謝 哲 李一帆 王小祥 潘 翔 張逸蓮 曹 倩 田浩宇 殷桂草

（揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，揚(yáng)州 225000）

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是指適合腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的特殊內(nèi)在環(huán)境，包括基質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、外泌體等亞細(xì)胞成分以及缺氧等環(huán)境因素［1-4］。

外泌體（exosomes）的直徑一般在30～150 nm［5］，從多泡體（multivesicular body，MVB）釋放到細(xì)胞外環(huán)境后，將內(nèi)容物，如蛋白質(zhì)、RNA、脂類、氨基酸等，遞送到受體細(xì)胞和特定器 官［6-9］。 環(huán) 狀RNA （circular RNA， 簡(jiǎn) 稱circRNAs）是一類曾被認(rèn)為是共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，但現(xiàn)在也有研究表明，circRNAs 在經(jīng)過N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）介導(dǎo)后，可以編碼蛋白質(zhì)［10］。circRNAs 在外泌體中富集且穩(wěn)定表達(dá)，可以抵抗核酸外切酶的降解［11］，且可在體液中檢測(cè)到［12-13］。外泌體來源的circRNAs 調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transformation，EMT）、腫瘤血管生成、化療耐藥等，在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用［14-17］。外泌體circRNAs 與臨床病理特征密切相關(guān)，因此具有臨床診斷意義和治療價(jià)值。

1 外泌體環(huán)狀RNA的分選、釋放及檢測(cè)方法

1.1 外泌體的形成以及外泌體環(huán)狀RNA的分選

外泌體存在于血液、尿液、腹水、唾液、膽汁、腦脊液和其他體液中［18］。外泌體的形成大致分為3個(gè)階段，即起始內(nèi)吞期、MVB 形成期和外泌體分泌期［19］（圖1）。起始內(nèi)吞期：質(zhì)膜內(nèi)陷，經(jīng)內(nèi)吞作用，形成內(nèi)吞室，內(nèi)吞室相互融合形成早期內(nèi)體［20］。MVB 形成期：內(nèi)體膜向內(nèi)體內(nèi)褶返，通過逆出芽方式形成胞內(nèi)囊泡（intraluminal vesicle，ⅠLV）［21］。ⅠLV在內(nèi)體中積累，富含ⅠLV的晚期內(nèi)體為MVB。外泌體分泌期：含有高膽固醇的MVB，其膜表面有溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal membrane-associated protein1，LAMP1）、LAMP2、CD63（即LAMP3）等，可介導(dǎo)其與細(xì)胞質(zhì)膜融合，并向胞外釋放外泌體［22-25］；其余的MVB與溶酶體融合，降解其內(nèi)容物。

研究表明，circRNAs 與細(xì)胞內(nèi)microRNAs（miRNAs）結(jié)合，且外泌體中也富含miRNAs，所以circRNAs 分選進(jìn)入外泌體受到細(xì)胞中相關(guān)miRNAs水平變化的調(diào)控。例如，Li等［12］將miR-7模擬物引入細(xì)胞并測(cè)量其中circRNA CDR1as 的豐度，結(jié)果顯示，外泌體中CDR1as的豐度降低，而細(xì)胞中的CDR1as 豐度輕微增加，說明miRNAs 對(duì)circRNAs分選進(jìn)入外泌體產(chǎn)生了影響。

MVB 上的RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding proteins，RBP）在外泌體分選RNA 中發(fā)揮作用，RBP 可識(shí)別RNA 的特定基序并將其分選裝載入外泌體，同時(shí)保護(hù)它們不被降解。而AGO 蛋白被認(rèn)為是非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）的重要載體，參與ncRNA 包裝入外泌體的過程。蘇素化的蛋白質(zhì)異質(zhì)核核糖核蛋白A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1，hnRNPA2B1）能通過miRNA 上的外泌體基因序列結(jié)合miRNA，控制其在外泌體的裝載，故hnRNPA2B1可能是miRNA分選進(jìn)入外泌體的關(guān)鍵點(diǎn)［26］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，KRAS-MEK-ERK通路促進(jìn)了AGO2 蛋白磷酸化，抑制AGO2 蛋白將miRNAs 分選進(jìn)入外泌體，從而影響miRNA 在外泌體中的分泌［27］。

綜上所述，MVB 上的RBP、AGO 蛋白、hnRNPA2B1 都可能通過調(diào)控miRNAs 分選進(jìn)入外泌體這一過程，進(jìn)而影響circRNAs 分選進(jìn)入外泌體，但circRNAs 分選進(jìn)入外泌體的具體機(jī)制目前仍未研究清楚。

