa公司；引物，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；增強(qiáng)革蘭氏染色液，購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；糖類(lèi)生化反應(yīng)管，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；AFB1標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自SIGMA公司；AFB1 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司。

1.3 主要儀器

臺(tái)式低速離心機(jī)（L3-5K）購(gòu)自湖南可成儀器設(shè)備有限公司；高速臺(tái)式離心機(jī)（1-14K型）購(gòu)自SIGMA有限公司；PCR儀，電泳儀，電泳槽，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)BIO-BAD；電熱恒溫水浴鍋（Hws24）購(gòu)自上海一恒儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272）購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

初篩：適量采取健康小鼠的新鮮糞便，用生理鹽水稀釋至不同的濃度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），取10-4、10-5和10-6三個(gè)濃度在平板上均勻涂布，以香豆素為唯一碳源，置于37℃常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組三個(gè)重復(fù)。每隔12 h進(jìn)行挑菌操作，挑取生長(zhǎng)較好的菌落，再于LB固體培養(yǎng)基上劃線分離3次，重復(fù)此步驟4~5次，直至平皿中菌落完全相同，沒(méi)有雜菌。

2.2 降解AFB1菌株的分離與篩選

復(fù)篩：挑取初篩得到的純種菌株接種于100 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～36 h。將上述菌液按照4%比例接入100 mL新的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72 h。向無(wú)菌EP管中加入菌株發(fā)酵液和AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液（1 000 ng·mL-1），使AFB1終濃度為100 μg·mL-1，同時(shí)以無(wú)菌LB培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，37℃溫箱內(nèi)振蕩作用72 h，每組處理做3個(gè)平行，重復(fù)3次。作用結(jié)束后，按照AFB1 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)每組AFB1含量，選取AFB1降解率最高的菌株作為目標(biāo)菌株。AFB1降解率按照以下公式計(jì)算：AFB1降解率（%）=（1－試驗(yàn)組AFB1含量／空白組AFB1含量）×100。

2.3 AFB1降解率最高菌株的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將復(fù)篩得到的AFB1降解率最高的菌株劃線接種于MRS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落形態(tài)，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

2.3.2 生理生化鑒定

將分離純化的AFB1降解率最高的菌株接種到七葉苷、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、蔗糖、菊糖、乳糖、硝酸鹽還原、硫化氫、脲酶等生化特性培養(yǎng)基中，觀察結(jié)果。鑒定方法主要參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[10]和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[11]。

2.3.3 溫度特性

根據(jù)ELISA試驗(yàn)結(jié)果，從分離的15株菌中挑出1株能夠高效降解AFB1的菌株進(jìn)行生化特性分析。從該菌株培養(yǎng)液中抽取20 μL菌液于980 μL LB液體培養(yǎng)基中，以LB液體培養(yǎng)基為對(duì)照，置于搖床內(nèi)150 r·min-1，分別在32、34、36、37、38、40℃下培養(yǎng)24 h，每個(gè)溫度做三個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm處吸光度值，以溫度（℃）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制溫度曲線。

2.3.4 耐酸堿特性

同1.2.3.3接菌方法，在pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的LB培養(yǎng)基中接菌，每個(gè)酸堿度做三個(gè)重復(fù)，置于搖床內(nèi)150 r·min-1，培養(yǎng)24 h，測(cè)定600 nm處OD（吸光度）值。以pH值為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制耐酸耐堿特性曲線。

2.3.5 耐膽鹽特性

將接種菌液的無(wú)膽鹽LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，膽鹽濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%為試驗(yàn)組，每個(gè)膽鹽濃度三個(gè)重復(fù)。置于搖床內(nèi)150 r·min-1，37℃，培養(yǎng)24 h后，測(cè)定600 nm處吸光度值，并以膽鹽濃度作為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)液吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線。

2.3.6 16S rDNA鑒定

（1）提取DNA：按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）說(shuō)明書(shū)操作。（2）PCR擴(kuò)增：采用通用引物，正向引物為27F：5＇－AGAGTTTGATCMTGGCTCAG－3＇，反向引物為1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇[12]。PCR擴(kuò)增體系為25 μL反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。以提取的DNA為模板，按PCR反應(yīng)體系依次加入模板DNA和其他試劑，置于PCR儀中開(kāi)始擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min，4℃保溫[13]。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察結(jié)果。（3）將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)得基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST初步確定屬種，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，最后利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)[14]。

2.4 AFB1降解率最高菌株脫毒活性組分的確定

取2 mL篩選菌株發(fā)酵液置于無(wú)菌EP管中，4℃、10 000 r·min－1離心10 min，離心結(jié)束后收集上清液備用。將菌體沉淀使用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次，加入2 mL生理鹽水重懸菌體，制備活菌菌體懸液備用。從上述菌體懸液中吸取1 mL于離心管中，再放入高壓鍋121℃，15 min，制備滅活菌菌體懸液。向發(fā)酵液、上清液、活菌菌體懸液、滅活菌菌體懸液中分別加入終濃度為100 ng·mL－1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同時(shí)以LB培養(yǎng)基加AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為空白對(duì)照，37℃溫箱內(nèi)振蕩作用72 h，每組試驗(yàn)做3個(gè)平行，重復(fù)2次，作用結(jié)束后測(cè)定各組分AFB1降解率。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌株的篩選

