王 珊， 徐旻一， 王 微， 蔣明明， 盧 培， 熊仲波， 王 蕾

（1.汶上縣人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272500；2.上海市第八人民醫(yī)院 上海市第六人民醫(yī)院徐匯分院檢驗(yàn)科，上海 200235）

高血壓伴高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥是缺血性心血管事件和腦卒中事件的主要誘發(fā)因素[1]。臨床將Hcy>10 μmol/L的高血壓定義為H型高血壓[2]。目前，我國高血壓患者中H型高血壓所占比例呈逐年升高趨勢[3]，因此監(jiān)測Hcy水平對高血壓患者具有重要意義。Hcy水平升高的原因主要為攝入增加和代謝障礙。葉酸是能有效降低Hcy水平的藥物之一[4]。葉酸必須通過亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，為Hcy代謝提供甲基供體[5]。MTHFR基因遺傳缺陷或變異會影響葉酸活化，進(jìn)而造成Hcy代謝受阻，導(dǎo)致Hcy水平升高[6]。C677T突變是MTHFR基因最常見的突變位點(diǎn)，可導(dǎo)致MTHFR活性顯著降低[7]。MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性在不同種族、不同地域之間存在明顯差異，歐洲人群C677T突變率為22%～44%，日本人群約為34%，我國漢族人群約為50%[8]。本研究旨在分析MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與Hcy水平的關(guān)系，以及C677T位點(diǎn)多態(tài)性對H型高血壓葉酸治療的影響，為H型高血壓個性化治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年4月—2019年3月上海市第八人民醫(yī)院收治的高血壓患者215例，其中男126例、女89例，年齡36～80歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）高血壓依據(jù)《中國高血壓防治指南2010》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診；（2）近3個月內(nèi)未服用葉酸或B族維生素；（3）無腫瘤及心、肝、腎、腦等器官的嚴(yán)重疾病；（4）女性未處于妊娠期或哺乳期。根據(jù)患者血清Hcy水平，將血清Hcy>10 μmol/L的患者歸入H型高血壓組（143例），將血清Hcy≤10 μmol/L的患者歸入非H型高血壓組（72例）。根據(jù)《中國高血壓防治指南2010》[9]中的分級標(biāo)準(zhǔn)，將215例高血壓患者分為Ⅰ級高血壓組[收縮壓為18.6～21.1 kPa和/或舒張壓為12.0～13.2 kPa]（48例）、Ⅱ級高血壓組[收縮壓為21.3～23.8 kPa和/或舒張壓為13.3～14.5 kPa]（77例）、Ⅲ級高血壓組[收縮壓≥23.9 kPa和/或舒張壓≥14.6 kPa]（90例）。另選取上海市第八人民醫(yī)院健康體檢者113名作為正常對照組，其中男63名、女50名，年齡40～77歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：無冠心病、糖尿病、高血壓病史，肝、腎功能均正常。各組間年齡、性別及高血壓病程等一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)上海市第八人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集所有對象清晨空腹10 h的靜脈血5 mL，其中3 mL置于促凝管中，2 000×g離心10 min，分離血清，用于檢測Hcy；另2 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，用于檢測MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性。

1.2.2 血清Hcy水平測定 采用循環(huán)酶法檢測Hcy，試劑盒購自英國Axis-Shield公司，檢測儀器為AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2.3 MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性測定 采用氯化銨裂解法提取外周血白細(xì)胞，置于PHARM-GENESNP分析樣品保存液（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）中，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訮HARM-GENE200 SNP分析樣品處理液（北京華夏時代基因科技發(fā)展有限公司）為基因探針，采用數(shù)字熒光分子雜交法檢測MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性。檢測儀器為TL998A基因擴(kuò)增熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）。

1.2.4 葉酸治療后的血清Hcy測定 對H型高血壓患者給予口服馬來酸依那普利葉酸片（每片含馬來酸依那普利10 mg、葉酸0.8 mg，深圳奧薩醫(yī)藥有限公司），1片/次，每日2次，連續(xù)服用6個月，測定患者口服葉酸6個月后血清Hcy水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用基因頻率法計算等位基因頻率，采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性分析

Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，所有對象的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（χ2=1.07，P>0.05），具有群體代表性。

2.2 H型高血壓組、非H型高血壓組及正常對照組血清Hcy水平比較

H型高血壓組血清H c y水平為2 1.3（16.3～27.5）μmol/L，顯著高于非H型高血壓組[8.2（4.7～9.6）μmol/L]和正常對照組[8.4（4.2～15.7）μmol/L]（P<0.01）。非H型高血壓組與正常對照組血清Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級高血壓患者血清Hcy水平分別為16.9（12.1～25.8）、20.1（15.1～28.1）和26.8（21.3～30.7）μmol/L。Ⅲ級高血壓組血清Hcy水平顯著高于Ⅰ級高血壓組和Ⅱ級高血壓組（P<0.05）。Ⅰ級高血壓組、Ⅱ級高血壓組之間血清Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 H型高血壓組、非H型高血壓組和正常對照組MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

215例高血壓患者中，CC基因型65例（30.2%）、CT基因型100例（46.5%）、TT基因型50例（23.3%）。H型高血壓組CC、TT基因型頻率及C、T等位基因頻率與非H型高血壓組、正常對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。H型高血壓組CT基因型所占比例最高，CC基因型所占比例最低。正常對照組TT基因型所占比例最低，CC基因型所占比例最高。見表1。