1.2 外泌體環(huán)狀RNA的釋放

細(xì)胞分泌外泌體circRNAs，將其釋放到細(xì)胞外環(huán)境可能與circRNAs 的大小有關(guān)。Preusser等［28］發(fā)現(xiàn)，外泌體優(yōu)先釋放較小的circRNAs，細(xì)胞內(nèi)未分泌出去的circRNAs平均為459 nt，而外泌體釋放的circRNAs平均為435 nt。外泌體的分泌由不同的分子調(diào)節(jié)，一些Rab分子可以促進(jìn)外泌體的分泌，如Rab27［29］、Rab35 和Ral 蛋白［30］。MVB蛋白TSG101 的ⅠSG 修飾（泛素化修飾）可促進(jìn)MVB與溶酶體融合，減少外泌體的分泌［31］。

可溶性NSF 附著蛋白受體 （soluble NSFattachment protein receptor，SNARE）家族是外泌體分泌中另一個(gè)重要的調(diào)節(jié)分子。MVB 膜上的V-SNARE 與細(xì)胞質(zhì)膜上的t-SNARE 結(jié)合，形成穩(wěn)定的SNARE 復(fù)合物［32］，介導(dǎo)MVB 與質(zhì)膜的融合有助于脂質(zhì)雙分子層融合，促進(jìn)外泌體的釋放（圖1）。

Fig.1 Diagram of exosome formation and sorting and release of exosomal circRNAs圖1 外泌體的形成以及外泌體環(huán)狀RNA的分選與釋放示意圖

1.3 外泌體環(huán)狀RNA的檢測(cè)方法

許多常用的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于外泌體circRNAs 的檢測(cè)，主要包括：逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）、微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）、Northern blotting、微陣列（microarrays）、 RNA 測(cè) 序（RNA sequencing）、NanoString Technologies nCounter 等［33］。circRNAs的檢測(cè)方法與上述外泌體circRNAs 的檢測(cè)方法相同。每一項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)見表1。

Table 1 Methods for the detection of exosomal circRNAs表1 外泌體circRNAs的檢測(cè)方法

2 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學(xué)功能

近年來，外泌體circRNAs 在多種疾病當(dāng)中均被廣泛研究［34］。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，外泌體circRNAs 除了能影響腫瘤細(xì)胞的增殖，還可以影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、化療耐藥，但是在其他某些系統(tǒng)中的生物學(xué)功能，如影響腫瘤血管生成，未在泌尿系統(tǒng)腫瘤中體現(xiàn)。

2.1 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細(xì)胞的增殖

外泌體circRNA-FMN2 在前列腺癌（prostatic cancer，PCa）組織中作為miR-1238 的海綿。miR-1238 通過LⅠM 同源盒基因2（LⅠM-homeobox gene 2，LHX2）mRNA 的3'UTR 與LHX2 mRNA結(jié)合，可令LHX2 沉默，降低PC3 細(xì)胞的細(xì)胞增殖。因此，外泌體circRNA-FMN2在PCa組織中通過circRNA-FMN2/miR-1238/LHX2 通路，下調(diào)miR-1238表達(dá)，從而上調(diào)LHX2表達(dá)，促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖［35］。

在膀胱癌組織中，外泌體hsa-circRNA-0137606 和外泌體hsa-circRNA-0000285 表達(dá)均下降，膀胱癌患者血清中的外泌體hsa-circRNA-0000285 表達(dá)也下降。hsa-circRNA-0137606 作為miR-1231 的海綿，可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，其基因敲除促進(jìn)了體外膀胱癌細(xì)胞的增殖［36］。hsa-circRNA-0000285 也可通過調(diào)控miR-124 和miR-558，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖［37］。

2.2 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移

EMT 是一種可逆的去分化過程，是腫瘤轉(zhuǎn)移的中心機(jī)制。在EMT 過程中，上皮細(xì)胞可能通過失去細(xì)胞間的連接細(xì)胞極性，獲得間質(zhì)表型，外泌體circRNAs 通過調(diào)控下游靶點(diǎn)，使上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)量下降，間充質(zhì)標(biāo)記物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)量上調(diào)。Chen等［38］研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌（urothelial carcinoma of bladder，UCB）組織中外泌體circRNA-PRMT5 作為miR-30c 的海綿，調(diào)控SNAⅠL1/E-鈣黏蛋白信號(hào)通路，上調(diào)SNAⅠL1，并下調(diào)E-鈣黏蛋白，促進(jìn)UCB細(xì)胞EMT，促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

外泌體hsa-circRNA-0137606 和外泌體hsacircRNA-0000285 也均可抑制膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［36-37］。

來自前列腺患者血液樣本中的外泌體circRNA-HⅠPK3作為miR-212的海綿，其表達(dá)減少降低了前列腺癌細(xì)胞的生存能力、遷移和侵襲能力。MiR-212 靶向BMⅠ-1，下調(diào)BMⅠ-1 的表達(dá)，miR-212抑制和BMⅠ-1均抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。因此，外泌體circRNA-HⅠPK3 基因敲低可通過調(diào)控miR-212/BMⅠ-1軸抑制前列腺癌進(jìn)展［39］。

