王 鼎， 李福剛， 羅 旺， 陳華劍， 張 珂， 謝國明

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042；2.上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司，上海 201399）

快速、靈敏的病原體核酸檢測(cè)已經(jīng)成為防控公共衛(wèi)生事件的重要方法。從生物樣本中提取高純度的核酸在確保核酸檢測(cè)準(zhǔn)確性中起著極其重要的作用[1]。傳統(tǒng)的核酸提取方法需要復(fù)雜的設(shè)備，操作繁瑣，耗時(shí)長，容易引起交叉污染和核酸樣本損失。微流控技術(shù)具有集成化、自動(dòng)化的特點(diǎn)，其完全密封的流體系統(tǒng)可避免核酸樣本的交叉污染和損失[2]。因此，將微流控技術(shù)應(yīng)用于核酸提取，有助于實(shí)現(xiàn)快速、高效、自動(dòng)化的核酸檢測(cè)，對(duì)于病原體感染的早期診斷和及時(shí)治療具有巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前，微流控核酸提取的主要問題在于傳統(tǒng)的70%乙醇洗滌液存在易揮發(fā)、易燃的缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約了其在微流控領(lǐng)域的應(yīng)用。此外，乙醇?xì)埩魧?duì)后續(xù)的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）等檢測(cè)步驟，尤其是對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增有明顯的抑制作用。有研究結(jié)果顯示，一些無揮發(fā)性的油性物質(zhì)，如硅油、FC-40、長鏈醇類均可作為核酸提取的洗滌液候選物，處理后的核酸回收率較高，且對(duì)后續(xù)的擴(kuò)增抑制作用很小，甚至無抑制作用[3]。另外，油性物質(zhì)還具有儲(chǔ)存條件寬松和儲(chǔ)存期較長的優(yōu)點(diǎn)。為此，本研究擬探討以8種長鏈醇類和油類物質(zhì)作為洗滌液在磁珠法核酸提取中的應(yīng)用價(jià)值，旨在克服微流控技術(shù)在臨床應(yīng)用中的局限性。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

硫氰酸胍、Tris-Base、氯化鈉、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸、二甲基硅油、十一醇、正癸醇、正辛醇、1-壬醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，2-十二烷醇、FC-40購自西寶生物科技（上海）股份有限公司。磁性微球購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司。北京康為世紀(jì)生物科技有限公司MagBead Virus DNA/RNA Kit和北京啟研生物科技有限公司核酸提取/純化試劑盒。PCR master mix、RT-PCR master mix由上海奧普生物醫(yī)藥股份有限公司研發(fā)。PCR引物序列采用肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mp）基因：上游引物MP-F為5'-CAACATCTGGGACTGGACTGTA-3'、下游引物MP-R為5'-GCCCTATGATTTAGAGATTGCGG-3'、探針引物MP-P-FAM/BHQ為5'-CCTTCAGCCCCAAAACCATCACAGG-3'。RT-PCR所用引物序列采用呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）基因：上游引物RSV-F為5'- AACTCTGGGGCAAATAACAA-3'、下游引物RSV-R為5'-GCRTCTGTWCCATTACACTT-3'、探針引物RSV-P-ROX/BHQ為5'-GCAAAGGCTATCTTAGTGCTCT-3'。引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。PCR所用的DNA模板為含引物基因片段的質(zhì)粒，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。RT-PCR所用的RNA模板為轉(zhuǎn)錄RNA，先由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含引物匹配基因片段的質(zhì)粒，在基因序列前加入T7序列，再用HiScribe T7 Quick RNA Synthesis Kit（美國NEB公司）轉(zhuǎn)錄出RNA，并用RNeasy Mini kit（德國Qiagen公司）純化。Mp及培養(yǎng)基均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），嚴(yán)格按菌株說明書進(jìn)行培養(yǎng)。Q5熒光定量PCR儀購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 （1）吸附液：3.6 mol/L硫氰酸胍，10 mmol/L Tris-Base，800 mmol/L氯化鈉，200 mmol/L檸檬酸鈉，pH值5.2。（2）洗脫液：10 mmol/L Tris-Base，1 mmol/L乙二胺四乙酸，pH值8.4。

1.2.2 核酸提取 取200 μL待提取的樣本，加入400 μL核酸提純吸附液，加入1.0 mg磁珠，在旋轉(zhuǎn)儀上以20 r/min搖勻5 min，用磁力架吸附磁珠，吸棄管中的液體；加入800 μL洗滌液，充分混勻后，用磁力架吸附磁珠，吸棄管中的液體；加入200 μL洗脫液，充分混勻后，在旋轉(zhuǎn)儀上以20 r/min搖勻解吸附5 min，用磁力架吸附磁珠，待磁珠全部被吸附后，吸出核酸提取物，作為擴(kuò)增模板。