表1 H型高血壓組、非H型高血壓組及正常對照組之間MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

2.4 Ⅰ級高血壓組、Ⅱ級高血壓組、Ⅲ級高血壓組之間MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

Ⅱ級、Ⅲ級高血壓組TT基因型頻率及T等位基因頻率均顯著高于Ⅰ級高血壓組（P<0.05）。見表2。

表2 Ⅰ級高血壓組、Ⅱ級高血壓組、Ⅲ級高血壓組之間MTHFR C677T位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率比較

2.5 不同基因型H型高血壓患者治療前Hcy水平比較

TT基因型H型高血壓患者治療前血清Hcy水平為26.2（20.4～33.5）μmol/L，顯著高于CC基因型患者[17.3（13.5～24.5）μmol/L]和CT基因型患者[18.8（14.9～25.0）μmol/L]（P<0.01）。CC基因型患者與CT基因型患者之間治療前血清Hcy水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.6 不同基因型H型高血壓患者治療前后血清Hcy水平比較

不同基因型的H型高血壓患者采用葉酸治療后血清Hcy水平均低于治療前（P<0.05）。TT基因型的H型高血壓患者葉酸治療前、后血清Hcy水平均顯著高于CT基因型患者和CC基因型患者（P<0.01）。見表3。

表3 不同基因型H型高血壓患者葉酸治療前、后血清Hcy水平比較

3 討論

有研究結(jié)果顯示，高血壓和高Hcy血癥對促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生具有協(xié)同作用，伴有高Hcy血癥的高血壓患者發(fā)生心腦血管疾病的風(fēng)險顯著高于無高Hcy血癥的高血壓患者[10]。Hcy水平受環(huán)境因素和遺傳因素的雙重影響，代謝過程中酶功能障礙或維生素缺乏均可導(dǎo)致血漿Hcy升高[7]。增加維生素B6、維生素B12和葉酸的攝入，可以降低血漿Hcy水平，因此葉酸被相關(guān)指南[9，11]列為降低Hcy的推薦藥物。MTHFR是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，催化5，10亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，而5-甲基四氫葉酸可作為細(xì)胞內(nèi)的甲基供體，在甲硫氨酸合成酶和維生素B12的催化下，使血液中Hcy發(fā)生甲基化，生成甲硫氨酸，從而維持血液中Hcy的水平[12-13]。MTHFR基因C677T位點(diǎn)突變會影響MTHFR的活性，使Hcy代謝發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致高Hcy血癥。

本研究結(jié)果顯示，H型高血壓組MTHFR C677T位點(diǎn)TT基因型（純合突變）頻率明顯高于非H型高血壓組（P<0.05），提示MTHFR C677T位點(diǎn)TT基因型可能與H型高血壓有關(guān)。理論上雜合變異（CT基因型）的MTHFR活性只有正常酶活性的65%[7]，然而本研究結(jié)果卻未提示CT基因型與高Hcy血癥之間有關(guān)聯(lián)，這可能是由于Hcy水平升高并非都是由MTHFR基因變異決定的，飲食、環(huán)境等因素也會影響Hcy水平。

本研究根據(jù)《中國高血壓防治指南2010》[9]將高血壓患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級，結(jié)果顯示，Ⅲ級高血壓患者血清Hcy水平顯著高于Ⅱ級和Ⅰ級高血壓患者（P<0.05）。這提示血清Hcy水平可能與高血壓的嚴(yán)重程度相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，Ⅱ、Ⅲ級高血壓患者的TT基因型頻率明顯高于Ⅰ級高血壓患者（P<0.05），且Ⅱ、Ⅲ級高血壓患者T等位基因頻率顯著高于Ⅰ級高血壓患者（P<0.05），這提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)的TT基因型（純合突變）發(fā)生頻率可能與高血壓的嚴(yán)重程度有一定的關(guān)聯(lián)性。

WANG等[14]發(fā)現(xiàn)，C677T位點(diǎn)的純合突變會導(dǎo)致患者的MTHFR活性顯著降低，使葉酸無法有效發(fā)揮作用。本研究結(jié)果也顯示，MTHFR基因C677T位點(diǎn)TT基因型患者葉酸治療前、后的血清Hcy水平均顯著高于CT基因型患者和CC基因型患者（P<0.01）。提示MTHFR基因C677T位點(diǎn)TT基因型（純合突變）與Hcy水平密切相關(guān)，C677T位點(diǎn)基因多態(tài)性亦可能與高血壓的嚴(yán)重程度有關(guān)。另外，高Hcy血癥的發(fā)生與葉酸缺乏密切相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示，不同MTHFR基因C677T位點(diǎn)基因型的H型高血壓患者采用葉酸治療后血清Hcy水平均低于治療前（P<0.05），提示葉酸能有效降低H型高血壓患者的Hcy水平；但TT基因型的H型高血壓患者血清Hcy水平雖較治療前有所下降，卻仍處于較高的水平。究其原因，Hcy代謝是多途徑、多因素參與的過程，Hcy水平不僅受機(jī)體內(nèi)葉酸水平的影響，還與生活方式、營養(yǎng)因素和遺傳因素等有關(guān)。MTHFR基因的多態(tài)性影響著不同個體對葉酸的需求量。本研究結(jié)果有助于臨床根據(jù)MTHFR基因多態(tài)性檢測結(jié)果對H型高血壓患者進(jìn)行個體化治療，從而達(dá)到最佳療效。

綜上所述，MTHFR基因C677T位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓的嚴(yán)重程度有關(guān)。檢測MTHFR C677T位點(diǎn)變異對H型高血壓個體化治療療效評估有較高的臨床價值。