2.3 外泌體環(huán)狀RNA調(diào)控腫瘤化療耐藥

外泌體circRNAs 傳遞多重耐藥蛋白至受體細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤的耐藥性形成［5］。Yan 等［40］研究發(fā)現(xiàn)， 在腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC） 中，癌組織中外泌體hsacircRNA-0035483的表達(dá)上調(diào)，其可作為hsa-miR-335的海綿，靶向結(jié)合吉西他濱，上調(diào)CCNB1的表達(dá)，激活腎透明癌細(xì)胞TK10 和UO31 細(xì)胞的自噬，抑制凋亡，增強(qiáng)ccRCC對(duì)吉西他濱的耐藥性。

在PCa 組織細(xì)胞中，Zhang 等［41］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-XⅠAP 表達(dá)上調(diào)，其作為miR-1182的海綿，下調(diào)miR-1182 在PCa 組織中的表達(dá)，miR-1182 上調(diào)下游靶點(diǎn)TPD52 的表達(dá)。TPD52 通過抑制肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/ 腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）介導(dǎo)的自噬增加PCa的多西他賽抗性。

2.4 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤細(xì)胞凋亡

外泌體circRNA-FMN2 敲除導(dǎo)致PC3 細(xì)胞和DU145 細(xì)胞G1 期的停滯，且增加了PC3 細(xì)胞和DU145細(xì)胞的凋亡率；過表達(dá)circRNA-FMN2可降低人前列腺癌細(xì)胞G0/G1期百分率，抑制人前列腺癌細(xì)胞凋亡［35］。因此，circRNA-FMN2 通過促進(jìn)DNA 合成和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程來抑制PCa 細(xì)胞的凋亡。外泌體circRNA-HⅠPK3表達(dá)水平降低不僅降低了PCa細(xì)胞的生存能力、遷移和侵襲能力，而且促進(jìn)了PCa細(xì)胞凋亡［39］。

2.5 外泌體環(huán)狀RNA調(diào)控腫瘤血管生成

腫瘤的進(jìn)展通常伴隨著血管的生長(zhǎng)，血管生成可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖，并形成腫瘤缺氧環(huán)境［42］，加快腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。Xie 等［43］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-SHKBP1 作為miR-582-3p 的海綿，增加HUR 蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)了胃癌的血管生成。但目前尚未發(fā)現(xiàn)外泌體circRNAs 調(diào)控泌尿系統(tǒng)腫瘤血管生成。

2.6 外泌體環(huán)狀RNA影響腫瘤微環(huán)境中CD8+T細(xì)胞的功能

CD8+T 細(xì)胞在介導(dǎo)抗腫瘤免疫中發(fā)揮了重要作用，尤其是當(dāng)CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)到TME中時(shí)，與多種腫瘤，如乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌的良好預(yù)后有關(guān)［44］。Yang 等［45］研究表明，外泌體circRNA-TRPS1（外泌體hsa-circRNA-0085361）在膀胱癌組織中低表達(dá)，通過circTRPS1/miR-141-3p/GLS1 軸調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡，抑制了TME中CD8+ T 細(xì)胞耗用，從而抑制了膀胱癌的惡性表型。

外泌體circRNAs 在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學(xué)功能總結(jié)見表2。

Table 2 Biological functions of exosomal circRNAs in urinary tumors表2 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學(xué)功能

3 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用機(jī)制

與其他很多系統(tǒng)腫瘤一樣，外泌體circRNAs在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮作用的分子機(jī)制，主要是其作為miRNA 海綿，通過調(diào)控下游靶基因，行使其生物學(xué)功能。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，除了作為miRNA 海綿，外泌體circRNAs 還可與蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。此外，外泌體circRNAs 在經(jīng)過m6A 修飾后，可以編碼蛋白質(zhì)［10］，未經(jīng)m6A修飾的circRNAs可導(dǎo)致體內(nèi)抗原特異性T 細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生和腫瘤抑制［46］，但其在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用目前仍未有報(bào)道。

3.1 內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA （competing endogenous RNAs，ceRNA）網(wǎng)絡(luò)機(jī)制