1.2.3 PCR和RT-PCR （1）反應(yīng)體系：PCR reaction master mix或RT-PCR reaction master mix 5 μL，10 μmol/L引物各1 μL，10 μmol/L探針各0.5 μL，待測(cè)樣本2 μL，用無核酸酶水補(bǔ)至總體積15 μL。（2）PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)。RT-PCR在PCR擴(kuò)增條件前增加60 ℃ 5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 模擬臨床樣本制備 用咽拭子在健康人咽喉部采樣，在保存液中涮洗，取4 mL涮洗液加入100 μL Mp培養(yǎng)物，混勻，制成Mp模擬臨床樣本。95 ℃金屬浴5 min，熱裂解產(chǎn)物等量分裝，測(cè)試不同核酸提取方法的性能，并與商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行比較。

1.2.5 不同洗滌液對(duì)核酸提取的影響 （1）以102～105拷貝/μL的DNA和RNA混合物為待提取樣本，以5種長鏈醇類物質(zhì)（十一醇、正癸醇、正辛醇、1-壬醇、2-十二烷醇）和3種油類物質(zhì)（二甲基硅油、FC-40、石蠟油）為洗滌液，以70%乙醇為陽性對(duì)照，采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，比較8種洗滌液的核酸提取性能。（2）在15 μL反應(yīng)體系中添加3 μL長鏈醇類或油類洗滌液，以3 μL ddH2O為陰性對(duì)照，分析8種洗滌液殘留對(duì)101～103拷貝/μL DNA和RNA模板擴(kuò)增的影響。（3）以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇作為洗滌液，分別與濕式試劑、干式試劑配合使用，對(duì)103拷貝/μL DNA和RNA模板進(jìn)行提取，比較不同試劑狀態(tài)下的核酸提取性能。（4）以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇作為洗滌液，分別采用渦旋混勻、移液槍混勻、顛倒混勻3種混勻方式，比較不同混勻方式下103拷貝/μL DNA和RNA模板的核酸提取性能。（5）分析以二甲基硅油、FC-40和70%乙醇為洗滌液的磁珠法對(duì)Mp模擬臨床樣本中病原體基因組DNA的提取性能，并與商品化核酸提取試劑盒A和試劑盒B進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 8種洗滌液的核酸提取性能

8種洗滌液中，二甲基硅油和FC-40均能成功提取102～105拷貝/μL的DNA和RNA，提取性能與70%乙醇比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。十一醇未能成功提取出102拷貝/μL DNA，其他5種洗滌液在提取102～104拷貝/μL DNA和RNA模板時(shí)均有不同程度的提取失敗。見表1。

表1 8種洗滌液對(duì)102～105拷貝/μL DNA和RNA的提取性能

2.2 8種洗滌液殘留對(duì)核酸擴(kuò)增的影響

8種洗滌液中，二甲基硅油和FC-40殘留均能成功擴(kuò)增DNA和RNA，與陰性對(duì)照ddH2O比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。其他6種洗滌液殘留對(duì)PCR和RT-PCR均有不同程度的抑制作用，尤其是低拷貝數(shù)的DNA和RNA的擴(kuò)增受到顯著抑制。見表2。

表2 8種洗滌液殘留對(duì)核酸擴(kuò)增檢測(cè)的影響

2.3 二甲基硅油和FC-40配合不同狀態(tài)試劑使用時(shí)對(duì)核酸提取性能的影響

以二甲基硅油和FC-40作為洗滌液，無論是配合干式試劑還是濕式試劑，提取103拷貝/μL DNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇洗滌液比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同狀態(tài)試劑結(jié)合油類洗滌液的核酸提取性能

2.4 不同混勻方式對(duì)二甲基硅油和FC-40洗滌液的適用性

無論采用哪種混勻方式，以二甲基硅油、FC-40為洗滌液提取103拷貝/μL DNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

表4 不同混勻方式對(duì)二甲基硅油和FC-40洗滌液的適用性

2.5 二甲基硅油和FC-40洗滌液對(duì)病原體樣本核酸的提取性能

以二甲基硅油和FC-40為洗滌液，提取Mp模擬臨床樣本DNA的Ct值分別為32.34±0.18和31.87±0.03，與以70%乙醇為洗滌液的Ct值（32.28±0.20）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以二甲基硅油和FC-40為洗滌液的磁珠法提取DNA的Ct值低于商品化核酸提取試劑盒B（Ct值為35.48±0.01）（P<0.05）；與商品化核酸提取試劑盒A（Ct值為31.81±0.30）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

感染性疾病的病原體種類多種多樣，準(zhǔn)確、快速的病原體的精準(zhǔn)檢測(cè)已成為疾病診療和防控的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)法周期長，抗體法易受既往感染史影響，而核酸法可規(guī)避上述弊端，能從復(fù)雜的生物樣本中快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出特定病原體的基因組DNA或RNA，敏感性高，特異性好[4]。傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光PCR，操作繁瑣，極易造成交叉污染，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。分子微流控以微管道網(wǎng)絡(luò)為結(jié)構(gòu)特征，可制備成全封閉的、自動(dòng)化的設(shè)備，整合了核酸提取和擴(kuò)增檢測(cè)的全過程，可避免交叉污染，同時(shí)縮短了核酸檢測(cè)的時(shí)間，擴(kuò)大了核酸檢測(cè)的應(yīng)用范圍[5]。