經(jīng)過(guò)初篩得到15株能夠在以香豆素為唯一碳源的LB固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好的菌株，以對(duì)AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液的降解率為指標(biāo)對(duì)初篩菌株進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選出1株能夠高效降解AFB1的菌株SM2，其降解率達(dá)到69.2%（表1）。

表1 降解黃曲霉毒素B1菌株的篩選結(jié)果Table 1 Results of the screened aflatoxin B1 degradation strains

3.2 AFB1降解率最高菌株SM2的鑒定

3.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

取培養(yǎng)后的菌株平板觀察，其生長(zhǎng)為灰白色、呈現(xiàn)不透明的圓形菌落，邊緣不規(guī)則，表面有皺襞，菌落中心有乳白色突起，呈山丘狀，且菌落不易挑起（圖1-a）。菌株培養(yǎng)18～24 h時(shí)經(jīng)革蘭氏染色后，在油鏡下觀察可見(jiàn)紫色短桿狀菌體，判定為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖1-b）。

圖1 SM2菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的形態(tài)(a)及革蘭氏染色，1000×（b）Fig.1 Morphology of SM2 strain on MRS agar medium（a）and Gram staining result（b）

3.2.2 生理生化鑒定

SM2菌株生理生化鑒定結(jié)果如表2所示，將該鑒定結(jié)果對(duì)比GB/T26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽胞桿菌的檢測(cè)》，可初步判定該菌株屬于枯草芽胞桿菌。

表2 分離菌株生化特性鑒定Table 2 Biochemical characterization of isolated strains

3.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SM2菌株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小在1500 bp左右，與預(yù)測(cè)基因片段大小相符，試驗(yàn)分離菌株提取DNA滿足測(cè)序要求，結(jié)果如圖2所示。

圖2 SM2菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplification products of SM2 strain

3.2.4 基因序列比對(duì)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，SM2菌株與枯草芽孢桿菌FWJ16X的同源性為100%，確定分離菌株為枯草芽孢桿菌FWJ16X。

3.2.5 溫度特性

如圖3所示，枯草芽孢桿菌FWJ16X在培養(yǎng)溫度為38℃時(shí)，吸光度值達(dá)到最高，即菌群數(shù)量達(dá)到最大。而隨著溫度繼續(xù)升高，菌群數(shù)量開(kāi)始迅速下降，即38℃為枯草芽孢桿菌FWJ16X的最佳生長(zhǎng)溫度。

圖3 枯草芽孢桿菌FWJ16X溫度曲線Fig.3 Temperature curve of Bacillus subtilis FWJ16X

3.2.6 耐酸堿特性

如圖4所示，不同的培養(yǎng)基酸堿度對(duì)枯草芽孢桿菌FWJ16X的生長(zhǎng)影響是不同的。當(dāng)培養(yǎng)基pH值在3.0~7.0之間時(shí)，枯草芽孢桿菌FWJ16X的生長(zhǎng)數(shù)量處于穩(wěn)定上升的狀態(tài)。當(dāng)pH=7.0時(shí)，枯草芽孢桿菌FWJ16X菌群數(shù)量達(dá)到峰值，若培養(yǎng)基pH值繼續(xù)增加，菌群數(shù)量開(kāi)始快速降低，說(shuō)明枯草芽孢桿菌FWJ16X的最佳生長(zhǎng)pH值為7.0。

圖4 枯草芽孢桿菌FWJ16X耐酸堿特性曲線Fig.4 Acid and alkali resistance curve of Bacillus subtilis FWJ16X

3.2.7 耐膽鹽特性

如圖5所示，隨著膽鹽濃度的增加，枯草芽孢桿菌FWJ16X的數(shù)量開(kāi)始下降，當(dāng)膽鹽濃度在1.5%時(shí)，菌群數(shù)量下降較為迅速，繼續(xù)增加膽鹽濃度，菌群數(shù)量繼續(xù)下降。但當(dāng)膽鹽濃度達(dá)到2%時(shí)，菌群數(shù)量依然大于對(duì)照組的50%，說(shuō)明枯草芽孢桿菌FWJ16X具有較強(qiáng)的膽鹽耐受能力。

圖5 枯草芽孢桿菌FWJ16X耐膽鹽曲線Fig.5 Biliary salt tolerance curve of Bacillus subtilis FWJ16X

3.3 脫毒活性組分的定位

對(duì)枯草芽孢桿菌FWJ16X培養(yǎng)物的不同組分進(jìn)行AFB1降解活性測(cè)定。結(jié)果顯示，發(fā)酵液的不同組分均具有一定的黃曲霉毒素B1降解活性（表3）。其中，上清液的脫毒活性顯著高于菌體懸液，上清液對(duì)AFB1的降解率為68.6%，發(fā)酵液、活菌體懸液和滅活菌體懸液對(duì)AFB1的降解率分別為70.8%、30.6%、21.2%。與發(fā)酵液的AFB1降解率70.8%相比，細(xì)菌培養(yǎng)上清液的脫毒效果基本相同，無(wú)顯著差異。