外泌體circRNAs 可以作為miRNA 海綿，阻止miRNA 與下游靶基因的結(jié)合。miR-29a-3p 已被證實(shí)是一種抑制腫瘤的外泌體miRNA［47-48］。與癌旁正常組織比較，miR-29a-3p在組織中表達(dá)較低，而PCa 患者的外泌體circRNA-0044516 水平較健康對(duì)照組升高。外泌體circRNA-0044516作為miR-29a-3p海綿，通過黏附miR-29a-3p，使游離miR-29a-3p的表達(dá)降低，促進(jìn)PCa 的進(jìn)程［49］。外泌體circRNA-0081234 水平在有脊柱轉(zhuǎn)移的PCa 組織中高于無脊柱轉(zhuǎn)移的原發(fā)性PCa 組織。外泌體circRNA-0081234 作為miR-1 的海綿，上調(diào)了MAP3K1水平，促進(jìn)了PCa進(jìn)程。外泌體circRNA-0081234 的損耗在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)［50］。外泌體circRNA-HⅠPK3作為miR-212的海綿，其表達(dá)減少可以降低PCa 細(xì)胞的生存能力、遷移和侵襲能力，并且促進(jìn)PCa細(xì)胞凋亡。MiR-212通過靶向BMⅠ-1，下調(diào)BMⅠ-1的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抑制PCa細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的目的。因此，外泌體circRNA-HⅠPK3基因敲低可通過調(diào)控miR-212/BMⅠ-1軸抑制前列腺癌進(jìn)展［39］。

Xiao 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-400068在RCC 組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與下游靶點(diǎn)miR-210-5p 結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用，上調(diào)下游靶點(diǎn)SOCS1的表達(dá)，促進(jìn)RCC細(xì)胞增殖，抑制RCC細(xì)胞凋亡。外泌體circRNA-400068 通過miR-210-5p/SOCS1 軸調(diào)控RCC 的進(jìn)展，circRNA-400068/miR-210-5p/SOCS1 軸可能成為RCC 治療的候選靶點(diǎn)［51］。

3.2 外泌體環(huán)狀RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合

外泌體circRNAs 可以與功能蛋白質(zhì)結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。在膀胱癌組織中，Su 等［52］發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，外泌體circRNA-ELP3 表達(dá)上升，通過靶向結(jié)合腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4 重組蛋白和性別決定區(qū)Y 框蛋白2，可有效促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)對(duì)順鉑的耐藥性。

4 細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的作用機(jī)制

circRNAs作為miRNA海綿，通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)機(jī)制在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮生物學(xué)作用。如膀胱癌組織中的circRNA-BPTF 作為miR-31-5p 的海綿，阻止了miR-31-5p 與下游靶基因RAB27A 的3'端的相互作用，促進(jìn)了膀胱癌進(jìn)程［53］。

circRNAs 還可以與相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。如雄激素受體（androgen receptor，AR）結(jié)合circRNA-HⅠAT1 啟動(dòng)子上的ARE，在轉(zhuǎn)錄水平上抑制宿主基因HⅠAT1，調(diào)控miR-195-5p/29a-3p/29c-3p 的表達(dá)，從而增強(qiáng)CDC42 mRNA 表達(dá)，促進(jìn)ccRCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［54］。

研究表明，未經(jīng)m6A 修飾的circRNAs 可導(dǎo)致體內(nèi)抗原特異性T 細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生和腫瘤抑制［55］。 m6A 調(diào)控因子類甲基轉(zhuǎn)移酶3/14（methyltransferase-like 3/14，METTL3/14）、質(zhì)量及肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）、YTH 結(jié)構(gòu)域家族3（YTH domain family 3，YTHDF3）和起始因子真核細(xì)胞翻譯起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eⅠF）4G2 參與了m6A 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯［56］。其中，METTL3/14 為甲基轉(zhuǎn)移酶，YTHDF3 與修飾的甲基結(jié)合，eⅠF4G2 與YTHDF3 結(jié)合，穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而行使編碼、翻譯蛋白質(zhì)的功能［46］，F(xiàn)TO 為去甲基化酶，可以抑制m6A 介導(dǎo)的circRNAs 翻譯。但是，泌尿系統(tǒng)腫瘤中尚未有研究報(bào)道m(xù)6A 修飾的circRNAs。

circRNAs 在腫瘤中可作為致癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要作用，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，與腫瘤的診斷、預(yù)后和分期密切相關(guān)。