核酸檢測(cè)的性能很大程度上取決于核酸提取步驟。目前，主流的核酸提取方法——磁珠法具有簡便、快速、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)[6]，其使用的洗滌液為70%～80%的乙醇。由于乙醇易揮發(fā)、易燃，整合在微流控板卡中運(yùn)輸和儲(chǔ)存時(shí)存在一定的安全隱患；乙醇濃度降低還會(huì)導(dǎo)致核酸從磁珠上解吸附，造成核酸量的損失。此外，微流控產(chǎn)品具有體積小、重量輕、可常溫儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，各反應(yīng)試劑需盡可能地制備成凍干品，以便常溫運(yùn)輸和儲(chǔ)存，但具有揮發(fā)性質(zhì)的乙醇既不能做成凍干品，也無法滿足上下游試劑凍干品在微流控組裝過程中的極干燥環(huán)境要求[3]。因此，乙醇無法用于微流控產(chǎn)品。近年來，研究者們采用基于水相-氣相-油相結(jié)構(gòu)的表面張力輔助的不混溶相過濾（immisciblefiltration assisted by surface tension，IFAST）體系來構(gòu)建微流控核酸提取和檢測(cè)系統(tǒng)，洗滌液通常選用油類化合物[7]。HU等[8-9]構(gòu)建了IFAST體系，從全血和血漿樣本中迅速分離游離DNA（cell-free DNA，cfDNA），整個(gè)提取過程不超過15 min，后續(xù)又構(gòu)建了基于IFAST和LAMP的一體化核酸芯片，可在60 min內(nèi)完成cfDNA的提取和檢測(cè)，證實(shí)了油性洗滌液在微流控平臺(tái)上的潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)5種長鏈醇類和3種油類洗滌液在微流控平臺(tái)上的應(yīng)用進(jìn)行了分析，并針對(duì)病原體的基因組分DNA和RNA兩大類的特點(diǎn)，探討了DNA、RNA共提取的方法，以便在微流控平臺(tái)上開展多種病原體的聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果顯示，8種洗滌液中，二甲基硅油和FC-40對(duì)DNA和RNA的提取性能與70%乙醇相比差異較小，在DNA和RNA模板量為102～105拷貝/μL時(shí)均能檢出，而其他6種洗滌液的提取效率相對(duì)較低，尤其是對(duì)于低濃度核酸模板而言，效率更低?？紤]到微流控技術(shù)平臺(tái)無法模擬手工移液器的吸棄操作，難以實(shí)現(xiàn)洗滌液的完全去除，本研究特別檢測(cè)了各種油性洗滌液殘留對(duì)后續(xù)擴(kuò)增的影響，其中二甲基硅油和FC-40對(duì)PCR和RT-PCR均無抑制作用，而其他6種洗滌液對(duì)下游擴(kuò)增反應(yīng)均有程度不同的抑制。由此可見，二甲基硅油和FC-40可取代70%乙醇，作為核酸提取的洗滌液。

針對(duì)微流控的特點(diǎn)，本研究將吸附液、洗脫液制成干式試劑，復(fù)溶后結(jié)合二甲基硅油和FC-40洗滌液，其核酸提取性能與濕式試劑無差異，說明油類洗滌液配合干式試劑適用于微流控平臺(tái)。另外，油類洗滌液黏度較高，為探索適合微流控平臺(tái)的洗滌混勻方式，本研究對(duì)渦旋混勻、移液槍混勻、顛倒混勻3種不同的混勻方式進(jìn)行了探討，結(jié)果顯示，無論采用哪種混勻方式，以二甲基硅油、FC-40為洗滌液提取103拷貝/μLDNA和RNA模板的Ct值與70%乙醇比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。說明以二甲基硅油、FC-40為洗滌液時(shí)，不同的混勻方式對(duì)核酸提取無影響。

本研究結(jié)果還顯示，以二甲基硅油和FC-40為洗滌液，提取Mp模擬臨床樣本DNA后的Ct值與以70%乙醇為洗滌液時(shí)的Ct值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；且與商品化核酸提取試劑盒A的DNA提取性能基本一致（P>0.05），提示油類洗滌液可用于臨床樣本的核酸提取。

綜上所述，以二甲基硅油和FC-40為洗滌液，采用磁珠法對(duì)DNA和RNA進(jìn)行共提取的效率與傳統(tǒng)70%乙醇洗滌液等效，且具有不易揮發(fā)、安全的優(yōu)點(diǎn)，適用于微流控產(chǎn)品的開發(fā)和臨床應(yīng)用。