表3 枯草芽孢桿菌FWJ16X降解AFB1脫毒活性成分分析Table 3 Analysis of detoxification active components of Bacillus subtilis for reducing FWJ16X degradation of AFB1

4 討論

由于黃曲霉毒素具有強(qiáng)毒性、高穩(wěn)定性和高致癌性等特點(diǎn)，不僅會(huì)影響糧食及飼料產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也潛在威脅著人類(lèi)和動(dòng)物的健康，因此探索去除黃曲霉毒素的方法具有重要意義。目前，黃曲霉毒素的去除方法主要包括物理法、化學(xué)法和生物法。由于物理法與化學(xué)法的傳統(tǒng)性、局限性以及不穩(wěn)定性，所以解決霉菌毒素污染問(wèn)題主要集中在生物法上。生物法主要利用的是物理吸附結(jié)合毒素（酵母、乳酸菌等）、分泌活性物質(zhì)降解毒素兩個(gè)途徑，并且生物法不但處理?xiàng)l件溫和，不會(huì)破壞產(chǎn)品品質(zhì)，而且有些還能增加產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[15]。

試驗(yàn)研究以香豆素為唯一碳源，從小鼠糞便分離并培養(yǎng)出15株生長(zhǎng)良好的菌株，并以AFB1降解率為指標(biāo)篩選出了一株能夠高效降解AFB1的菌株，其降解率為69.2%，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌FWJ16X。通過(guò)測(cè)定其上清液、發(fā)酵液、活菌體懸液以及滅活菌體懸液，枯草芽孢桿菌FWJ16X去除AFB1的能力主要依靠的是由其菌體細(xì)胞代謝產(chǎn)生并分泌至胞外的某種活性物質(zhì)的生物降解作用，而不是菌體本身的吸附作用，這和張曉靜[19]的研究結(jié)果相一致。

目前國(guó)內(nèi)外的研究多集中在利用微生物分泌活性物質(zhì)降解毒素，因?yàn)槲⑸锏奈锢砦阶饔么嬖谥Y(jié)合可逆不穩(wěn)定，毒素易重新釋放，引起二次污染的問(wèn)題，加之吸附效果受菌、環(huán)境等條件限制，致使菌體吸附不是清除黃曲霉毒素的最佳選擇[16]。Liew等[17]在評(píng)估干酪乳桿菌（Lcs）在不同濃度下結(jié)合黃曲霉毒素B1（AFB1）能力時(shí)，測(cè)定不同Lcs細(xì)胞成分（包括活細(xì)胞、熱處理細(xì)胞和細(xì)胞壁）的AFB1結(jié)合效率。發(fā)現(xiàn)活Lcs細(xì)胞對(duì)AFB1的結(jié)合效率最高(98%)。劉亞楠等[18]為了提高枯草芽孢桿菌Q125（Bacillus subtilis)降解AFB1的能力,對(duì)顯著影響AFB1降解的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，上清液對(duì)AFB1的降解率從69.24%升高至100%，降解效率明顯提高；蛋白酶K和SDS處理分別使AFB1降解率降低了5.05%和36.72%（P<0.05），推測(cè)蛋白或酶可能是菌株Q125培養(yǎng)上清液降解AFB1的活性物質(zhì)成分。段素云等[20]以香豆素為唯一碳源進(jìn)行初篩，通過(guò)測(cè)定對(duì)AFB1的降解能力成功篩選到1株能高效降解AFB1的菌株解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），降解率達(dá)86.1%。通過(guò)測(cè)定解淀粉芽胞桿菌各活性組分對(duì)AFB1的降解能力，確定其脫毒物質(zhì)為一種胞外產(chǎn)物。研究雖然確定了枯草芽孢桿菌FWJ16X降解AFB1的脫毒成分是菌體細(xì)胞代謝產(chǎn)生并分泌至胞外的某種活性物質(zhì)，但是缺乏對(duì)該活性物質(zhì)具體種類(lèi)和特性的了解，因此，在后續(xù)試驗(yàn)中將會(huì)采取加熱、蛋白酶K處理等措施進(jìn)一步分析和研究具體該活性物質(zhì)的種類(lèi)和特性。

5 結(jié)論

研究通過(guò)利用香豆素為唯一碳源，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩過(guò)程，篩選出1株枯草芽孢桿菌FWJ16X具有AFB1去除能力；同時(shí)通過(guò)枯草芽孢桿菌FWJ16X各組分去除AFB1能力的比較，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌FWJ16X去除AFB1的能力主要由菌體代謝產(chǎn)生的某種活性物質(zhì)主導(dǎo)，并提示其是一種胞外物質(zhì)。為后期分離純化該菌株去除AFB1的活性物質(zhì)，研究其作用機(jī)制，以及其在食品、飼料等脫毒上的具體應(yīng)用提供基礎(chǔ)。