5 泌尿系統(tǒng)腫瘤中外泌體環(huán)狀RNA與細(xì)胞內(nèi)環(huán)狀RNA的比較

circRNAs 大多穩(wěn)定存在于大多數(shù)細(xì)胞中，調(diào)節(jié)癌癥基因的表達(dá)［57］，而外泌體是部分細(xì)胞（包括癌細(xì)胞）分泌的微小囊泡，屬于細(xì)胞外囊泡的一種，外泌體以及其分泌出的circRNAs 可以傳遞重要的生物學(xué)信息［58］。有研究者通過RNA序列分析表明，外泌體中的circRNAs 比正常細(xì)胞中的circRNAs更豐富［59］，外泌體來源的circRNAs可以分泌到血液中，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的通訊［60］。如前文所述，外泌體circRNAs 通過miRNA 海綿、與蛋白質(zhì)結(jié)合等機(jī)制在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮相應(yīng)的生理作用，這與細(xì)胞內(nèi)circRNAs 類似。由于一般的circRNAs 大多穩(wěn)定存在于細(xì)胞中，其中位于細(xì)胞核內(nèi)的circRNAs 增強(qiáng)親本基因的轉(zhuǎn)錄，如抑制膀胱癌的circRNA-ⅠTCH，作為miR-17/miR-224 的海綿，靶向其親本基因的轉(zhuǎn)錄［61］。因此，一般的circRNAs 對(duì)細(xì)胞核內(nèi)基因的調(diào)控更多，而外泌體circRNAs 對(duì)核外靶基因的調(diào)控更多。在治療方面上，藥物只到達(dá)細(xì)胞核外相較于到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)更容易，所以，這是外泌體circRNAs 作為一個(gè)治療靶點(diǎn)與circRNAs相比有優(yōu)勢(shì)的地方。

6 外泌體環(huán)狀RNA在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的臨床意義

6.1 外泌體環(huán)狀RNA作為泌尿系統(tǒng)腫瘤的生物標(biāo)記物

circRNAs較線性RNA更穩(wěn)定，且在外泌體中，circRNAs 表達(dá)比線性RNA 更豐富［59］；除此之外，外泌體存在于血液、尿液和其他體液中，所以可以將外泌體circRNAs作為生物標(biāo)記物。

前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）是前列腺癌早期診斷的指標(biāo)之一，但其特異度較低，在部分良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）患者中也會(huì)增高［62］。陶文等［63］研究結(jié)果顯示，前列腺癌組患者尿液外泌體circRNA-0040507表達(dá)水平高于BPH組。且當(dāng)尿液外泌體circRNA-0040507診斷前列腺癌的臨界值為4.12 copies/ml 時(shí)，數(shù)值為診斷前列腺癌最佳臨界值。尿液外泌體circRNA-0040507與PSA二者聯(lián)合診斷前列腺癌時(shí)，靈敏度和特異度均高于尿液外泌體circRNA-0040507的單一診斷。表明尿液外泌體circRNA-0040507 可能作為前列腺癌的生物標(biāo)記物。此外，Li等［49］通過研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者血液外泌體中，外泌體circRNA-0044516的表達(dá)明顯上調(diào)，高轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞中的外泌體circRNA-0044516 水平高于低轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞中的外泌體circRNA-0044516水平，表明血液外泌體circRNA-0044516 可能是前列腺癌細(xì)胞診斷和轉(zhuǎn)移潛在的生物標(biāo)記物。Luo 等［64］研究發(fā)現(xiàn)，在PCa發(fā)育過程中，基底細(xì)胞的消失和緊密連接的缺失可能促進(jìn)circAR3從上皮細(xì)胞浸潤(rùn)到氣孔，繞過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血流。此外，激素和化療也會(huì)破壞基質(zhì)結(jié)構(gòu)，這也可能導(dǎo)致外泌體circRNA-AR3 釋放到循環(huán)系統(tǒng)中去。在PCa發(fā)展過程中，從PCa細(xì)胞釋放到血漿中的外泌體circRNA-AR3 增加，因此，血漿外泌體circRNA-AR3 可能是高危原發(fā)性前列腺癌的生物標(biāo)記物。

研究發(fā)現(xiàn)，外泌體hsa-circRNA-0000285 在膀胱癌組織和血清中表達(dá)下調(diào)，與順鉑敏感患者相比， 順鉑耐藥患者的circRNA-0000285 水平下降了2/3；而在順鉑耐受的RT4 細(xì)胞中，hsa-circRNA-0000285 水平低于親代細(xì)胞，因此，血清外泌體hsa-circRNA-0000285 也可作為膀胱癌診斷和化療的生物標(biāo)記物［37］。Yang 等［45］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌術(shù)前及術(shù)后的血液及尿液中分離的外泌體內(nèi)均鑒定到了circRNA-TRPS1 的表達(dá)，術(shù)后血液及尿液中外泌體circRNA-TRPS1 的表達(dá)顯著降低，這提示了膀胱癌患者血液及尿液外泌體中的circTRPS1具有作為生物標(biāo)志物的潛力。

上述作為泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物標(biāo)志物的外泌體circRNAs見表3。

Table 3 Exosomal circRNAs as biomarkers in urinary tumors表3 作為泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物的外泌體circRNAs

6.2 外泌體環(huán)狀RNA用于泌尿系統(tǒng)腫瘤的治療靶點(diǎn)

外泌體本身具有納米級(jí)尺寸、壽命長(zhǎng)以及攜帶能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，而circRNAs 具有良好的穩(wěn)定性、在外泌體中富集的特點(diǎn)。因此，外泌體可作為承載抗腫瘤藥物的天然載體［65］，將抑癌的circRNAs 輸送到靶細(xì)胞進(jìn)行腫瘤治療［26］。一些外泌體circRNAs 在泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因或癌基因的作用，并介導(dǎo)抗癌藥物的作用。當(dāng)外泌體中的circRNAs 作為癌基因的時(shí)候，可以通過敲低其表達(dá)，如輸送對(duì)應(yīng)的si-circRNAs或sh-circRNAs到外泌體中， 再由外泌體分泌si-circRNAs 或sh-circRNAs 到靶細(xì)胞中進(jìn)行抗腫瘤治療；當(dāng)外泌體中的circRNAs 作為抑癌基因的時(shí)候，可以通過過表達(dá)這些circRNAs抑制腫瘤進(jìn)展。

某些外泌體circRNAs 還與泌尿系統(tǒng)腫瘤的耐藥性相關(guān)，過表達(dá)外泌體中抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性的circRNAs，或敲低外泌體中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的circRNAs均可作為新興的治療靶點(diǎn)。

外泌體circRNA-0000285 已被證實(shí)在順鉑耐藥膀胱癌患者中癌組織和血漿的表達(dá)低于順鉑敏感膀胱癌患者［37］，因此，可以通過輸送circRNA-0000285 到血漿外泌體中，使circRNA-0000285 過表達(dá)，將順鉑耐藥膀胱癌轉(zhuǎn)變?yōu)轫樸K敏感膀胱癌，從而更有利于治療。Su等［52］發(fā)現(xiàn)，在缺氧狀態(tài)升高的情況下外泌體circRNA-ELP3 可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥。沉默外泌體circRNA-ELP3 則顯著降低了膀胱癌細(xì)胞的耐藥性，且能將膀胱癌的耐藥性降低到與正常氧條件下測(cè)量到的膀胱癌細(xì)胞耐藥性一樣的水平。因此，沉默外泌體circRNAELP3可作為治療耐順鉑膀胱癌的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

Yan等［40］發(fā)現(xiàn)，外泌體circRNA-0035483在腎癌細(xì)胞TK10中過表達(dá)，通過自噬增強(qiáng)了對(duì)吉西他濱和順鉑類藥物的耐藥性，而外泌體circRNA-0035483 基因敲除則增強(qiáng)了TK10 腎癌細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)吉西他濱的敏感性，成為一個(gè)新的治療腎癌的靶點(diǎn)。

前列腺癌耐多西他賽患者的癌組織中外泌體circRNA-XⅠAP 表達(dá)顯著上調(diào)，Zhang 等［41］敲低了前列腺癌DU145 和PC3 細(xì)胞中的外泌體circRNAXⅠAP 后，兩種原本耐多西他賽的癌細(xì)胞對(duì)多西他賽重新敏感，因而敲低外泌體circRNA-XⅠAP 可以作為耐多西他賽前列腺癌的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

6.3 外泌體環(huán)狀RNA與泌尿系統(tǒng)腫瘤的TNM分期相關(guān)，可用于監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展

外泌體circRNAs 在檢材，如癌組織或者血清中表達(dá)的高低，可以反映出相關(guān)腫瘤的TNM分期，所以外泌體circRNAs 可以在臨床上用來監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展。

Chi 等［37］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者的癌組織和血清中外泌體circRNA-0000285與癌旁組織和健康對(duì)照組相比顯著降低，通過單因素分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體circRNA-0000285 水平與腫瘤大小、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM 分期顯著相關(guān)。當(dāng)腫瘤≥3 cm，分化程度低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N2-4），有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期時(shí)，血清外泌體circRNA-0000285 水平普遍較低。Chen 等［38］報(bào)道，外泌體circRNA-PRMT5 可以輸出到細(xì)胞外微環(huán)境，包括血清和尿液，血清和尿外泌體中高表達(dá)的外泌體circRNA-PRMT5與UCB的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期進(jìn)展呈正相關(guān)，因此外泌體circRNA-PRMT5可用來預(yù)測(cè)UCB 患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展。Su等［52］研究表明，膀胱癌患者的癌組織外泌體circRNA-ELP3水平升高與膀胱癌進(jìn)展顯著相關(guān)，膀胱癌腫瘤分期高于T2 或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，癌組織外泌體circRNA-ELP3 表達(dá)上調(diào)；但高分級(jí)和低分級(jí)膀胱癌的癌組織外泌體circRNA-ELP3 表達(dá)水平之間沒有顯著差異。

Luo 等［64］通過研究表明，前列腺癌組織中的外泌體circRNA-AR3 水平與腫瘤Gleason 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，而血漿中的circRNA-AR3 水平與高Gleason評(píng)分和陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

6.4 外泌體環(huán)狀RNA用于監(jiān)測(cè)泌尿系統(tǒng)腫瘤患者預(yù)后

由于上述臨床意義的存在，檢材中外泌體circRNAs 表達(dá)水平的高低也可以用來表示泌尿系統(tǒng)患者預(yù)后的好壞。

UCB 患者的血清和尿液外泌體circRNAPRMT5 過表達(dá)，且過表達(dá)與患者低生存率呈正相關(guān)，有望成為UCB患者預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)［38］。當(dāng)血清和尿液外泌體circRNA-PRMT5表達(dá)水平下降時(shí)，表明預(yù)后良好。

在前列腺癌患者癌組織中，外泌體circRNAAR3 在良性前列腺和激素初始型前列腺癌中高表達(dá)，但在患者接受新輔助激素治療時(shí)表達(dá)下調(diào)，當(dāng)腫瘤進(jìn)展到去勢(shì)抵抗期時(shí)表達(dá)進(jìn)一步降低［64］。內(nèi)分泌治療是進(jìn)展期前列腺癌的主要治療方法之一。然而，大部分患者在1～3年內(nèi)分泌治療后將逐漸進(jìn)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌［66］，因此當(dāng)患者接受內(nèi)分泌治療1～3年內(nèi)，檢測(cè)到癌組織中外泌體circRNA-AR3表達(dá)下降時(shí)，要警惕前列腺癌轉(zhuǎn)化為去勢(shì)抵抗性前列腺癌，提示預(yù)后較差。

以上功能、機(jī)制和臨床意義顯示，外泌體環(huán)狀RNA 可以影響腫瘤的進(jìn)程，有助于臨床研究、診斷、提供治療靶點(diǎn)以及預(yù)后監(jiān)測(cè)。

7 外泌體環(huán)狀RNA及尿液外泌體在泌尿系統(tǒng)腫瘤診療中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

7.1 尿液外泌體的優(yōu)勢(shì)

尿液外泌體在泌尿系統(tǒng)腫瘤的無創(chuàng)診斷和監(jiān)測(cè)中具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。首先，尿液易于獲取，具有方便、無創(chuàng)、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)。其次，采用尿液外泌體診斷泌尿系統(tǒng)腫瘤的準(zhǔn)確性和敏感性較高。尿液細(xì)胞學(xué)檢查是尿路上皮癌（包括膀胱癌、腎盂癌、輸尿管癌、尿道癌）的主要非侵入性診斷方法之一，但其敏感性較低（7%～17%），對(duì)低級(jí)別尿路上皮癌的診斷準(zhǔn)確性較低［67］。Xu 等［68］對(duì)來自16 篇文章的22 項(xiàng)泌尿系統(tǒng)腫瘤（腎癌、膀胱癌、前列腺癌）研究建立了一項(xiàng)Meta分析，包括3 224例患者和1 360 名健康對(duì)照。結(jié)果顯示，尿液外泌體的診斷泌尿系統(tǒng)腫瘤的準(zhǔn)確性較高，AUC為0.92，敏感性為83%，均優(yōu)于尿液細(xì)胞學(xué)檢查。

尿液中難以捕獲脫落的腫瘤細(xì)胞，但是外泌體從腫瘤細(xì)胞不斷釋放到尿液中，所以尿液中更易檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體。外泌體可以攜帶相應(yīng)腫瘤來源的細(xì)胞抗原，因此診斷特異性較高［69］，外泌體中的核酸內(nèi)容物可直接反映泌尿系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的特征。穩(wěn)定性方面，尿液外泌體長(zhǎng)期儲(chǔ)存或在-80℃條件下均可以保持完整［69］，這表明尿液外泌體穩(wěn)定性較高，可以用來檢測(cè)其內(nèi)容物。

雖然尿液外泌體可作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷的生物標(biāo)志物，但基本都是關(guān)于腎癌、膀胱癌和前列腺癌的研究，對(duì)于輸尿管癌、腎盂癌、附睪癌和睪丸癌等低發(fā)病率泌尿系統(tǒng)腫瘤，目前仍沒有相關(guān)報(bào)道。

7.2 外泌體環(huán)狀RNA的優(yōu)勢(shì)

首先，由于細(xì)胞外囊泡可由多種細(xì)胞分泌，所以外泌體的大小及其內(nèi)容物的異質(zhì)性反映了原始細(xì)胞的狀態(tài)和類型，因此外泌體內(nèi)容物可作為各種疾病診斷或預(yù)后觀察的生物標(biāo)志物［70］。其次，外泌體circRNAs可以被分泌到包括血液、尿液、腹水、唾液、膽汁、腦脊液等多種體液中［18］，比單純的血液標(biāo)本來源更廣。從相應(yīng)體液中提取外泌體，檢測(cè)其分泌的腫瘤特異性circRNAs 可作為一種確定泌尿系統(tǒng)癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的手段。而且外泌體circRNAs 本身在作為腫瘤生物標(biāo)記物、腫瘤進(jìn)程和治療、預(yù)后的研究中越來越受到關(guān)注，成為一個(gè)新興熱點(diǎn)。再者，相比一些線性RNA 如miRNAs，circRNAs 更容易被分選到外泌體中［12］。此外，來自相應(yīng)癌細(xì)胞分泌的外泌體中含有高度特異性的circRNAs，由于有外泌體的保護(hù)，所以外泌體內(nèi)的特異性circRNAs 可以防止其核酸分子被血液中的核糖核酸酶（RNase）降解［71］，由此可見，外泌體中circRNAs 的檢測(cè)可能優(yōu)于血液循環(huán)系統(tǒng)中游離circRNAs的檢測(cè)。不僅如此，相較取材于癌組織，體液標(biāo)本的獲取所致的創(chuàng)口更小，易大量獲得，出血更少，甚至無創(chuàng)，例如尿液。如果能從尿液外泌體中提取到所需檢測(cè)的特異性的circRNAs，則可以無創(chuàng)就能確定對(duì)應(yīng)泌尿系統(tǒng)腫瘤的進(jìn)展，減少對(duì)患者的傷害。

泌尿系統(tǒng)腫瘤直接分泌的外泌體可以釋放到尿液中，所以尿液外泌體對(duì)泌尿系統(tǒng)腫瘤的診斷和判斷預(yù)后有更多的敏感性和特異性［72］。

8 總結(jié)與展望

本文首先介紹了外泌體circRNAs 的分選、釋放、檢測(cè)方法。其次，介紹了其在泌尿系統(tǒng)腫瘤中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制。并將泌尿系統(tǒng)腫瘤中的外泌體circRNAs 與circRNAs 進(jìn)行了比較。最后闡明了外泌體circRNAs 可用于泌尿系統(tǒng)腫瘤的臨床意義以及外泌體circRNAs 的優(yōu)勢(shì)所在，幫助讀者更好地了解外泌體circRNAs 與現(xiàn)流行的腫瘤檢測(cè)方法的異同。

外泌體circRNAs 是目前研究的熱點(diǎn)，但仍有很多問題沒有解決。例如，circRNAs 分選入外泌體的具體機(jī)制并沒有完全研究清楚。在泌尿系統(tǒng)腫瘤中，雖然外泌體circRNAs 的生物學(xué)功能方面已經(jīng)有了一些研究，但是還有一些生物學(xué)功能和作用機(jī)制沒有研究全面。例如，外泌體circRNAs 影響腫瘤血管生成這一生物學(xué)功能在其他一些系統(tǒng)，如消化系統(tǒng)中已有研究，但在泌尿系統(tǒng)中的研究仍未有成果。在分子機(jī)制方面，外泌體circRNAs 可經(jīng)m6A 修飾從而導(dǎo)致某些腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，例如結(jié)直腸癌［46］。但是經(jīng)m6A修飾的外泌體circRNAs與泌尿系統(tǒng)腫瘤的關(guān)系，目前還沒有研究報(bào)道。同時(shí)，大部分研究都僅停留于circRNAs 經(jīng)過m6A 修飾后，對(duì)腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移的影響，并未具體闡明外泌體與circRNAs的關(guān)系。

在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞與相鄰健康細(xì)胞之間的相互干擾至關(guān)重要，而惡性細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體circRNAs 在這一過程中起著非常重要的作用［73-74］。外泌體circRNAs 可以作為泌尿系統(tǒng)腫瘤的生物標(biāo)記物，對(duì)早期的診斷、腫瘤的TNM分期、預(yù)后有著重要意義。

目前外泌體circRNAs 的臨床應(yīng)用仍存在很多問題。外泌體提取與純化的技術(shù)有限，效率不高且缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，甚至缺少有效區(qū)分外泌體和微囊泡的特異性標(biāo)記物和技術(shù)［5］。一些外泌體circRNAs是作為正常RNA 剪接異常的指標(biāo)還是基因過表達(dá)擴(kuò)增的腫瘤指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究。此外，現(xiàn)在仍無法大規(guī)模生產(chǎn)特定供體細(xì)胞的外泌體用于靶向藥物載體。對(duì)于未來的研究方向：首先，需要circRNAs 分選進(jìn)入外泌體的具體機(jī)制，這可以為治療相關(guān)腫瘤提供上游治療靶點(diǎn)；其次，優(yōu)化外泌體的獲取和檢測(cè)方法，能提取更多的外泌體；第三，外泌體分泌circRNAs 可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，所以可以從細(xì)胞間通訊角度入手，闡明與人類癌癥相關(guān)的外泌體circRNAs分子機(jī)制，為泌尿系統(tǒng)腫瘤的診療提供新的線索和方法；最后，將外泌體作為靶向藥物的載體，控制外泌體向靶細(xì)胞分泌治療性circRNAs 也可能成為新的癌癥靶向治療的方法，值得進(jìn)一步研究。